蛋白質(zhì)分離技術(shù)層析

一、概述

1、定義層析(又名色譜)一種利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)間的差異，使各組分在層析兩相中以不同程度分配，借此將各組分分離。當(dāng)前1頁，總共86頁。分子極性分子大小分子形狀離子親和力分子親和力吸附能力凝膠層析離子交換層析親和層析2、物理化學(xué)性質(zhì)間的差異吸附層析當(dāng)前2頁，總共86頁。1903年俄國植物學(xué)家茨維特發(fā)表了有關(guān)填充以菊根粉的玻璃柱分離植物色素，以石油醚沖洗，得到黃色、綠色區(qū)帶;1970s早期高效液相色譜法（HPLC)目前氣相層析儀和HPLC與色譜、質(zhì)譜以及計算機聯(lián)用。3、層析的發(fā)展當(dāng)前3頁，總共86頁。層析法進行時有兩個相，一個相稱為固定相，另一相稱為流動相。支持物含待分離物質(zhì)當(dāng)前4頁，總共86頁。氣相層析液相層析氣-固氣-液液-固液-液二.層析技術(shù)的分類1.按兩相所處的狀態(tài)分類以氣體作為流動相以液體作為流動相當(dāng)前5頁，總共86頁。2.按層析的機制可分為吸附層析分配層析凝膠層析親和層析離子交換層析當(dāng)前6頁，總共86頁。定義指混合物隨流動相通過吸附劑時，由于吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力而使混合物分離的方法。原理

在不同條件下，吸附劑與被吸附物之間的作用物理作用的范德華吸附：無選擇性，吸附速度快，吸附的過程是可逆的化學(xué)吸附：由原子價力的作用引起。有選擇性，吸附速度較慢，不易解吸（1）吸附層析在單位時間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動態(tài)平衡，吸附層析就是不斷地產(chǎn)生平衡與不平衡，吸附與解吸。當(dāng)前7頁，總共86頁。吸附層析常用的吸附劑

硅膠堿性:碳氫化合物中性:醛,酮,醌,酯,內(nèi)酯酸性:酸性色素,醛,酸聚酰胺氧化鋁活性炭磷酸鈣粉末:吸附力大,流速慢顆粒:吸附力中,流速易控錦綸-活性炭:吸附力弱錦綸66或錦綸6酰胺基團對酚,DNP-氨基酸,醌,羧酸氫鍵：羥基與羰基唯一用于生物活性物質(zhì)羥基磷灰石當(dāng)前8頁，總共86頁。（2）分配層析——利用不同組分在流動相和固定相中的分配系數(shù)不同而進行分離的方法。當(dāng)前9頁，總共86頁。柱層析進樣量大且容易回收薄層層析小量樣品，快速，操作簡便3.按制備量分類當(dāng)前10頁，總共86頁?！鰧游龇ǖ难葑冞^程：圓形濾紙長條濾紙薄層層析(TLC)柱層析容量變大容量更大加展開液當(dāng)前11頁，總共86頁。紙層析薄層層析當(dāng)前12頁，總共86頁。三.層析的一般原理

1.分配系數(shù)

表示一種物質(zhì)在兩種特定相（流動相和固定相）中分配程度。

溶質(zhì)在固定相中的濃度CsK=————————————=——溶質(zhì)在流動相中的濃度Cm?特定的溫度：常數(shù)?K大：被固定相吸附的牢固，隨流動相的移動速度較慢。當(dāng)前13頁，總共86頁。純化生物物質(zhì)的純度取決于混合物中各組分K值的差異程度?；旌衔镏懈鹘M分若K值相差較大,則能較易地把混合物中的生物物質(zhì)分離。反之,K值相差較小,不易把混合物中的生物物質(zhì)分離。當(dāng)前14頁，總共86頁。凝膠層析

GelChromatography凝膠過濾（gelfiltration）(Porath,Flodin,1959)分子篩層析（molecularsievechromatography）(Hjertén,Mosbach,1962)排阻層析（exclusionchromatography）(Pedersen,1962)指混合物隨流動相經(jīng)固定相的層析柱時，混合物中各組份按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。當(dāng)前15頁，總共86頁。一、基本原理

當(dāng)前16頁，總共86頁。固定相（凝膠）——三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water當(dāng)前17頁，總共86頁?！瞿z層析法：樣品固定相流動相小分子被延滯小分子大分子較快流出

分子篩效應(yīng)：分子大小不同,在凝膠受到的阻滯作用有差異,從而造成各組分在凝膠柱中的遷移速度不同得到分離。當(dāng)前18頁，總共86頁。當(dāng)前19頁，總共86頁。凝膠層析過程的數(shù)理關(guān)系

1、柱床體積(VT)

2、洗脫體積（Ve）即欲分離物質(zhì)通過層析柱洗脫下來所需洗脫液的總體積。3、外水體積（V0）4、內(nèi)水體積（Vi）5、凝膠干體積（Vg）

當(dāng)前20頁，總共86頁。柱床體積VT凝膠干體積Vg內(nèi)水體積Vi存在于柱床內(nèi)凝膠外面空隙之間的水相體積，相應(yīng)于一般層析法中流動相的體積。顆粒內(nèi)部所含水相的體積它可從干凝膠顆粒重量和吸水重量相減求得。凝膠體積以及顆粒內(nèi)外間隙體積的總和。VT=1/4D2h外水體積V0VT=Vg+V0+Vi數(shù)理關(guān)系當(dāng)前21頁，總共86頁。

Ve-VoKd=————Vi6、分配系數(shù)（Kd）：特點：（1）與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮∮嘘P(guān)（2）與柱的長短粗細無關(guān)每個溶質(zhì)分子在流動相和固定相之間有一個特定的分配系數(shù)（Kd）Ve=Vo+KdVi當(dāng)前22頁，總共86頁。(2)Ve=Vo+ViKd=1分子完全不被排阻完全向凝膠顆粒內(nèi)部擴散在兩相分配的比值為1,最后流出.(1)Ve=VoKd=0分子完全被排阻于凝膠顆粒之外全部分布于流動相里,最先流出。(3)0<Kd<1Ve=Vo+ViKd為溶質(zhì)以某種程度向凝膠顆粒內(nèi)擴散

Kd=0

0＜Kd<1

Kd=1洗脫體積當(dāng)前23頁，總共86頁。

三.凝膠層析的優(yōu)點

1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。2.操作條件較溫和。3.樣品得率高,重復(fù)性好,可進行大量樣品的分離純化。四、凝膠層析的缺點1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限,所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。3.凝膠結(jié)構(gòu)對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用。當(dāng)前24頁，總共86頁。五、凝膠的結(jié)構(gòu)

與性能

1.葡聚糖凝膠1959年P(guān)orath和Flodin合成（商品名為Sephadex）（1）結(jié)構(gòu)：基本骨架：葡聚糖（dextran）交聯(lián)劑：3-氯代-1,2-環(huán)氧氯丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵交聯(lián)聚合而成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)前25頁，總共86頁。（2）特點：交聯(lián)度：交聯(lián)劑越多交聯(lián)度越大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密交聯(lián)劑越少交聯(lián)度越小網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越疏松化學(xué)性質(zhì)：

穩(wěn)定,不溶于水、鹽、弱酸、堿和一般有機溶劑,耐熱耐堿不耐強酸當(dāng)前26頁，總共86頁。（2）特點：Sephadex的分級范圍

G10<700G15<1,500G251,000~5,000G-501,500~30,000G-753,000~70,000G1004,000~150,000G1505,000~400,000G2005,000~800,000吸水性G類的型號表示每克干凝膠吸水量（ml）x10如G-50每克干凝膠吸水量為5ml。當(dāng)前27頁，總共86頁。大孔凝膠工作范圍的下限幾乎是Sephadex的上限可分離MW40萬以上的物質(zhì)可用來分離核酸及病毒。2.瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose)3.聚丙烯酰胺凝膠當(dāng)前28頁，總共86頁?！龈鞣N層析膠體：PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose+acrylamidecelluloseBio-RadBioGelPBioGelAacrylamideagarose當(dāng)前29頁，總共86頁。六.其它條件選擇

1.柱的選擇柱短而粗,則易使樣品稀釋,柱長而窄,則柱的管壁效應(yīng)較大,會造成拖尾現(xiàn)象。

2.樣品的選擇：

量適當(dāng),粘度小。3.洗脫液的選擇：每種樣品分離所用的緩沖洗脫液應(yīng)根據(jù)使樣品穩(wěn)定的原則使用。七、應(yīng)用1.分離純化2.脫鹽3.測分子量當(dāng)前30頁，總共86頁。Elutionvolume(ml)AlbuminNaClDesaltinginasimplecolumn當(dāng)前31頁，總共86頁。測分子量

VelogMr當(dāng)前32頁，總共86頁。實驗：凝膠層析法分離蛋白質(zhì)當(dāng)前33頁，總共86頁。血紅蛋白64,480二硝基苯-魚精蛋白2,000-12,000SephadexG-50孔徑1,500-30,000一、原理：Kd=0Kd=1當(dāng)前34頁，總共86頁。1、裝柱※先用蒸餾水趕走層析柱中的死體積；※凝膠不能有氣泡和分層現(xiàn)象；※裝柱結(jié)束后要保持凝膠表面平整。二、操作注意點：當(dāng)前35頁，總共86頁。2、加樣※使液面和凝膠表面相切，關(guān)閉出口；※加樣時盡量不要破壞凝膠面；※讓樣品進入凝膠以后在加蒸餾水開始洗脫。當(dāng)前36頁，總共86頁。血紅蛋白和二硝基苯-魚精蛋白的洗脫體積？柱的外水體積和內(nèi)水體積三、結(jié)果要求：當(dāng)前37頁，總共86頁。親和層析

AffinityChromatography

NiPeihua當(dāng)前38頁，總共86頁。一、原理親和層析是利用生物大分子所具有的專一親和力而設(shè)計的純化技術(shù)。尋找配基使配基固定化制成親和層析柱當(dāng)前39頁，總共86頁。基本過程+固相化當(dāng)前40頁，總共86頁。++洗脫吸附當(dāng)前41頁，總共86頁。解吸+當(dāng)前42頁，總共86頁。樣品固相化再生當(dāng)前43頁，總共86頁。當(dāng)前44頁，總共86頁。當(dāng)前45頁，總共86頁。酶：基質(zhì)類似物，抑制劑，輔酶抗體：抗原，病毒，細胞細胞：細胞表面特異蛋白，外源凝集素核酸：互補堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶，結(jié)合蛋白激素或藥物：受體，載體蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，細胞表面受體，細胞常見具有專一性親和力的生物分子對：當(dāng)前46頁，總共86頁。（一）載體的選擇1、載體要求：（1）不溶性（2）滲透性：疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有良好的液體流動性（3）化學(xué)和機械性能穩(wěn)定（4）具備大量能被活化的基因（5）抗微生物和酶的侵蝕當(dāng)前47頁，總共86頁。2、常用載體（1）纖維素特點：價廉、來源充足纖維性、非均一性限制大分子的摻入非專一性吸附嚴重用于抗體和酶的純化（2）葡聚糖凝膠特點：化學(xué)及物理性質(zhì)穩(wěn)定多孔性比瓊脂糖低當(dāng)前48頁，總共86頁。

（3）瓊脂糖凝膠濃度商品2％Sepharose2B4%Sepharose4B6%Sepharose6B

凝膠濃度越低結(jié)構(gòu)越疏松即多孔性越高機械強度越低當(dāng)前49頁，總共86頁。（4）聚丙烯酰胺凝膠（5）多孔玻璃特點：不受微生物的侵蝕耐酸、堿、有機溶劑表面非專一性吸附特點：物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定抗微生物侵蝕能力比瓊脂糖強可供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基較多當(dāng)前50頁，總共86頁。（二）配基的選擇1、對于欲純化的物質(zhì)應(yīng)有專一親和力2、必須具備能被修飾的功能基團當(dāng)前51頁，總共86頁。以酶和底物為例：E+LELKL=[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]E0、L0：起始濃度當(dāng)L0》E0時KL=[E0-EL][L0]/[EL][EL]=[E0-EL][L0]/KLKd=結(jié)合酶/游離酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/KLKLKL：解離常數(shù)E：酶L：底物EL：復(fù)合物當(dāng)前52頁，總共86頁。（三）固相化——將配體以共價鍵連接于固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑載體的排斥效應(yīng)載體的空間障礙當(dāng)前53頁，總共86頁。二、親和層析分離1、裝柱和平衡2、上樣、親和吸附3、洗脫無效洗脫吸附效率不高有效吸附當(dāng)前54頁，總共86頁。洗脫方法（1）非特異性洗脫：改變洗脫液pH值離子強度梯度洗脫（2）特殊洗脫：當(dāng)?shù)鞍孜骄o密或上述方法洗脫會引起失活，可用專一的化學(xué)方法裂解配基與載體的連接鍵，再用透析或凝膠層析法去除配基。斷鍵方法：硫酯鍵、偶氮鍵、二硫鍵（3）專一性洗脫當(dāng)前55頁，總共86頁。

已使用過和柱，經(jīng)過再生處理，去除非特異吸附的雜質(zhì)后，可重復(fù)使用。再生步驟：起始緩沖液重復(fù)平衡一次用高離子強度和低離子強度溶液處用弱酸或弱堿溶液處理4、親和柱的再生：當(dāng)前56頁，總共86頁。三、特點

1、只需一步純化步驟2、產(chǎn)物非常純3、可從很稀的溶液中純化到所需物質(zhì)4、還可去除已變性或部分降解物質(zhì)當(dāng)前57頁，總共86頁。四、應(yīng)用1、分離和純化2、分辨化學(xué)或遺傳學(xué)上修飾的酶3、純化親和標(biāo)記的活化中心肽段和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究4、純化人工合成的多肽和蛋白質(zhì)5、解釋酶作用機理當(dāng)前58頁，總共86頁。實驗

分離豌豆凝集素載體SephdaxG50配基葡聚糖洗脫液1mol/LNaCl特異性洗脫液1mol/LNaCl0.2mol/L葡萄糖當(dāng)前59頁，總共86頁。1mol/LNaCl雜蛋白1mol/LNaCl0.2mol/L葡萄糖豌豆凝集素活性檢測與兔紅細胞發(fā)生凝集反應(yīng)當(dāng)前60頁，總共86頁。離子交換層析

ionexchangechromatography當(dāng)前61頁，總共86頁。一、原理

離子交換層析是用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)）作固定相，利用它與流動相中的某種離子進行可逆的交換性質(zhì)來分離子型混合物的層析方法。當(dāng)前62頁，總共86頁。低鹽高鹽分離結(jié)束當(dāng)前63頁，總共86頁。帶電荷不同蛋白在特定pH值下有不同帶電性質(zhì)當(dāng)前64頁，總共86頁。離子交換樹脂如何分離蛋白質(zhì)洗脫樹脂與樹脂結(jié)合力當(dāng)前65頁，總共86頁。二、離子交換劑的類型在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團（一）按活性功能基團帶電荷性質(zhì)不同陽離子交換劑——帶負電荷，與陽離子交換陰離子交換劑——帶正電荷，與陰離子交換?

陰離子交換樹脂對化學(xué)試劑及熱都不如陽離子交換樹脂穩(wěn)定。膠體膠體當(dāng)前66頁，總共86頁。1.離子交換樹脂：(1)類型聚苯乙烯樹脂：（二）按載體種類不同苯乙烯二乙烯苯聚苯乙烯母體交聯(lián)劑當(dāng)前67頁，總共86頁。聚丙烯酸—陽離子交換樹脂甲基丙烯酸二乙烯苯特點：高交換量pH<8羧基不完全解離當(dāng)前68頁，總共86頁。（2）離子交換樹脂的性質(zhì)①、一般離子交換劑的特性多孔性：疏松、多孔網(wǎng)狀，活性基團在網(wǎng)孔內(nèi)不溶性：不溶于稀酸、稀堿、有機溶劑穩(wěn)定性：離子交換性：具相當(dāng)數(shù)量的可交換或帶電基團②、交換量：指交換劑中可交換的離子數(shù)當(dāng)前69頁，總共86頁。Dowex100149mDowex50297mDowex20840m③、交聯(lián)度：合成樹脂時所用的交聯(lián)劑在原料總重量中所占的百分比交聯(lián)度越大樹脂的網(wǎng)孔越小膨脹性小交換量少交聯(lián)度越小樹脂的網(wǎng)孔越大膨脹性大交換量大

膨脹性增加易引起樹脂的機械變形破損當(dāng)前70頁，總共86頁。陽離子交換樹脂

強酸型磺酸基-SO3-H+

中等酸型磷酸根-O-PO2H2

亞磷酸根-O-POH2

弱酸型羧基-COOH陰離子交換樹脂

強堿季胺基團[-N+(CH3)3]弱堿叔胺、仲胺、伯胺基團

（3）可引入的解離基團當(dāng)前71頁，總共86頁。當(dāng)前72頁，總共86頁。（4）離子交換樹脂對離子的親和力■離子取代順序：++++++++++++++++++>>電荷高者離子大者濃度大者>當(dāng)前73頁，總共86頁。（4）離子交換樹脂對離子的親和力①陽離子樹脂電價數(shù)：Na+<Ca++<Al+++<Ti++++原子價數(shù)相同，原子序數(shù)Li+<Na+<K+<Pb+②陰離子強堿性交換樹脂CH3COO-<F-<OH-<HCOO-<CL-<SCN-<Br-<CrO4=<NO3-<I-<C2O4=<SO4=弱堿性交換樹脂F(xiàn)-<CL-<Br-=I-=CH3COO<Mo4=<PO4=<NO3-<酒石酸根<檸檬酸根<C2