微生物檢驗(yàn)講義wswjy細(xì)菌對(duì)藥物的敏感試驗(yàn)

細(xì)菌對(duì)藥物的敏感試類成素成第一節(jié)臨床類成素成其他與細(xì)菌核糖體30S小亞基不可逆結(jié)合mRNA錄和蛋白合類作用于DNA旋轉(zhuǎn)酶，干擾DNA的、修類萬(wàn)古霉素、拉阻斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合A組為常規(guī)首選藥敏試驗(yàn)藥物B組包含一些臨重要的，特別是針對(duì)醫(yī)院內(nèi)的藥物，也可以用于一級(jí)試驗(yàn)。但，它們只是A標(biāo)本來(lái)源（如三代頭孢菌素對(duì)腦脊液中的腸道桿菌或者TMP/SMZ對(duì)泌的分離菌株）；多種細(xì)菌多部位；對(duì)A組過(guò)敏、耐受或無(wú)效的病例；為流行病學(xué)目的向控制組報(bào)告。C組包括替代性或補(bǔ)充性抗微生物藥，可在以下情況進(jìn)行試驗(yàn)：某些單位潛伏存在有對(duì)數(shù)種基本藥物過(guò)敏的患者；治療少見菌的（如氯霉素對(duì)沙門菌屬或某些假單胞菌屬）；為流行病學(xué)目的向控U組僅用于治療泌的抗微生物藥（如呋喃妥因和某些喹諾酮類藥物）。除泌，其他第二節(jié)細(xì)菌對(duì)藥物的敏感試細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感試驗(yàn)（藥敏試驗(yàn)）主要用于：①幫助臨床醫(yī)師選擇效果最佳的藥物進(jìn)行性疾病的治療，以避免由于抗菌藥物使用不當(dāng)成的許多不良；②進(jìn)行流行病學(xué)，了解本院、本地區(qū)致病菌的耐藥性變遷情況，以便在宏觀上制耐藥性的發(fā)生發(fā)展，對(duì)于院內(nèi)的控制也具有積極意義；③藥敏試驗(yàn)結(jié)果還可以用來(lái)做某些細(xì)菌的定；④指導(dǎo)有關(guān)部門制定流行耐藥菌的防治措施。一、擴(kuò)散法（K-B法目前常用的方法是紙片瓊脂擴(kuò)散法，是一種半定量的方法。CLSI/NCCLS（Nationalcommitteeforclinicallaboratorystandards）紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)分委推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法是以Bauer-KirbyK-B（一）原理將含有定量抗菌藥物的紙片（藥片）貼在已接種待檢菌的瓊脂平板表面特定部位，度逐漸減少的濃度梯度。成透明抑菌圈。抑菌圈的大小可以反映待檢菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。（二）（mueller-hintonM-H）瓊脂，pH7.2，90mm30ml，使瓊脂厚度為4mm。待瓊脂凝固后放入35℃溫箱培養(yǎng)30分鐘，待瓊脂表面干燥后方可使用。的M-H瓊脂平皿可置4℃冰箱保存7天。對(duì)生長(zhǎng)條件要求高的細(xì)菌，如鏈球菌屬等細(xì)菌須在M-H瓊脂中加入5%的脫纖維羊血。桿菌屬細(xì)菌需補(bǔ)充1%血紅蛋白（含V因子）和1%X因子復(fù)合物?？顾幬锛埰瑩裰睆?.35mm，吸水量μl的藥片。時(shí)取滅菌藥片，經(jīng)逐片加樣或浸泡各種藥物溶液后，使每片的含藥量達(dá)到規(guī)定的量，冷凍干燥后置于-℃保存?zhèn)溆谩Ｐ璺磸?fù)使4℃品供應(yīng)。（1）菌液標(biāo)準(zhǔn)比濁管的：0.048mol/L（1.175%）氯化鋇0.5ml加0.18mol/L（1%）硫酸溶液99.5ml4～6ml，密封，在室溫下置于暗處保0.5（Mcfarlandstandard）1.5×108/ml（2）4～53～5ml白（M-H）肉湯中，35℃培養(yǎng)2～8小時(shí)。鏈球菌屬和桿菌屬細(xì)菌需用加血肉湯培養(yǎng)過(guò)夜。用生理鹽水0.515（三）24mm15mm。直徑90mm6放置15分鐘再倒放于35℃（檢測(cè)MRS過(guò)35℃）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18小時(shí)閱讀結(jié)果。有些細(xì)菌需在20～24小時(shí)閱讀結(jié)果，如鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、奈瑟菌、不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌等。葡萄球菌和腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的藥敏結(jié)果應(yīng)在24小時(shí)。（四）結(jié)果判讀平板置黑色無(wú)反光背景上，從平板背面用卡尺、毫米尺或特制的模板測(cè)量包括紙片敏感（S）：表示常規(guī)劑量的測(cè)定藥物在體內(nèi)所達(dá)到的濃度能抑制或殺滅待測(cè)中介度（I）：不是敏感性的度量，這一范圍作為“緩沖閾”，以防止由微小的技術(shù)因素失控導(dǎo)致的高的部位（如尿液、膽汁等），細(xì)菌生長(zhǎng)可被抑制。耐藥（R）：表示常規(guī)劑量的測(cè)定藥物在體內(nèi)達(dá)到有效濃度時(shí)不能抑制檢測(cè)菌生長(zhǎng)（五）培養(yǎng)基培養(yǎng)基的成分對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有直接影響，有些抗菌藥物的抑菌或殺菌力可被多種物質(zhì)所pH7.2～7.4M-H性、直徑等有關(guān)。批量的抗菌藥物紙片，務(wù)使每張紙片所含的藥物濃度相同；抗菌藥物紙片應(yīng)妥善保培養(yǎng)基的厚度對(duì)抑菌圈的大小有影響，故平皿中加入培養(yǎng)基要固定，以4mm深度為宜。的3530（六）用標(biāo)準(zhǔn)菌株是進(jìn)行質(zhì)控的主要措施，應(yīng)從可靠的菌種保藏中心索購(gòu)，金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853及糞腸球菌ATCC29212或ATCC33186用于抑菌圈質(zhì)控范圍每種抗菌藥物對(duì)四個(gè)質(zhì)控菌株的抑菌圈允許范圍，為95%的可信限，即日間20二、釋。詳CLSI/NCCLS的方法。根據(jù)稀釋培養(yǎng)基的不同，分為肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法。瓊脂稀釋法濃度（MIC），稀釋法也可測(cè)定最小殺菌濃度（MBC）（一）凡無(wú)肉眼可見細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度即為該待測(cè)菌最低抑菌濃度（MIC）0.01ml35℃99.9（MB）。生長(zhǎng)；另外由于某些抗菌藥物不夠穩(wěn)定，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使其抗菌活性降低，甚至，從而使MIC值增ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、糞腸球菌ATCC29212和銅綠假單胞菌ATCC27853等標(biāo)準(zhǔn)菌株在同一試驗(yàn)條件平行試驗(yàn)，三、殺菌試臨床常用的定量評(píng)價(jià)抗菌藥物殺菌效力的試驗(yàn)主要包括最低殺菌濃度（MBC）試驗(yàn)和殺菌曲線濃度是某抗菌藥99.9%以上的測(cè)試菌量的最低藥物濃度。測(cè)定方法就是稀釋法MIC定的基礎(chǔ)上通過(guò)再轉(zhuǎn)種、再孵育，最終測(cè)得某種抗菌藥物對(duì)MBC。四、體外聯(lián)合藥物敏感試（―）試管棋盤（方陣）ABMICABMIC6～8MIC2根據(jù)測(cè)定結(jié)果按下列計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)（FIC）FIC＝A藥聯(lián)合時(shí)的MIC／A測(cè)的MIC+B聯(lián)合時(shí)MIC／B藥單測(cè)的判斷標(biāo)準(zhǔn)：FIC＜0.5FIC0.5～1FIC1～2無(wú)關(guān)作用FIC＞2拮抗作用（二）聯(lián)合殺菌試驗(yàn)聯(lián)合殺菌試驗(yàn)所用的方法同前述的時(shí)間-殺菌曲。分別測(cè)定并繪出兩種藥物五、厭氧菌、結(jié)核分枝桿菌及酵母樣真菌的體外抗菌藥物敏感試（一）藥敏試驗(yàn)指征由于厭氧菌多為內(nèi)源染，厭氧菌對(duì)目前常用抗菌藥物的敏感性較為穩(wěn)定，加之厭氧菌培養(yǎng)要求特殊，臨床一般不做體外藥敏試驗(yàn)，發(fā)生以下情況時(shí)，應(yīng)考慮體外藥敏試驗(yàn)：①明確厭氧菌引起的嚴(yán)重；②已確證的厭氧菌，經(jīng)經(jīng)驗(yàn)治療未能奏效；③需長(zhǎng)期用藥的厭氧菌感E-試驗(yàn)法和β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)。其培養(yǎng)基布氏血瓊脂，其期過(guò)7天（4～10℃），含亞胺培南和克拉維酸必須使用當(dāng)天制3%～5%凍融羊血為稀釋法培養(yǎng)基。除脆弱類擬桿菌外革蘭厭菌株（或）酸耐藥時(shí)時(shí)ββ丁坦素坦南南南（二）菌醇肉眼觀察各管的生長(zhǎng)情況，二性霉素B的MIC為抑制測(cè)試菌肉眼可見生長(zhǎng)的最低藥物濃度。5-氟胞嘧啶和吡咯類常采用80%MIC判斷標(biāo)準(zhǔn)，即抑制80%檢測(cè)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為其MIC。取無(wú)藥生長(zhǎng)對(duì)照管0.2ml，0.8ml80%檢測(cè)菌抑制的比濁標(biāo)準(zhǔn)。六、體內(nèi)抗菌藥物的濃度與活性測(cè)（一）物耐藥的指示菌，利用直徑6.3mm，吸水量為20ml的濾紙片和該抗菌藥的標(biāo)準(zhǔn)液制成標(biāo)準(zhǔn)藥片。42，35℃16～20（二）力/殺菌力高于1:8或1:16時(shí)，認(rèn)為治療方案有效，如為嚴(yán)重，抑菌力/殺菌力應(yīng)高于1:64。第三節(jié)細(xì)菌的耐藥性和產(chǎn)生機(jī)制產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的主要產(chǎn)生鈍化酶如氨基糖苷類鈍化酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移青霉素結(jié)合蛋白的改變MRSA藥敏作用靶位的改變?nèi)绾颂屈c(diǎn)的改變引起大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素耐藥二、細(xì)菌耐藥性表型的檢菌，大多由TEM-1、2，SHV-1型突變而成。其他的型的類別還有CTX-M、TOHO等。ESBLs可以水解青（2）K-B法篩查可選用頭孢泊肟≤17mm、頭孢他啶≤22mm、頭孢噻肟≤27mm、氨曲南≤27mm、頭孢曲松≤25mm。奇異變形桿菌頭孢泊肟和頭孢他啶≤22mm，頭孢噻肟≤27mm。確認(rèn)試驗(yàn)：KB法貼兩組紙片一頭孢他啶、頭孢他啶/棒酸；頭孢噻肟、頭孢噻肟/棒酸，若兩組中任何一組加棒酸的抑菌環(huán)直徑與相應(yīng)不加棒酸的抑菌環(huán)直徑相差≥5mm，則判斷此菌為產(chǎn)ESBLs法若兩組中任何一組加棒酸的MIC值比相應(yīng)不加棒酸的MIC值降低3個(gè)以上稀釋倍數(shù)，則判斷此菌為產(chǎn)ESBLs菌株。產(chǎn)ESBLs的克雷伯菌屬及大腸埃希菌分離株，臨可能對(duì)青霉素類、頭孢菌素類及氨曲南治療無(wú)效，即便體外有時(shí)敏感。對(duì)所有產(chǎn)ESBLs的菌株應(yīng)當(dāng)報(bào)告為耐所有青霉素類、頭孢菌素類及氨曲南。MRS對(duì)耐甲氧西林的耐藥是由于本身存在的MecA編碼的異常PBPs所致MRS除對(duì)甲氧西林耐藥外，還常常對(duì)其他類抗生素耐藥，呈現(xiàn)多重耐藥性MRSA4%NaClMH6μg/ml10μg/ml35℃24MRSMIC≥8μg/mlSβ≤14mm的金黃色葡萄球菌的敏感性無(wú)法解釋，應(yīng)進(jìn)一步測(cè)試其MIC值。VISA/GISA對(duì)萬(wàn)古霉素的非敏感性對(duì)氨基糖苷類呈耐藥性的腸球菌（HLAR）選，可預(yù)測(cè)氨芐西林、青霉素或萬(wàn)古霉素和一種氨基糖苷類的協(xié)同效應(yīng)。6μg/ml，判斷：菌落生長(zhǎng)為耐藥。（1）鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥是由于PBP的改變，減低了對(duì)β內(nèi)酰胺類的親和力（2）鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥性檢查（PRP）采用1g苯唑西林紙片篩選法。苯唑西林的抑圈≤19mmMICs，≤19mm，耐藥、中介或某些敏感菌株中。不能僅僅根據(jù)苯唑西林的抑菌圈≤19mm產(chǎn)AmpC酶的革蘭桿AmpC酶屬于Bush單胞菌產(chǎn)生，由介導(dǎo)，又稱Ⅰ型酶。它對(duì)青霉素