腸道致病菌檢驗(yàn)技術(shù)

關(guān)于腸道致病菌檢驗(yàn)技術(shù)第一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)概述一、食品中常見的腸道致病菌沙門氏菌志賀氏菌大腸艾希氏菌變形桿菌耶爾森菌第二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三二、生物學(xué)特性1、形態(tài)與染色均為革蘭氏陰性桿菌，中等大小，無芽胞，多數(shù)具有周身鞭毛能運(yùn)動，志賀氏菌屬無鞭毛無動力。2、培養(yǎng)和生化反應(yīng)（1）、需氧或兼性厭氧，菌落中等大小，表面光滑，液體培養(yǎng)基混濁生長。（2）、腸道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多能分解乳糖、葡萄糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣。（3）、可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。

第三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三

三、抗原類型

O抗原也稱菌體抗原，細(xì)胞壁脂肪糖，耐熱100℃不被破壞H抗原也稱鞭毛抗原，鞭毛蛋白，不耐熱，60℃30′可破壞K抗原也稱表面抗原（莢膜抗原），多糖，具有阻抑O抗原發(fā)生凝集的現(xiàn)象，加熱60℃30′可消除抑阻作用菌毛抗原第四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三四、致病性（一）、致病物質(zhì)1、內(nèi)毒素：能引起機(jī)體發(fā)熱，白細(xì)胞減少，低血糖，血壓降低，嚴(yán)重者休克。2、外毒素：對小腸粘膜細(xì)胞具有物殊毒害作用，引起腹瀉。第五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（二）、所致病疾

1、傷寒和副傷寒

2、食物中毒

3、細(xì)菌性痢疾第六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三

五、微生物檢驗(yàn)的基本程序

檢樣→處理→增菌培養(yǎng)→分離培養(yǎng)→生化試驗(yàn)→血清學(xué)鑒定→報(bào)告

第七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三思考題1、腸道致病菌具有哪些生物學(xué)特性?2、腸道致病菌具有哪些抗原？又稱為什么？有什么特點(diǎn)？3、寫出腸道致病菌檢驗(yàn)的基本程序第八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)、沙門氏菌檢驗(yàn)一、概況（一）沙門氏菌的發(fā)現(xiàn)與食物中毒（二）沙門氏菌的命名根據(jù)所致疾病命名根據(jù)菌的發(fā)現(xiàn)地區(qū)命名以發(fā)現(xiàn)者的名字命名（三）沙門氏菌的抵抗力

60℃30′可殺死第九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三

（四）沙門氏菌的分類地位及定義1、地位：是腸桿菌科、埃希氏菌族、沙門氏菌屬中的細(xì)菌2、定義是腸桿菌科中形態(tài)和培養(yǎng)特征，生化反應(yīng)及抗原結(jié)構(gòu)相似，被O1噬菌體裂解的一群革蘭氏陰性桿菌。第十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三二、生物學(xué)特性

（一）、形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無莢膜，無芽胞，多數(shù)有鞭毛，有動力，短小桿菌。（二）、培養(yǎng)特性

1、需氧或兼性厭氧，最適溫度37℃，PH7.2~7.4。第十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三(沙門氏菌（紅色）侵入人體細(xì)胞

第十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三2、對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基生長良好，37℃，24h，能形成菌落中等大小，直徑2～3mm，圓形或卵形，表面光滑濕潤，無色半透明，邊緣整齊的菌落3、在液體培養(yǎng)基中，呈均勻混濁性生長，無菌膜。第十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（三）、生化特性1、發(fā)酵GLU，甘露醇，山梨醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣（傷寒雞傷寒沙門氏菌少數(shù)不產(chǎn)氣）2、不發(fā)酵乳糖，蔗糖，側(cè)金黃花醇3、多數(shù)產(chǎn)生H2S（+），不產(chǎn)靛基質(zhì)（-），不分解尿素（-），不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇（V—P）（-），4、能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽（+）5、在KCN培養(yǎng)基中生長（-），苯丙氨酸脫氨酸（-）第十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（四）、抗原結(jié)構(gòu)主要兩種：

A、O抗原

B、H抗原

C、表面抗原（K抗原）

D、菌毛抗原第十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三2、O抗原（1）O抗原的表示方法共有58種，用字母O和阿拉伯?dāng)?shù)字標(biāo)記：O1、O2、O3、O4如：傷寒桿菌：O9、O12第十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（2）沙門氏菌的分群及表示方法用大寫字母及相關(guān)符號表示：

A、B、C、D、E、F……Z、O51~O63、O65~O67第十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（3）沙門氏菌中的主要菌群及其群特異性抗原

A群----O2

B群----O4

C群----O6

C1群----O7、C2群----O6O8

、

C3群----O8、C4群----O6O7O14

D群----O9

F群----O11E群----O3E2群----O3、O10族

E3群----O3、O15E4群----O1、O3、O19第十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三3、H抗原（鞭毛抗原）

耐熱性差：60℃15′或酒精處理可破壞沙門氏H抗原有兩種：第1相：特異相，用英文小寫字母表示a、b、c……zz1~z55第2相：非特異相，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示1、2、3……其中也有用小寫字母a、n、x等表示。

第十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三4、表面抗原：

沙門氏菌有三種：Vi、M、5抗原、K抗原Vi抗原位于菌體的最表層，包圍了O抗原，可阻礙O抗原的血清學(xué)凝集試驗(yàn)。破壞Vi抗原：60℃30′，100℃5′含有Vi抗原的沙門氏菌：傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌

第二十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三三、沙門氏菌食物中毒

（一）、引起食物中毒最常見的沙門氏菌：鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌（二）、易引起沙門氏菌中毒的食品

肉、蛋、乳類食品行業(yè)關(guān)注：美國兩種花生醬含沙門氏菌

第二十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三(三)、中毒原因

1、食用病畜禽的肉制品食品

2、病畜禽、帶菌人和動物使食品受污染

3、用不潔凈水外理食品

第二十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（四）、臨床病狀（所致病菌）

1、腸熱?。簜c副傷寒病，為慢性發(fā)熱的菌血病。由傷寒與副傷寒菌引起，潛伏期7~20天2、急性腸胃類：主要癥狀：頭痛、發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹瀉、出冷汗、及全身不適，病程2~3天3、敗血?。焊邿⒑畱?zhàn)、厭食、局部發(fā)炎、由豬霍亂沙門氏菌等引起

第二十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三四、微生物檢驗(yàn)

（一）、基本步驟（程序）檢樣→增菌（前增菌）→分離培養(yǎng)→生化試驗(yàn)初步鑒定→血清學(xué)反應(yīng)最后鑒定→報(bào)告

第二十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三1、前增菌：用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的M恢復(fù)活力;2、選擇性增菌：使沙門氏菌優(yōu)勢繁殖，基它細(xì)菌變到抑制;3、選擇性平板分離培養(yǎng)：分離出所需的細(xì)菌;4、生化試驗(yàn)：鑒定分離出來的細(xì)菌是否符合所檢項(xiàng)目的細(xì)菌;5、血清學(xué)鑒定：進(jìn)一步鑒定。第二十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（二）、檢驗(yàn)操作關(guān)鍵點(diǎn)

1、增菌：使待檢菌復(fù)壯，抑制雜菌生長，提高檢出率。

前增菌：用于加工過的食品，37℃，4~8h或18~24h，長有雜菌。增菌培養(yǎng)基：增菌液一般用MM和SC兩種，如可能是傷寒沙門氏菌用TTB，用42℃培養(yǎng)。第二十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三2、平板分離

選擇性培養(yǎng)基：BS、DHL、HE、WS、SSBS中最好，DHL、HE、WS很好，SS最差一般要用：BS和WS/SS兩個平板，BS主要用于傷寒沙門氏菌的分離第二十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三BS上的菌落DHL上的菌落SS上的菌落第二十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三3、五項(xiàng)生化試驗(yàn)

H2S、靛基質(zhì)、PH7.2尿素酶、KCN、賴氨酸脫羧酶

第二十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（1）三糖鐵培養(yǎng)的培養(yǎng)典型沙門氏菌在三糖鐵培養(yǎng)上的特征：表面（-）粉紅色、底層（+）黃色、H2S（+）底層有黑色、有動力。在TSI培養(yǎng)基中：表面（+）黃色、H2S（-）的培養(yǎng)物可排除，其它培養(yǎng)物均有可能是沙門氏菌。第三十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三

（2）其余四項(xiàng)生化實(shí)驗(yàn)靛基質(zhì)PH7.2尿素酶KCN賴氨酸脫羧酶

反應(yīng)序號：A1、A2多見，B1少見

第三十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（3）、典型沙門氏菌的五項(xiàng)生化反應(yīng)及其檢驗(yàn)的利用A、典型五項(xiàng)生化反應(yīng)：A1

H2S（+）靛基質(zhì)（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）賴氨酸脫羧E（+）第三十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三B、利用五項(xiàng)生化反應(yīng)鑒定沙門氏菌的最簡單方案

a、對于H2S陽性菌，利用五項(xiàng)生化反應(yīng)試驗(yàn)可判別沙門氏菌和檸檬酸桿菌。b、對于H2S陰性菌，查到B1時(shí)即：H2S（-）靛基質(zhì)（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）賴氨酸脫羧E（+），補(bǔ)做ONPE試驗(yàn)，可判定沙門氏菌屬和埃希氏菌屬（ONPE（-）為沙門氏菌，ONPE（+）大腸艾希氏菌第三十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三5、血清學(xué)試驗(yàn)（最后鑒定）

（1）、沙門氏菌診斷血清的種類：

10種組合血清：主要用于傷寒和副傷寒沙門氏菌鑒定

26種組合血清：常見致病菌的定群與分型

57種組合血清：常見定型，初步鑒定A—F群以外的菌型144種組合血清：全套裝

第三十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（2）、血清學(xué)檢驗(yàn)步驟

抗原準(zhǔn)備→→

A—F多價(jià)血清檢驗(yàn)（判定是否是沙門氏菌）→→群特異性抗體血清（如O2、O4、O3、O7、O8、O9、O10、O11（判定O群別）→→O單因子血清檢查→

→H因子血清檢查（分型）→→報(bào)告

第三十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三五、檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告1、凡血清學(xué)鑒定與生化反應(yīng)均符合者，報(bào)告發(fā)現(xiàn)沙門氏菌。經(jīng)檢驗(yàn)，×××食品發(fā)現(xiàn)有沙門氏菌

2、凡血清學(xué)鑒定與生化反應(yīng)均不符合者，報(bào)告未發(fā)現(xiàn)沙門氏菌。

第三十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三思考題：1、典型沙門氏菌的五項(xiàng)生化試驗(yàn)結(jié)果如何？2、沙門氏菌的形態(tài)特征，培養(yǎng)特性是什么？3、沙門氏菌檢驗(yàn)時(shí)為什么要進(jìn)行前增菌和增菌？4、沙門氏菌有哪些抗原？各有何特點(diǎn)？O、H抗原如何表示，A—F群沙門氏菌中，代表每群O特異性抗原的獨(dú)特因子是什么？第三十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三5、沙門氏菌哪幾個菌型具有Vi抗原，Vi抗原對O抗原血清漣試驗(yàn)有何影響，對含Vi抗原菌，如何做O抗原血清學(xué)試驗(yàn)。6、沙門氏菌在SS平板，TSI培養(yǎng)基上生長的現(xiàn)象如何，說明其原理。7、分離純化后怎樣選用最少的生化試驗(yàn)方法初步鑒定檢驗(yàn)菌是否是沙門氏菌屬的細(xì)菌。8、如何進(jìn)行沙門氏菌的血清學(xué)試驗(yàn)。第三十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三第三節(jié)、志賀氏菌的檢驗(yàn)一、生物學(xué)特性（一）、形態(tài)與染色革蘭氏陰性短桿菌、無莢膜，無芽胞，無鞭毛

2~3um*0.5~0.7um第三十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（二）、培養(yǎng)特性1、需氧或兼氧性厭氧，最適溫度37℃，PH7.2~7.42、在普通瓊脂和SS平板上，能形成圓形、微凸、光滑濕潤、無色半透明、邊緣整齊、在中等大小的菌落3、宋氏志賀氏菌菌落較大，較不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可遲發(fā)酵乳糖，菌落呈玫瑰紅色。4、在肉湯中呈均勻混濁生長，無菌膜。

第四十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（三）、生化反應(yīng)1、發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，除宋氏志賀氏菌外，均不發(fā)酵乳糖。2、不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、肌醇、水楊苷。3、不產(chǎn)生H2S，不分解尿素，V-P試驗(yàn)陰性，不能利用檸檬酸鹽。4、甲基紅陽性。第四十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（四）、抗原結(jié)構(gòu)1、抗原構(gòu)成：O抗原：群特異性抗原：A、B、C、DK抗原：除B群外，一般有K抗原第四十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三2、志賀氏菌的分群與血清型志賀氏菌分為四群：A群（痢疾志賀氏菌）：1~10型

B群（福氏志賀氏菌）：1~6型+X、Y兩個變種，C群（鮑氏志賀氏菌）：1~15型D群（宋內(nèi)氏志賀氏菌）

：1個型第四十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三志賀氏菌屬抗原的分類菌名

血清分類生化特性群型亞型甘露醇鳥氨酸脫羧酶志賀氏菌A1～10

－-福氏菌B1～6x、y變種1a、1b、2a、2b、3a、3b3c、4a、4b+-鮑氏菌C1～15

+-宋內(nèi)氏菌D1

+＋第四十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三葡萄糖+乳糖-甘露醇-痢疾志賀氏菌1、3、4、5、6、9、10型痢疾志賀氏菌2、7、8型福氏6型，鮑氏1、2、3、4、5、6、8、10、12、14型福氏痢疾菌（1、2、3、4、5型）鮑氏5、7、9、11、13、15型靛基質(zhì)-乳糖+宋氏志賀氏菌

靛基質(zhì)-靛基質(zhì)+靛基質(zhì)-靛基質(zhì)+甘露醇+第四十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三3、屬內(nèi)外抗原關(guān)系（1）群內(nèi)抗原關(guān)系：

A群：2與10型，具有密切關(guān)系

C群：1與4和11型，10與11相關(guān)

B群：群抗原是B群各型之間的共同抗原（2）群間抗原關(guān)系：

C群17型與A群3型相關(guān)

C群18型與A群11型相關(guān)第四十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（3）屬外抗原關(guān)系：

志賀氏菌與艾希氏菌屬的O抗原關(guān)系非常密切，除A群9型和D群宋氏菌與埃氏希菌的O抗原關(guān)系未見報(bào)道外，每一個型都與一定的艾希氏菌的O抗原有關(guān)。第四十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三4、K抗原對O抗原血清學(xué)試驗(yàn)的影響

可阻礙O抗原的血清學(xué)凝集試驗(yàn)，煮沸處理即可。

第四十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（五）志賀氏菌的抵抗力志賀氏菌屬在外界環(huán)境中的生存力，以宋內(nèi)氏最強(qiáng)，福氏菌次之，志賀氏菌最弱。一般在潮濕土壤中能存活34天，37℃水中存活20天，在糞便內(nèi)（室溫）存活11天。日光直接照射30分鐘，56-60℃10分即被殺死，對高溫和化學(xué)消毒劑很敏感，1%石炭酸中15-30分鐘即被殺死，對氯霉素、磺胺類、鏈霉素敏感，但易產(chǎn)生耐藥性。

第四十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三二、志賀氏菌的致病性與食物中毒（一）流行病學(xué)第五十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三傳染源食物、病人、糞便、蒼蠅等第五十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（二）志賀氏菌的致病性致病因素：侵襲力、菌體內(nèi)毒素、外毒素第五十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（二）臨床癥狀A(yù)、急性細(xì)菌性痢疾：急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢。

B、慢性細(xì)菌性痢疾：慢性遷延型、慢性隱伏型、慢性急性發(fā)作型。第五十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三三、微生物檢驗(yàn)

（一）檢驗(yàn)步驟（程序）檢樣→樣品處理→增菌培養(yǎng)→SS、EMB平板分離培養(yǎng)→初步生化鑒定→最后血清學(xué)鑒定→報(bào)告第五十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三（二）檢驗(yàn)操作要點(diǎn)志賀氏菌在常溫中生存的時(shí)間較短，應(yīng)盡快進(jìn)行試驗(yàn)。如24h內(nèi)不能檢驗(yàn)，樣品應(yīng)在冰箱內(nèi)長時(shí)間不能檢驗(yàn)，放在低溫冰箱內(nèi)。

第五十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三1、增菌培養(yǎng)培養(yǎng)基：GN增菌液在36±1℃6—8h，當(dāng)培養(yǎng)液出現(xiàn)輕微混濁即中止培養(yǎng)。第五十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三2、分離培養(yǎng)

強(qiáng)選擇性平板：SS或HE、WS弱選擇性平板：EMB或麥康數(shù)在工作中36±1℃培養(yǎng)18—24h，菌落特征：無色透明，中等大小，光滑圓形菌落。第五十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三HE平板原理及反應(yīng)

發(fā)酵乳糖的某種腸桿菌不發(fā)酵乳糖的某種腸道菌，而且產(chǎn)生硫化氫，可能是沙門氏菌不發(fā)酵乳糖的腸道菌，可能就是志賀氏菌第五十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三SS平板原理及反應(yīng)SSAgar(SalmonellaShigellaAgar)大腸桿菌或者別的發(fā)酵乳糖的腸桿菌是沙門氏菌。有黑色中心。如果沒有黑色中心，就很可能是志賀氏菌了第五十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三麥康凱瓊脂平板

第六十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三EMB平板照片及原理

第六十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三3、初步生化鑒定

從平板上挑取3—4個可疑菌落，接種于TSI和葡萄糖半固體培養(yǎng)基各一管，36℃，18—24h，第六十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)的原理2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌

葡萄糖半固體原理及結(jié)果。OrganismTestResult

1.Pseudomonasaeruginosa（銅綠假單胞菌）：Motile

2.Staphylococcusaureus：Non-motile

3.Bacillussubtilis：Motile第六十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期三志賀氏菌在TSI生長的結(jié)果（現(xiàn)象）：（1）斜面產(chǎn)堿仍