CAR-T聯(lián)合移植治療all

難治性白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方案治療2個(gè)療程無(wú)效的初治病例CR后經(jīng)過(guò)鞏固強(qiáng)化治療，6個(gè)月內(nèi)首次復(fù)發(fā)在6個(gè)月后復(fù)發(fā)但經(jīng)常規(guī)治療無(wú)效者再次或多次復(fù)發(fā)者髓外白血病持續(xù)存在——全國(guó)第四屆難治性白血病學(xué)術(shù)研討會(huì)，

第一頁(yè)，共41頁(yè)。

復(fù)發(fā)性白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)（符合下列條件之一）誘導(dǎo)化療獲得CR的AL患者骨髓原始細(xì)胞大于5％但少于20％，經(jīng)過(guò)一療程標(biāo)準(zhǔn)化療未獲得完全緩解。誘導(dǎo)化療獲得CR的AL患者骨髓原始細(xì)胞大于20％。髓外出現(xiàn)白血病細(xì)胞浸潤(rùn)。第二頁(yè)，共41頁(yè)。難治性白血病的主要原因白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐受原發(fā)耐藥：化療之前即存在繼發(fā)耐藥：反復(fù)化療誘導(dǎo)白血病細(xì)胞產(chǎn)生耐藥正常造血干細(xì)胞功能衰竭第三頁(yè)，共41頁(yè)。難治性白血病的治療原則常用的方法使用無(wú)交叉耐藥的新藥組成聯(lián)合化療方案中、大劑量化療臨床試驗(yàn)異基因造血干細(xì)胞移植使用耐藥逆轉(zhuǎn)劑新的靶向治療藥物或生物治療第四頁(yè)，共41頁(yè)。復(fù)發(fā)、難治性AML患者的治療選擇大劑量Ara-C再誘導(dǎo)治療中劑量Ara-C為基礎(chǔ)的方案（FLAG或聯(lián)合蒽環(huán)、蒽醌類藥物）再誘導(dǎo)治療二線藥物再誘導(dǎo)治療臨床試驗(yàn)異基因造血干細(xì)胞移植（二線方案獲得CR后再移植或直接移植）第五頁(yè)，共41頁(yè)。雖然化療治療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病取得很好的療效，70%以上患者可獲得5年以上長(zhǎng)期生存，但在成人ALL療效仍然很差，尤其是復(fù)發(fā)難治性急性淋巴細(xì)胞白血病的患者預(yù)后極差，甚至即使接受挽救性造血干細(xì)胞移植治療，大多患者僅能獲得短期病情控制，如果是在異基因造血干細(xì)胞移植之后復(fù)發(fā)或無(wú)條件接受移植治療，該類患者基本上處于無(wú)藥可救境地。第六頁(yè)，共41頁(yè)。近期CD19嵌合抗原受體技術(shù)在治療兒童和成人復(fù)發(fā)B-ALL方面初步顯示出很好療效，近兩年的ASH會(huì)議上均有所報(bào)道。為了強(qiáng)調(diào)這個(gè)領(lǐng)域的重要性，CAR-T療法成為2014、2015年ASH年會(huì)中的一個(gè)重點(diǎn)。這種新型療法為復(fù)發(fā)難治性B-ALL患者帶來(lái)了一線生機(jī)，尤其給那些此前各種實(shí)驗(yàn)療法均失敗、無(wú)藥可治的患者帶來(lái)了希望。第七頁(yè)，共41頁(yè)。

CAR-T細(xì)胞治療惡性腫瘤有多重優(yōu)勢(shì)：短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增腫瘤特異的T細(xì)胞群，靶抗原的非HLA依賴，可反復(fù)多療程使用等。但作為是一種剛剛應(yīng)用于臨床的新型治療方法，還存在很多問(wèn)題和未確定因素需要進(jìn)一步研究和探索，包括“CAR-T細(xì)胞最基本的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的制定和監(jiān)控，回輸?shù)淖罴褧r(shí)機(jī)和方式，治療相關(guān)不良反應(yīng)及其控制，以及近期、遠(yuǎn)期確切的治療效果等等”。尤其對(duì)中國(guó)的患者臨床療效如何？第八頁(yè)，共41頁(yè)。病例選擇：1.1復(fù)發(fā)難治性急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）患者經(jīng)其他傳統(tǒng)治療手段無(wú)效，治療前確認(rèn)白血病細(xì)胞CD19+。復(fù)發(fā)難治性急性B淋巴細(xì)胞白血病定義：初治病人對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療無(wú)效（ALL1個(gè)療程，AML兩個(gè)療程）；在首次緩解6個(gè)月內(nèi)、即早期復(fù)發(fā)的白血?。浑m然在首次緩解6個(gè)月后復(fù)發(fā)，但以原方案再誘導(dǎo)

治療失敗者；

2次或2次以上復(fù)發(fā)的患者。第九頁(yè)，共41頁(yè)。1.2患者自愿入組參加，依從性好，能全程配合試驗(yàn)觀察，一般情況尚好，心、肝、腎功能基本正常，無(wú)重癥感染，采血時(shí)外周血CD3+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)必須≥0.8x109/L。T淋巴細(xì)胞數(shù)量和亞型的評(píng)估白血病細(xì)胞表面抗原CD19的檢測(cè)和鑒定第十頁(yè)，共41頁(yè)。2.治療方法：

用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入CD19CAR的自體T細(xì)胞（CAR-T-CD19）輸注給患者，輸注劑量為

5×108~無(wú)上限，分3-5次回輸。第十一頁(yè)，共41頁(yè)。回輸前對(duì)體外制備的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和鑒定：1）基本指標(biāo)：數(shù)量、活性度、有無(wú)病原體等污染。2）靶抗原轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞殺傷功能。對(duì)照組轉(zhuǎn)染組第十二頁(yè)，共41頁(yè)。RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染結(jié)果CD19GAPDHCAR質(zhì)粒患者陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照CAR質(zhì)?；颊哧?yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照第十三頁(yè)，共41頁(yè)。相對(duì)定量----Cp值與內(nèi)參Cp值注：L2為患者細(xì)胞，X1為另一組感染效率的對(duì)照細(xì)胞，NC為經(jīng)過(guò)相同時(shí)間周期培養(yǎng)的未感染的T細(xì)胞（NC-CD19的Cp值超過(guò)35，說(shuō)明樣品中沒(méi)有模板）。左側(cè)CD19的引物位于CAR的scFv上，，正常的T細(xì)胞不表達(dá)；右側(cè)為GAPDH，作為上樣內(nèi)參；樣品名CD19GAPDHL2（患者）19.8912.61X1（陽(yáng)參）21.7512.68NC（陰參）36.2714.19Cp值平均數(shù)第十四頁(yè)，共41頁(yè)。FCM檢測(cè)轉(zhuǎn)染結(jié)果未轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞第十五頁(yè)，共41頁(yè)?；剌斍癟細(xì)胞亞群檢測(cè)第十六頁(yè)，共41頁(yè)。CAR-T細(xì)胞回輸前1周內(nèi)，除予以小劑量環(huán)磷酰胺(0.3g/M2iv.-6d,-5d,-4d)進(jìn)行預(yù)處理幫助刪除抑制性淋巴細(xì)胞之外（也有患者采用FC），禁用其他一切細(xì)胞毒藥物和免疫抑制劑?；剌敃r(shí)至少由三人（醫(yī)生、護(hù)士和細(xì)胞制備技術(shù)人員）對(duì)患者的姓名、性別、年齡、住院號(hào)、細(xì)胞培養(yǎng)序列號(hào)和質(zhì)控報(bào)告單等資料進(jìn)行嚴(yán)格核對(duì)，確認(rèn)無(wú)誤后再行回輸，回輸過(guò)程中密切觀察患者情況。第十七頁(yè)，共41頁(yè)。3.觀察指標(biāo)：1）安全性，患者接受CAR-T-CD19治療，可能出現(xiàn)的

各種相關(guān)不良反應(yīng)及患者耐受性。2）CAR-T-CD19體內(nèi)清除白血病細(xì)胞效能。3）

CAR-T-CD19在體內(nèi)持續(xù)存留的時(shí)間。第十八頁(yè)，共41頁(yè)。4.結(jié)果1）6例成人接受CAR-T-CD19治療患者的一般情況性別年齡臨床診斷和既往治療男：4例女：2例16歲~52歲均為難治性或反復(fù)復(fù)發(fā)（含髓外浸潤(rùn)3/6）的B-ALL，其中3例bcr/abl陽(yáng)性（含1例B髓雙系列混合型AL），1例t(4;11)、MLL-AF4陽(yáng)性,1例Pro-B-ALL伴CD33、CD13表達(dá)，1例Pre-Pre-B-ALL伴骨髓纖維化第十九頁(yè)，共41頁(yè)。4.結(jié)果2）安全性：所有患者在回輸細(xì)胞后均出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱，一般均在37℃~38℃，偶然最高可達(dá)39℃以上，但均為一過(guò)性，無(wú)畏寒、寒戰(zhàn)、心慌、胸悶等不適，無(wú)需特殊處理或僅用物理降溫即可退熱。第1例患者在回輸CAR-T2周后復(fù)查骨髓發(fā)現(xiàn)有嗜血現(xiàn)象，無(wú)其他嚴(yán)重毒副反應(yīng)。第二十頁(yè)，共41頁(yè)。被巨噬細(xì)胞吞噬的成熟紅細(xì)胞原始細(xì)胞（白血病細(xì)胞）第1例：CAR-T回輸后15d骨髓涂片細(xì)胞學(xué)檢查（

BM細(xì)胞）第二十一頁(yè)，共41頁(yè)。原始細(xì)胞（白血病細(xì)胞）回輸后15dBM細(xì)胞回輸后33dBM細(xì)胞骨髓增生極度低下第二十二頁(yè)，共41頁(yè)。4.結(jié)果3）臨床療效（反應(yīng)率）3例外周血和骨髓均達(dá)到完全緩解，2例PR，1例病情穩(wěn)定。1例PR患者因長(zhǎng)期粒缺、合并肺部重癥感染死亡。第二十三頁(yè)，共41頁(yè)。第1例：治療前骨髓中的白血病細(xì)胞﹥70%第二十四頁(yè)，共41頁(yè)。第1例：治療后15d骨髓中的白血病細(xì)胞＜20%第二十五頁(yè)，共41頁(yè)。FCM檢測(cè)治療后白血病細(xì)胞清除效率1）2015-06-11（回輸前）2）2015-07-01（回輸后7d）3）2015-07-10（回輸后17d）4）2015-07-27（回輸后33d）CD34第1例SSC第二十六頁(yè)，共41頁(yè)。1）2015-06-11（回輸前）2）2015-07-01（回輸后7d）3）2015-07-10（回輸后17d）4）2015-07-27（回輸后33d）CD19FCM檢測(cè)治療后白血病細(xì)胞清除效率第1例第二十七頁(yè)，共41頁(yè)。第2例治療前BMBC＞80%治療后22d,60d

BM完全緩解（

BC﹤5%）第二十八頁(yè)，共41頁(yè)。第2例治療前第二十九頁(yè)，共41頁(yè)。第2例治療后22d第三十頁(yè)，共41頁(yè)。第3例治療前BMBC＞70%治療后BMBC﹤35%第三十一頁(yè)，共41頁(yè)。第三十二頁(yè)，共41頁(yè)。4.結(jié)果4）CAR-T在體內(nèi)持續(xù)存留時(shí)間

第2例CAR-T回輸后第60天，骨髓和外周血CR。PB-RT-PCR可檢出CAR-T特異性核苷酸片段。3個(gè)月時(shí)測(cè)不出。第三十三頁(yè)，共41頁(yè)。第4例：CAR-T回輸后第30天，骨髓和外周血細(xì)

胞學(xué)CR。bcr/abl（T315I突變）融合基因

P21019.3%陽(yáng)性

PB-RT-PCR可檢出微量CAR-T特異性核

苷酸片段。微弱陽(yáng)性第三十四頁(yè)，共41頁(yè)。討論第三十五頁(yè)，共41頁(yè)。一、CAR-T治療的安全性：CAR有多安全？迄今為止報(bào)道的CART治療相關(guān)副作用：1.細(xì)胞因子風(fēng)暴，腫瘤裂解效應(yīng)、外周血中CAR-T細(xì)胞的數(shù)量和促炎癥細(xì)胞因子的水平直接相關(guān)。2.靶向細(xì)胞毒性，B細(xì)胞再生性貧血障礙或瞄定CD19分子而引起的低丙種球蛋白血癥。3.神經(jīng)系統(tǒng)毒性，幾個(gè)研究組在用CAR-T治療白血病的過(guò)程中，觀察到少部分患者出現(xiàn)神經(jīng)錯(cuò)亂，語(yǔ)言障礙，癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)。4.其他合并的免疫炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞活化，類自身免疫性疾病等。第三十六頁(yè)，共41頁(yè)。第1例患者CAR-T細(xì)胞回輸后雖然骨髓中白血病細(xì)胞明顯減少，但始終未能恢復(fù)正常造血，最終因持續(xù)粒細(xì)胞缺乏，肺部重癥感染離世。分析原因：治療前患者一般情況極差，查PB：WBC0.73×109/L,N6.8%,

Neu0.05×109/L,Ly93.2%0.68x109/LHb26g/L，PLT10×109/L，骨髓中原始細(xì)胞73%。經(jīng)長(zhǎng)期使用IL-2和支持治療后，患者勉強(qiáng)達(dá)到采血標(biāo)準(zhǔn)。既往長(zhǎng)期反復(fù)強(qiáng)化療，損傷正常造血干祖細(xì)胞，有繼發(fā)再障、MDS可能。既往化療時(shí)，曾反復(fù)合并肺部重癥感染（包括肺真菌?。?，容易再次激活。不排除巨噬細(xì)胞活化加重或延長(zhǎng)粒細(xì)胞缺乏，

患者出院后再次入院時(shí)查PB：WBC0.2×109/L,N30%,Neu0.06×109/L,Ly65%0.13x109/L，Hb49g/L，PLT15×109/L。第三十七頁(yè)，共41頁(yè)。二、清除白血病細(xì)胞的效能和臨床療效1）宿主因素：①白血病細(xì)胞自身的生物學(xué)特性，如增殖活性，浸潤(rùn)能力，干擾或逃逸免疫殺傷的能力等等。②既往用藥和患者接受治療時(shí)的基本免疫水平。第三十八頁(yè)，共41頁(yè)。早期和目前的研究著重于穩(wěn)定產(chǎn)生腫瘤靶向的T細(xì)胞，而腫瘤周圍抑制性的微環(huán)境卻可能使CAR-T細(xì)胞變得毫無(wú)效用。因此，未來(lái)這一療法的研究方向還應(yīng)該考慮消除腫瘤微