土壤中分解尿素的微生物的分離與計數

土壤中分解尿素的微生物的分離與計數第1頁/共26頁高考導航1、題型：大題2、分值：15分如河南近幾年高考。第2頁/共26頁一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農業(yè)氮肥。尿素不能直接被農作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌能利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3第3頁/共26頁4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計菌落數目㈢.設置對照第4頁/共26頁1、實例：PCR技術啟示：尋找目的菌種時要根據它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。原因：因為熱泉溫度70～800C，淘汰了絕大多數微生物只有Taq細菌被篩選出來。DNA多聚酶鏈式反應是一種在體外將少量DNA大量復制(PCR)的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株第5頁/共26頁2、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。第6頁/共26頁15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數所需培養(yǎng)基：①從物理性質看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基第7頁/共26頁培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為唯一氮源。5、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理第8頁/共26頁允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，叫做選擇培養(yǎng)基尿素尿素第9頁/共26頁6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是分離尿素細菌判斷該培養(yǎng)基有無選擇性實驗組對照組培養(yǎng)基類型是否接種

目的

結果只生長尿素細菌生長多種微生物是第10頁/共26頁1、顯微鏡直接計數㈡.統(tǒng)計菌落數目：不能區(qū)分死菌與活菌；缺點：第11頁/共26頁2.間接計數法（活菌計數法）⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數。第12頁/共26頁注意事項①為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30——300的平板上進行計數。②為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平板中，經涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數目低。第13頁/共26頁

在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結果時，一定要考慮所設置的重復組的結果是否一致，結果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。第14頁/共26頁相關計算某同學在稀釋倍數為106

的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數的平均數為234，那么每克樣品中的菌落數是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B第15頁/共26頁（三）設置對照判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染：將未接種的培養(yǎng)基同時進行培養(yǎng)。判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：完全培養(yǎng)基接種后培養(yǎng)觀察菌落數目。第16頁/共26頁實驗設計從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。“微生物的天然培養(yǎng)基”[一]土壤取樣數量最大、種類最多大約70%—90%是細菌取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。第17頁/共26頁[二]制備培養(yǎng)基

在每個稀釋度下，

準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（1個）和選擇養(yǎng)基(3個)。

第18頁/共26頁◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數在30～300之間、適于計數的平板（三） 樣品的稀釋第19頁/共26頁問題：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數約為2185萬，放線菌數約為477萬，霉菌數約為23.1萬。第20頁/共26頁㈣.取樣涂布◆如果同一稀釋倍數的三個重復的菌落數相差較大，表明試驗不精確，需重新實驗。第21頁/共26頁[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。第22頁/共26頁四.結果分析與評價1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30—300個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數最合適。同一稀釋倍數的三個重復的菌落數不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。第23頁/共26頁1.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。五.課外延伸第24頁/共26頁

1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合