蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)

主要內(nèi)容第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑(P88-94自學(xué))第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)當(dāng)前1頁，總共61頁。3/17/20231

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑基因突變技術(shù)是通過在基因水平上對其編碼的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，在其表達(dá)后用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種方法。分類：位點特異性突變基因突變技術(shù)（按特點劃分）隨機突變

當(dāng)前2頁，總共61頁。3/17/20232

1)通過寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變位點特異性突變2)盒式突變或片段取代突變

3)以雙鏈DNA為模板，利用PCR技術(shù)進(jìn)行的基因突變可以這樣說，PCR技術(shù)的出現(xiàn)為基因的突變，基因的剪接開辟了一條極其有效、極其快捷的道路。當(dāng)然無論哪種方法都可以在為蛋白質(zhì)編碼的基因序列上產(chǎn)生插入、缺失、取代等突變。當(dāng)前3頁，總共61頁。3/17/20233

1．編碼基因的專一性位點突變

定義：專一性位點突變又稱特異性位點突變。這類突變都是在含有突變序列的寡核苷引物介導(dǎo)下進(jìn)行的，因此又稱為寡核苷酸介導(dǎo)的位點特異性突變。這種突變的方法從問世至今不斷更新，特別是PCR技術(shù)出現(xiàn)后變得更高效。(1)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法當(dāng)前4頁，總共61頁。3/17/20234(1)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素DNA模板的制備

對于單鏈DNA模板一定要高純度，即使少量的RNA分子都會影響突變的特異性。雙鏈DNA：一般制備DNA質(zhì)粒的方法均可單鏈DNA：通過M13噬菌體或噬菌粒來制備當(dāng)前5頁，總共61頁。3/17/20235②核甘酸突變引物的設(shè)計和選擇必須與模板鏈上的目標(biāo)DNA序列有必要的互補區(qū)足夠長，以便與目標(biāo)DNA序列退火突變引物應(yīng)盡可能避免形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)的回文序列、重復(fù)序列或自身互補序列突變引物要特異，不能與目標(biāo)DNA中突變位置以外的DNA形成非特異性的雜交混合體當(dāng)前6頁，總共61頁。3/17/20236例子：將NCBI數(shù)據(jù)庫中的MADS基因編碼蛋白質(zhì)的“KKACSDSSA”中的C（Cys）定點突變?yōu)锳（Arg）。當(dāng)前7頁，總共61頁。3/17/20237當(dāng)前8頁，總共61頁。3/17/20238當(dāng)前9頁，總共61頁。3/17/20239當(dāng)前10頁，總共61頁。3/17/202310當(dāng)前11頁，總共61頁。3/17/202311③核甘酸突變引物與模板DNA的退火和引物延伸條件對于突變引物與模板DNA的比率一般是雙引物與模板之間的摩爾比在10～50：1之間。退火保證引物與模板形成穩(wěn)定的雜交體。原則：退火溫度為理論預(yù)測的Tm值以上20℃，然后再慢慢冷卻至較低溫度，形成雙鏈。引物延伸加入延伸所需的dNTP、ATP、DNA聚合酶、DNA連接酶等。在適當(dāng)溫度下進(jìn)行2—15h的連接。當(dāng)前12頁，總共61頁。3/17/202312④DNA聚合酶的選擇T4DNA聚合酶T7DNA聚合酶Klenow酶在單引物的延伸反應(yīng)中，避免使用不當(dāng)?shù)拿敢鹨镏脫Q，導(dǎo)致突變效率降低。當(dāng)前13頁，總共61頁。3/17/202313⑤dNTP（脫氧核苷三磷酸）對立體DNA合成的影響dNTP純度要高dCTP氧化脫氨可以產(chǎn)生微量dUTP，當(dāng)多核苷酸中攙入UMP時，受體菌中的尿嘧啶-N-糖基化酶可在U的位置切斷DNA鏈，而細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶能夠產(chǎn)生切口平移，從而降低突變體的產(chǎn)率。當(dāng)前14頁，總共61頁。3/17/202314⑥受體細(xì)胞對突變體產(chǎn)率的影響大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的幾個錯配修復(fù)系統(tǒng)解決方案：采用錯配修復(fù)系統(tǒng)缺失的系統(tǒng)菌株作為受體菌。當(dāng)用M13作為克隆載體時，M13可能會出現(xiàn)不對稱復(fù)制，如果突變鏈復(fù)制率較低就影響試驗結(jié)果當(dāng)前15頁，總共61頁。3/17/202315(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

①Kunkel突變法②基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法③基于去除特定限制酶切位點的突變④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點突變當(dāng)前16頁，總共61頁。3/17/202316①Kunkel突變法Kunkel1985年建立的方法：當(dāng)前17頁，總共61頁。3/17/202317具體步驟：將待突變的基因克隆入M13DNA載體上，導(dǎo)入具有dUTP酶（dut）和N-尿嘧啶脫糖苷酶（ung）雙缺陷的大腸桿菌（dut-，ung-）菌株中。Dut缺陷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)dUTP水平上升，并在DNA復(fù)制時，部分取代dTTP進(jìn)入DNA新生鏈中。又由于ung缺陷使摻入DNA的dUTP殘基不能除去。由這種大腸桿菌菌株產(chǎn)生的M13單鏈DNA大約有1%的T被U所取代，然后進(jìn)行DNA定點突變。雙鏈DNA導(dǎo)入正常的大腸桿菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA鏈上的尿嘧啶堿基。結(jié)果原來的M13模板鏈被降解，只有突變鏈因不含U，被保留下來。這種方法產(chǎn)生的M13噬菌體中含有突變DNA的比例大大增加。當(dāng)前18頁，總共61頁。3/17/202318②基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法當(dāng)前19頁，總共61頁。3/17/202319③基于去除特定限制酶切位點的突變當(dāng)前20頁，總共61頁。3/17/202320當(dāng)前21頁，總共61頁。3/17/202321④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點突變5’端或3’端區(qū)產(chǎn)生突變——直接PCR中心區(qū)突變——重疊延伸（overlapextension）

新概念：GeneSOEing:即通過重疊延伸進(jìn)行剪接（splicingbyoverlapextension）,也就是說通過重組延伸方法將不同的基因進(jìn)行剪接和組合在一起。當(dāng)前22頁，總共61頁。3/17/202322DNA片段的剪切當(dāng)前23頁，總共61頁。3/17/202323取代突變當(dāng)前24頁，總共61頁。3/17/202324插入突變當(dāng)前25頁，總共61頁。3/17/202325缺失突變當(dāng)前26頁，總共61頁。3/17/2023262．區(qū)域性定向突變基因工程技術(shù)不但可使基因產(chǎn)生特異性位點突變，也可以產(chǎn)生區(qū)域性的突變。常用的方法如盒式突變法(cassettemutagenesis)，又稱片段取代法(DNAfragmentreplacement)。這一方法的要點是利用目標(biāo)基因中所具有的適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點，用具有任何長度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段來置換或取代目標(biāo)基因上的一段DNA序列。當(dāng)前27頁，總共61頁。3/17/202327研究目的通過改變幾個氨基酸序列來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-功能之間的關(guān)系，也可以通過盒式突變法產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)。在這個嵌合蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)分子中的整個結(jié)構(gòu)域都可以用完全不同的氨基酸序列來置換。

盒式突變最主要的用途是產(chǎn)生各種特異性的突變或突變家族，在這些突變體中各種不同的序列被集中在目標(biāo)基因的一個特定區(qū)域，從而為研究蛋白質(zhì)特定結(jié)構(gòu)區(qū)段或特定結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能提供了一個切實可行的方法。當(dāng)前28頁，總共61頁。3/17/202328二、基因融合和基因剪接1．利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由2．基因融合的策略與蛋白質(zhì)分子嵌合體3．蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接當(dāng)前29頁，總共61頁。3/17/2023291．利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解通過與特異蛋白質(zhì)或特異的結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白，利于快速回收、純化融合蛋白可以體外切割去除融合部分，可以獲得天然蛋白通過與特定的蛋白質(zhì)形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體基因融合是對基因進(jìn)行改造的手段，廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的研究當(dāng)前30頁，總共61頁。3/17/2023302．1基因融合的策略將重組基因直接剪接于適當(dāng)?shù)男盘栯闹髮⑼庠椿虮旧戆撮喿x框架自我融合。對一些小肽的穩(wěn)定表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的活性非常重要目標(biāo)蛋白在與其融合的蛋白伙伴序列的C端或N端融合當(dāng)前31頁，總共61頁。3/17/202331分泌－親和融合。即：信號肽－融合蛋白－目標(biāo)基因雙親和融合法。即將目標(biāo)基因與兩個不同配基有特異親和的異源或載體蛋白融合分泌－插入融合法。此法是將目標(biāo)基因插入到信號肽序列和一插入序列之間，此插入序列是一種插入到細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的蛋白編碼設(shè)計目的：用以將受體或抗原定位于細(xì)胞的外表面或裝配成融合蛋白進(jìn)入類病毒顆粒，利于開發(fā)疫苗，或產(chǎn)生具有免疫原的復(fù)合物2．1基因融合的策略當(dāng)前32頁，總共61頁。3/17/2023322.2產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的策略通過限制性內(nèi)切酶位點連接條件：兩個蛋白質(zhì)之間有相同的限制性內(nèi)切酶位點通過缺失突變的方法連接條件：兩個蛋白質(zhì)之間有相同的額外的堿基序列通過PCR雙側(cè)重疊延伸法該法可以在不需要分子間具有相容的限制性內(nèi)切酶位點，將兩個編碼不同蛋白質(zhì)的DNA分子重組，形成DNA分子嵌合體當(dāng)前33頁，總共61頁。3/17/202333當(dāng)前34頁，總共61頁。3/17/2023343．蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接1990年Saccharomydescerevisiae發(fā)現(xiàn)在腺苷三磷酸核苷酸酶中蛋白質(zhì)會發(fā)生自我剪接（proteinsplicing），從而首次發(fā)現(xiàn)第一個蛋白質(zhì)內(nèi)含子——SceVMA蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是蛋白質(zhì)中的一段多肽鏈,它靠自我剪切的方式從前體蛋白中分離出來,而兩端的外顯子以肽鍵的方式相連當(dāng)前35頁，總共61頁。3/17/202335基因融合的用途上述這些基因融合策略，主要是有利于：外源基因的表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化以及細(xì)胞定位

作為蛋白質(zhì)分子改造可以借用這些策略對蛋白質(zhì)分子中的特定序列、結(jié)構(gòu)元件乃至結(jié)構(gòu)域通過基因剪接來進(jìn)行操作。當(dāng)前36頁，總共61頁。3/17/202336第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在哺乳類動物細(xì)胞中的表達(dá)當(dāng)前37頁，總共61頁。3/17/202337一、大腸桿菌中表達(dá)體系的優(yōu)點大腸桿菌(E.coli)表達(dá)體系是目前應(yīng)用最廣的一個外源基因表達(dá)體系，是外源基因表達(dá)的首選體系。利用大腸桿菌作為表達(dá)體系的優(yōu)點：1）遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚；2）容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵；3）外源基因經(jīng)?？梢赃_(dá)到高效表達(dá)。當(dāng)前38頁，總共61頁。3/17/202338大腸桿菌表達(dá)體系的缺點大腸桿菌系統(tǒng)最大的不足之處是：（1）不能進(jìn)行典型真核細(xì)胞所具有的復(fù)雜的翻譯后修飾，如糖基化、烷基化、磷酸化、特異性的蛋白水解加工等；（2）廣泛二硫鍵的形成以及外源蛋白質(zhì)組裝成多亞基復(fù)合體的能力也受到限制。（3）外源基因產(chǎn)物在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)易形成不溶性的包涵體；

（4）而當(dāng)真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時，作為起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白質(zhì)的N末端。最后，由于真核mRNA的結(jié)構(gòu)特性以及密碼子使用頻率與大腸桿菌本身的差異，當(dāng)用真核mRNA的序列直接在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)時，（5）有時不能得到足夠的產(chǎn)物。當(dāng)前39頁，總共61頁。3/17/202339大腸桿菌表達(dá)體系的應(yīng)用當(dāng)外源蛋白質(zhì)的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子內(nèi)的二硫鍵少于3～4個，以及不需要翻譯后修飾而能保持其生物活性的蛋白質(zhì)，大多可以利用大腸桿菌系統(tǒng)得到滿意的結(jié)果。當(dāng)前40頁，總共61頁。3/17/2023401．表達(dá)載體的一般特點(1)復(fù)制起始點(2)選擇性基因(3)強的、可誘導(dǎo)的啟動子(4)強的轉(zhuǎn)錄終止序列(5)核糖體結(jié)合位點(6)合適的多克隆位點當(dāng)前41頁，總共61頁。3/17/202341(1)復(fù)制起始點絕大多數(shù)載體利用pBR322或pUC質(zhì)粒來源的復(fù)制起始點（如，pET28系列）復(fù)制起始點決定了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)pBR322或pUC質(zhì)粒來源的質(zhì)?？杀３?0——50個拷貝數(shù)和150——200個拷貝數(shù)當(dāng)前42頁，總共61頁。3/17/202342(2)選擇性基因載體上要含有至少一個選擇性基因作用：1）保證對轉(zhuǎn)化體的篩選2）保證在培養(yǎng)過程中受體細(xì)胞質(zhì)粒不丟失種類：當(dāng)前43頁，總共61頁。3/17/202343(3)強的、可誘導(dǎo)的啟動子原核細(xì)胞的啟動子包括了RNA聚合酶的識別位點和結(jié)合位點啟動子序列通常包含了－10區(qū)（TATAAT）和－35區(qū)（TTGACA）常用的種類：LacUV5、trp、tac、trc以及T7啟動子RNA聚合酶結(jié)合位點RNA聚合酶識別位點當(dāng)前44頁，總共61頁。3/17/202344(4)強的轉(zhuǎn)錄終止序列為使目標(biāo)基因有效的轉(zhuǎn)錄，需要滿足兩個條件：轉(zhuǎn)錄終止序列抗轉(zhuǎn)錄終止序列減少不必需的轉(zhuǎn)錄通過復(fù)制起始位點，其作用可以幫助穩(wěn)定mRNA，增加mRNA的半衰期保證目標(biāo)基因完全被轉(zhuǎn)錄當(dāng)前45頁，總共61頁。3/17/202345(5)核糖體結(jié)合位點位置：位于啟動子下游，翻譯起始密碼ATG的上游核糖體結(jié)合位點——SD序列，對原核細(xì)胞mRNA翻譯起始非常關(guān)鍵當(dāng)前46頁，總共61頁。3/17/202346(6)合適的多克隆位點將目標(biāo)基因插入到表達(dá)載體上用于構(gòu)建或改造載體當(dāng)前47頁，總共61頁。3/17/2023472．與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素(1)有效的轉(zhuǎn)錄起始(2)有效的翻譯(3)蛋白質(zhì)水解作用(4)蛋白質(zhì)的外泌當(dāng)前48頁，總共61頁。3/17/202348(1)有效的轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的主要限速步驟高效表達(dá)的載體包含：1）啟動子的強弱2）調(diào)控序列當(dāng)前49頁，總共61頁。3/17/202349(2)有效的翻譯mRNA的穩(wěn)定性翻譯起始的頻率肽鏈延伸和終止的速率翻譯的忠實性mRNA轉(zhuǎn)錄速率越高mRNA降解速率越低高核糖體結(jié)合位點（SD序列）SD序列與起始密碼之間的距離起始密碼上游區(qū)的序列SD序列與可翻譯序列5’端形成的二級結(jié)構(gòu)遺傳密碼的使用（高頻或低頻）等多加入終止密碼子（串聯(lián)終止子）錯誤氨基酸的攙入當(dāng)前50頁，總共61頁。3/17/202350(3)蛋白質(zhì)水解作用合成后的蛋白質(zhì)在各種蛋白酶和肽酶作用下加工特異蛋白水解加工：主要有兩種類型，一類是信號肽酶I（Lep）或信號肽酶II（Lsp）將分泌（或外運）蛋白質(zhì)上的信號肽切除；一類是對存在于N末端的甲硫氨酸進(jìn)行加工蛋白質(zhì)的降解大腸桿菌內(nèi)不同的蛋白水解酶和肽酶當(dāng)前51頁，總共61頁。3/17/202351(4)蛋白質(zhì)的外泌外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌細(xì)胞的外泌系統(tǒng)相容，可以穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入周質(zhì)，這一過程稱為外泌（export）分泌（secretion）是指蛋白產(chǎn)物被外運到細(xì)胞之外蛋白質(zhì)外泌的優(yōu)點：格蘭氏陰性菌的周質(zhì)中的內(nèi)環(huán)境比細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)氧化性要強，利于含二硫鍵蛋白質(zhì)的正確折疊從細(xì)胞質(zhì)中外運到周質(zhì)中克服了毒性蛋白質(zhì)對細(xì)胞的損害，如水解酶和DNA結(jié)合蛋白通過信號肽酶加工，使外源蛋白有正確的N端蛋白的外泌，特別是分泌到培養(yǎng)基中，便于純化當(dāng)前52頁，總共61頁。3/17/2023523．改善表達(dá)水平的方法①誘導(dǎo)條件②外源基因的編碼序列③用蛋白酶缺失的宿主菌當(dāng)前53頁，總共61頁。3/17/202353①誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)時間（常用）誘導(dǎo)溫度（常用）培養(yǎng)基組成當(dāng)前54頁，總共61頁。3/17/202354②外源基因的編碼序列利用密碼簡并原理，改變編碼區(qū)的核甘酸序列而不改變氨基酸序列，使目標(biāo)基因的前幾個密碼子中的G/C變?yōu)锳/T用優(yōu)先使用的密碼子代替罕用密碼子通過改變核甘酸序列減少翻譯起始區(qū)mRNA的二級結(jié)構(gòu)利用高表達(dá)識別罕用密碼的tRNA質(zhì)粒盡量避免使用那些可能引起翻譯問題的密碼子當(dāng)前55頁，總共61頁。3/17/202355③用蛋白酶缺失的宿主菌避免細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶分解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)當(dāng)前56頁，總共61頁。3/17/2023564.改善外源蛋白溶解性