沉淀分離技術(shù)

沉淀分離技術(shù)第一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日鹽析有機(jī)溶劑沉析等電點(diǎn)沉析有機(jī)聚合物沉析其他沉析技術(shù)第二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日一、鹽析原理溶液加入高濃度中性鹽后，鹽離子與生物分子表面的帶相反電荷的離子基團(tuán)結(jié)合，中和了生物分子表面的電荷，降低了生物分子與水分子之間的相互作用，生物分子表面水化膜逐漸被破壞，當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定的限度時(shí)，生物分子之間的排斥力降到很小，此時(shí)生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，從而形成沉淀從溶液中析出。產(chǎn)生鹽析的另一個(gè)原因是大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，使生物分子脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用，使其沉淀析出。第三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日影響鹽析的因素（一）鹽離子濃度在低鹽濃度時(shí)，鹽離子能增加生物分子表面電荷，使生物分子水合作用增強(qiáng)，具有促進(jìn)溶解的作用，稱(chēng)鹽溶現(xiàn)象。當(dāng)鹽濃度達(dá)一定值后,鹽濃度升高，生物分子溶解度不斷降低,產(chǎn)生了鹽析作用,不同的生物分子，“鹽溶”與“鹽析”的分界值不同。第四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（二）生物分子種類(lèi)生物分子的分子結(jié)構(gòu)不同，其分子表面親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)不相同，不同生物分子產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象所需中性鹽的濃度（離子強(qiáng)度）亦不同。（三）生物分子濃度溶液中生物分子的濃度對(duì)鹽析的效果有很大的影響，要得到理想的沉析效果，必須將生物分子的濃度控制在一定的范圍內(nèi)。一般對(duì)于蛋白質(zhì)溶液，其濃度為2%～3%比較合適。第五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（四）pH值在鹽析時(shí)，如果要沉析某一成分，應(yīng)將溶液的pH值調(diào)整到該成分的等電點(diǎn)，如果希望某一成分保留在溶液中不析出，則應(yīng)使溶液的pH值偏離該成分的等電點(diǎn)。（五）溫度多數(shù)物質(zhì)的溶解度會(huì)受溫度變化的影響。

第六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日鹽析的操作與應(yīng)用（一）鹽析的操作1、鹽的處理硫酸銨使用時(shí)要求純度較高，生產(chǎn)時(shí)為降低成本，一般選用化學(xué)純的硫酸銨，在使用前應(yīng)進(jìn)行預(yù)處理，可通過(guò)化學(xué)法將重金屬除去（如通入H2S后過(guò)濾），再將硫酸銨重結(jié)晶備用。2、加鹽的方法（1）直接加入固體硫酸銨法（2）加入飽和硫酸銨溶液法第七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日3、鹽析操作注意事項(xiàng)（1）鹽析反應(yīng)完全需要一定時(shí)間，一般硫酸銨全部加完后，應(yīng)放置30min以上才可進(jìn)行固-液分離。（2）經(jīng)過(guò)一次分級(jí)得到的鹽析沉淀，能否進(jìn)行第二次鹽析要靠試驗(yàn)確定。（3）鹽析操作時(shí)加入鹽的純度、加量、加入方法、攪拌的速度、溫度及pH等參數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制。第八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（4）鹽析時(shí)生物分子濃度要合適，應(yīng)充分考慮共沉及稀釋后收率、鹽量和固-液分離等問(wèn)題。一般低濃度硫酸銨可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過(guò)濾方法，因?yàn)楦邼舛攘蛩徜@密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來(lái)需要較高的離心速率和較長(zhǎng)的離心時(shí)間。

（5）鹽析后溶液應(yīng)進(jìn)行脫鹽，常用的辦法有透析、凝膠過(guò)濾及超濾等。

第九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（二）鹽析的主要應(yīng)用

鹽析是最早使用的生化分離技術(shù)之一，由于易產(chǎn)生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段完全能達(dá)到很好的分離效果。由于成本低，操作安全簡(jiǎn)單，對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有很好的穩(wěn)定作用，常用于蛋白質(zhì)、酶、多肽、多糖、核酸等物質(zhì)的分離純化。

第十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日二、有機(jī)溶劑沉析原理（一）親水性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，使溶質(zhì)分子周?chē)乃瘜幼儽?，?dǎo)致脫水而相互聚集析出，也就是降低了溶質(zhì)的溶解度。（二）有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，加入有機(jī)溶劑后，整個(gè)溶液的介電常數(shù)降低，帶電的溶質(zhì)分子之間庫(kù)侖引力增強(qiáng)，使溶質(zhì)分子相互吸引而聚集。第十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日影響有機(jī)溶劑沉析的因素（一）溫度大多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，一般在0℃以下，操作時(shí)要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑必須緩慢，并不斷攪拌以免局部濃度過(guò)濃。溫度越低，得到的生物活性物質(zhì)越多，而且可以減少有機(jī)溶劑的揮發(fā)。第十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（二）生物樣品的濃度與鹽析相似，樣品濃度低時(shí)增加有機(jī)溶劑投入量和損耗，降低了溶質(zhì)回收率，易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉的作用小，有利于提高分離效果。反之，對(duì)于高濃度的生物樣品，節(jié)省了有機(jī)溶劑，減少了變性的危險(xiǎn)，但共沉作用大，分離效果下降。一般認(rèn)為，對(duì)于蛋白質(zhì)溶液0.5%～2%起始濃度較合適,對(duì)于粘多糖以1%～2%為起始濃度為宜。第十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（三）pH有機(jī)溶劑沉析時(shí)適宜的pH，要選擇在樣品穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的pH，通常是選在等電點(diǎn)附近，以提高該沉析的分辨能力。但應(yīng)注意的是有少數(shù)生物分子在等電點(diǎn)附近不穩(wěn)定，影響其活性；同時(shí)盡量避免目的物與雜質(zhì)帶相反電荷而加劇共沉現(xiàn)象的發(fā)生。第十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（四）離子強(qiáng)度在有機(jī)溶劑和水的混合液中，當(dāng)離子強(qiáng)度很小，物質(zhì)不能沉析時(shí)，補(bǔ)加少量電解質(zhì)即可解決。鹽的濃度太大(0.1～0.2mol／L以上)，就需大量的有機(jī)溶劑來(lái)沉析，并可能使部分鹽在加入有機(jī)溶劑后析出。同時(shí)鹽的離子強(qiáng)度達(dá)一定程度時(shí)，還會(huì)增加蛋白質(zhì)或酶在有機(jī)溶劑中的溶解度。所以一般離子強(qiáng)度在0.05或稍低為好，既能使沉析迅速形成，又能對(duì)蛋白質(zhì)或酶起一定的保護(hù)作用，防止變性。第十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（五）金屬離子在用有機(jī)溶劑沉析生物高分子時(shí)還應(yīng)注意到某些金屬離子的助沉作用，一些金屬離子如Zn2+、Ca2+等可與某些呈陰離子狀態(tài)的生物高分子形成復(fù)合物。這種復(fù)合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉析形成，并降低有機(jī)溶劑的耗量，0.005～0.02mol／L的Zn2+可使有機(jī)溶劑用量減少l／3至1／2,使用時(shí)要避免會(huì)與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子(如磷酸根)的存在。

第十六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日有機(jī)溶劑沉析的應(yīng)用（一）有機(jī)溶劑沉析的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析高,即一種生物分子或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉析；沉析不用脫鹽，過(guò)濾比較容易。缺點(diǎn)：是某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。

第十七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（二）應(yīng)用

有機(jī)溶劑沉析技術(shù)經(jīng)常用于蛋白質(zhì)、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分離。使用時(shí)先要選擇合適的有機(jī)劑，然后注意調(diào)控樣品的濃度、溫度、pH和離子強(qiáng)度，使之達(dá)到最佳的分離效果。沉析所得的固體樣品，如果不是立即溶解進(jìn)行下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉析物，減少其中有機(jī)溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫除有機(jī)溶劑，以免影響樣品的生物活性第十八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日三、等電點(diǎn)沉析等電點(diǎn)沉析原理調(diào)節(jié)兩性生化物質(zhì)溶液的pH值，以達(dá)到某一生化物質(zhì)的等電點(diǎn)，使其從溶液中沉淀析出而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)稱(chēng)為等電點(diǎn)沉析技術(shù)。等電點(diǎn)(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點(diǎn)的凈電荷為零時(shí)介質(zhì)的pH值,溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來(lái)，沉淀析出，此時(shí)溶質(zhì)的溶解度最低第十九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日等電點(diǎn)沉析的注意事項(xiàng)（一）等電點(diǎn)的改變（二）目的物的穩(wěn)定性（三）鹽溶作用（四）pH的調(diào)節(jié)

第二十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日等電點(diǎn)沉析的應(yīng)用（一）在生化產(chǎn)品的分離純化過(guò)程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點(diǎn)的特性來(lái)進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。（二）等電點(diǎn)沉析只適用于水化程度不大，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(diǎn)(pH=5.4)附近,難溶于水，能產(chǎn)生沉析。第二十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日有機(jī)聚合物沉析

有機(jī)聚合物沉析原理利用生物分子與某些有機(jī)聚合物形成沉淀而析出的分離技術(shù)稱(chēng)為有機(jī)聚合物沉析。非離子型多聚物沉析的機(jī)理離子型多聚物沉析的機(jī)理第二十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日有機(jī)聚合物的種類(lèi)（一）水溶性非離子型聚合物（二）離子型表面活性劑聚合物（三）離子型多聚物

第二十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日有機(jī)聚合物沉析的應(yīng)用非離子型聚合物最早在20世紀(jì)60年代時(shí)被用來(lái)沉析分離血纖維蛋白原、免疫球蛋白，和沉析一些細(xì)菌與病毒，近年來(lái)廣泛用于核酸和酶的分離純化。第二十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日其他沉析技術(shù)一、金屬離子沉析（一）許多生物活性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸、多肽、抗生素和有機(jī)酸等）能與金屬離子形成難溶性的復(fù)合物而沉析。（二）金屬離子沉析生物活性物質(zhì)已有廣泛的應(yīng)用，如鋅鹽可用于沉淀?xiàng)U菌肽和胰島素等，CaCO3用來(lái)沉析乳酸、枸櫞酸、人血清蛋白等。此外，該技術(shù)還能用來(lái)除去雜質(zhì)。第二十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日二、有機(jī)酸沉析含氮有機(jī)酸如苦味酸和鞣酸等能夠與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。但這些有機(jī)酸與蛋白質(zhì)形成鹽復(fù)合物沉析時(shí)，常常發(fā)生不可逆的沉析反應(yīng)。工業(yè)