BLOTHP幽門螺桿菌抗體分型演示文稿

BLOTHP幽門螺桿菌抗體分型演示文稿當(dāng)前1頁，總共42頁。BLOTHP幽門螺桿菌抗體分型當(dāng)前2頁，總共42頁。幽門螺桿菌（H.pylori）1982年澳大利亞學(xué)者M(jìn)arshall和Warren從胃黏膜中分離出Hp常見于人的胃竇和幽門部位可通過一端多條鞭毛移動(dòng)是一種革蘭氏陰性螺旋菌分泌高活性的尿素酶和過氧化氫酶VacA、CagA導(dǎo)致宿主的炎癥反應(yīng)當(dāng)前3頁，總共42頁。Marshall和Warren1979年根據(jù)活組織切片檢查結(jié)果，Warren發(fā)現(xiàn)50%左右的病人的胃腔下半部分附生著許多微小的、彎曲狀的細(xì)菌。Warren的發(fā)現(xiàn)引來了同行的質(zhì)疑，但也引起了Marshall的極大興趣，他們決定聯(lián)合對(duì)取自100個(gè)病人的活組織切片進(jìn)行研究。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，Marshall成功地培育出一種當(dāng)時(shí)尚不為人知曉的細(xì)菌——后來被命名為幽門螺桿菌。基于試驗(yàn)結(jié)果，Marshall和Warren認(rèn)為，幽門螺桿菌是導(dǎo)致胃炎、十二指腸潰瘍或胃潰瘍的關(guān)鍵因素。發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌，使胃炎、十二指腸潰瘍或胃潰瘍的診斷治療變得及其簡(jiǎn)單。當(dāng)前4頁，總共42頁。偉大的發(fā)現(xiàn)1983年Marshall寫論文投給某雜志，但遭到編輯部的拒絕：“我們需要56篇文章，而你是第67篇。1984年7月，Marshall決定用自己的胃做實(shí)驗(yàn)，他把60毫升的幽門螺桿菌培養(yǎng)液喝了下去！14天后，馬歇爾出現(xiàn)了明顯的惡心、嘔吐癥狀，10天后的胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)他確實(shí)患了胃炎。當(dāng)前5頁，總共42頁。2005年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)2005年10月3日，瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院宣布，把2005年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予澳大利亞科學(xué)家BarryJ.Marshall和J.RobinWarren，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致胃炎和胃潰瘍的細(xì)菌-幽門螺桿菌。諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)在授獎(jiǎng)詞中說，由于BarryJ.Marshall和J.RobinWarren的發(fā)現(xiàn)，使得原本慢性的、經(jīng)常無藥可救的胃潰瘍變成了只需抗生素和一些其他藥物短期就可治愈的疾病。當(dāng)前6頁，總共42頁。幽門螺桿菌與消化道疾病慢性胃炎消化性潰瘍胃癌MALT淋巴瘤12431994年世界衛(wèi)生組織（WHO）把Hp歸為一級(jí)致癌物當(dāng)前7頁，總共42頁。內(nèi)窺鏡診斷當(dāng)前8頁，總共42頁。傳播途徑

幽門螺桿菌能在人體內(nèi)生長(zhǎng)、繁殖，又能通過糞便及唾液排出體外，人是幽門螺桿菌的傳染源。它通過口－口傳播、糞一口傳播、經(jīng)內(nèi)窺鏡傳播或密切接觸等方式進(jìn)行傳播。當(dāng)前9頁，總共42頁。內(nèi)科學(xué)(p.380)幽門螺桿菌作為慢性淺表性胃炎最主要病因的確立基于如下證據(jù)：1，絕大多數(shù)慢性活動(dòng)性胃炎患者胃粘膜中可檢出幽門螺桿菌；2，幽門螺桿菌在胃內(nèi)的分布與胃內(nèi)炎癥分布一致；3，根除幽門螺桿菌可使胃粘膜炎癥消退；4，從志愿者和動(dòng)物模型中可復(fù)制幽門螺桿菌感染引起的慢性胃炎?！?幽門螺桿菌通過上述產(chǎn)氨作用、分泌空泡毒素A（VacA)等物質(zhì)而引起細(xì)胞損害；其細(xì)胞毒素相關(guān)基因（CagA)蛋白能引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)；其菌體胞壁還可作為抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。這些因素的長(zhǎng)期存在導(dǎo)致胃粘膜的慢性炎癥。當(dāng)前10頁，總共42頁。Maastricht1-1995年觀點(diǎn)強(qiáng)烈地建議治療消化道潰瘍疾病消化道出血性潰瘍低級(jí)別胃粘膜相關(guān)淋巴瘤有嚴(yán)重反常的胃炎胃癌切除術(shù)之后早期當(dāng)前11頁，總共42頁。亞太地區(qū)共識(shí)-1997年觀點(diǎn)推薦指征:

消化道潰瘍疾病

潰瘍出血或穿孔

伴有潰瘍和消化不良病史,NSAID治療早期胃癌切除術(shù)低級(jí)別胃粘膜相關(guān)淋巴瘤

胃癌家族史

消化不良（檢測(cè)到Hp）當(dāng)前12頁，總共42頁。Maastricht2-2000年觀點(diǎn)強(qiáng)烈建議治療

DU/GU(活動(dòng)的或不活動(dòng)，包括PUD)

胃粘膜相關(guān)淋巴瘤萎縮性胃炎胃癌切除術(shù)后GC病人的直系親屬病人的要求當(dāng)前13頁，總共42頁。Maastricht3-2005年觀點(diǎn)對(duì)于檢測(cè)準(zhǔn)確性高的可以確認(rèn)Hp感染的血清學(xué)檢測(cè)方法，可以用于Hp現(xiàn)癥感染的檢測(cè)當(dāng)前14頁，總共42頁。中國(guó)廬山共識(shí)-2007年觀點(diǎn)幽門螺桿菌根治適應(yīng)證：消化性潰瘍胃粘膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤慢性胃炎伴胃粘膜萎縮、糜爛慢性胃炎伴消化不良癥狀………個(gè)人要求治療當(dāng)前15頁，總共42頁。亞洲HP的流行病學(xué)當(dāng)前16頁，總共42頁。中國(guó)的HP流行病學(xué)華東地區(qū)--------59.36%華南地區(qū)----------50.08%58.27%--------華西地區(qū)華北地區(qū)---------46.84%華中地區(qū)-------------66.26%參考：張萬岱，胡伏蓮等.中國(guó)自然人群幽門螺桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查.，2006當(dāng)前17頁，總共42頁。HP檢測(cè)的方法侵入性方法（依賴胃鏡活檢）非侵入性方法（不依賴內(nèi)徑檢查）快速尿素酶試驗(yàn)（RUT）13C或14C尿素酶呼氣試驗(yàn)（UBT）病理切片染色糞便Hp抗原檢測(cè)（HpSA)細(xì)菌培養(yǎng)血清和分泌物抗體檢測(cè)基因檢測(cè)（PCR等）基因芯片，蛋白芯片檢測(cè)等當(dāng)前18頁，總共42頁。HP檢測(cè)方法的比較能不需要數(shù)小時(shí)取血WBT否酶標(biāo)儀數(shù)小時(shí)取血ELISA否不需要數(shù)分鐘取血金標(biāo)法否質(zhì)譜儀或放射性物質(zhì)檢測(cè)儀數(shù)小時(shí)吹氣UBT否PCR檢測(cè)設(shè)備數(shù)小時(shí)胃鏡PCR否不需要數(shù)分鐘胃鏡尿素酶法否Hp培養(yǎng)設(shè)備數(shù)天胃鏡細(xì)菌培養(yǎng)否病理檢查設(shè)備數(shù)小時(shí)胃鏡組織學(xué)法能否分型輔助設(shè)備所需時(shí)間取材方式方法當(dāng)前19頁，總共42頁。小結(jié)HP和消化道疾病密切相關(guān)，檢測(cè)很重要中國(guó)健康人群HP感染率59%，檢測(cè)量很大目前主流的呼氣試驗(yàn)和血清抗體檢測(cè)，沒有檢測(cè)毒性當(dāng)前20頁，總共42頁。幽門螺桿菌的致病機(jī)制

HP基因多態(tài)性是造成HP感染后不同臨床結(jié)局主要的原因，現(xiàn)在認(rèn)為與空泡毒素A（VacA）基因和細(xì)胞毒相關(guān)基因（CagA）及其基因表達(dá)的蛋白質(zhì)與致病有關(guān)。

VacA和CagA蛋白是HP毒素的主要標(biāo)志。部分革蘭陰性和陽性致病菌的染色體上毒力因子基因的特殊區(qū)域稱為“致病島”。CagA致病島是HP的主要毒力因子。CagA基因序列的拓展研究發(fā)現(xiàn)，CagA是Cag致病島中基因之一，CagE是誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生白介素8（IL）的主要基因，IL是誘發(fā)胃黏膜炎癥的主要細(xì)胞因子。當(dāng)前21頁，總共42頁。HP毒力因子空泡毒素（VacA）：是HP分泌的一種蛋白毒素，可引起作用的靶細(xì)胞發(fā)生空泡化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架重排、甚至細(xì)胞死亡等形態(tài)學(xué)改變，是HP重要的毒力因子。細(xì)胞毒素(CagA)：雖不直接介導(dǎo)毒素活性，但與空泡毒素（VacA）的表達(dá)密切相關(guān)，常與空泡毒素（VacA）同時(shí)存在，故將其命名為HP細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白簡(jiǎn)稱CagA。CagA可能與VacA的轉(zhuǎn)錄、折疊運(yùn)轉(zhuǎn)及功能有關(guān)，CagA可導(dǎo)致宿主出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。尿素酶（Urease）：幽門螺桿菌能夠在胃里生存只要依靠尿素酶。尿素酶可以分解產(chǎn)生的氨，使細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙，并出現(xiàn)病理性改變。當(dāng)前22頁，總共42頁。HP分型的定義Ⅰ型：產(chǎn)細(xì)胞毒素HP菌株，其檢出率約占總HP感染的50％～60％。這類菌株感染能使胃上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡、變形和損害，引起潰瘍和誘發(fā)癌變。Ⅱ型：不產(chǎn)生細(xì)胞毒素的HP，即：CagA(-)和VacA(-)，這一類HP菌株毒性較小，感染后一般僅引起慢性淺表性胃炎而無臨床癥狀。

當(dāng)前23頁，總共42頁。HP分型的臨床意義

HP分型能為臨床開展“選擇性根治”提供了重要的實(shí)驗(yàn)診斷依據(jù)。對(duì)于感染了HP的上消化道疾病患者，應(yīng)引起臨床醫(yī)師的足夠重視，進(jìn)行毒力分型檢測(cè)，幫助制定根除HP、胃鏡及病理檢查隨訪的診療計(jì)劃，利于胃癌的預(yù)防并合理節(jié)約醫(yī)療資源。Ⅰ型：產(chǎn)細(xì)胞毒素HP菌株，其檢出率約占總HP感染的50％～60％。這類菌株感染能使胃上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡、變形和損害，引起潰瘍和誘發(fā)癌變。Ⅱ型：不產(chǎn)生細(xì)胞毒素的HP，即：CagA(-)和VacA(-)，這一類HP菌株毒性較小，感染后一般僅引起慢性淺表性胃炎而無臨床癥狀。Ⅰ型的HP感染者中的胃癌和潰瘍的患病率顯著高于Ⅱ型HP的感染者，說明Ⅰ型HP感染可能更易導(dǎo)致較為嚴(yán)重的上消化道疾患，如潰瘍或癌腫。因此，Ⅰ型HP感染患者有必要進(jìn)行根除治療

當(dāng)前24頁，總共42頁。HP分型的治療建議有癥狀Ⅰ型感染Ⅱ型感染無癥狀需治療個(gè)人意愿不需治療胃鏡檢查當(dāng)前25頁，總共42頁。李兆申上海政府網(wǎng)站截圖當(dāng)前26頁，總共42頁。2007國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)上海長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科李兆申教授等篩選出幽門螺桿菌(Hp)的重要致病因子——細(xì)胞毒素相關(guān)抗原(CagA)和空泡變性細(xì)胞毒素(VacA)。研究者還提出Hp毒力存在差異的新理論,并應(yīng)用Hp重組CagA建立檢測(cè)CagA的血清學(xué)方法,研制相關(guān)的檢測(cè)試劑盒。相關(guān)成果日前獲得2007年度國(guó)家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步二等獎(jiǎng)。

李教授介紹,該項(xiàng)目針對(duì)Hp毒力因子眾多、致病機(jī)制復(fù)雜、臨床診斷有待規(guī)范等問題,開展了大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查,篩選出Hp兩個(gè)重要致病因子——CagA和VacA,同時(shí)證明了CagA是導(dǎo)致消化性潰瘍發(fā)生的關(guān)鍵因子,也是胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。研究小組發(fā)現(xiàn),Hp中國(guó)菌株的CagA、VacA和致病島陽性率高、毒力強(qiáng),闡明了Hp的“中國(guó)特色”。研究者還提出Hp分類學(xué)說,認(rèn)為Hp菌株分為有毒株(CagA、VacA陽性)和無毒株(CagA、VacA陰性)。該學(xué)說得到學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)同,被SCI他引407次。

該項(xiàng)目研究人員采用Hp重組CagA建立了檢測(cè)Hp的血清學(xué)方法,并研制出可同時(shí)檢測(cè)血清CagA、VacA和尿素酶抗體的免疫印跡診斷試劑盒,可判斷Hp毒力。該技術(shù)可覆蓋國(guó)內(nèi)95%以上的臨床檢測(cè)需要和科研需求。同時(shí),研究人員根據(jù)Hp毒力進(jìn)行選擇性根治,將已有的Hp根治方案進(jìn)行優(yōu)化,增強(qiáng)了治療的針對(duì)性和有效性,節(jié)約了醫(yī)療資源。（中國(guó)醫(yī)學(xué)論壇報(bào)）當(dāng)前27頁，總共42頁。深圳市伯勞特公司國(guó)內(nèi)剛剛拿到、唯一有產(chǎn)品注冊(cè)證的幽門螺桿菌分型檢測(cè)試劑盒生產(chǎn)商當(dāng)前28頁，總共42頁。研發(fā)過程2000年7月獲得中檢所新生物制品審評(píng)檢驗(yàn)報(bào)告2002年5月上海醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心的注冊(cè)檢驗(yàn)2002年7月瑞金醫(yī)院的臨床試驗(yàn)報(bào)告2002年7月長(zhǎng)寧區(qū)中心醫(yī)院的臨床試驗(yàn)報(bào)告2002年8月上海市藥監(jiān)局頒發(fā)醫(yī)療器械注冊(cè)證2003年12月國(guó)家藥監(jiān)局頒發(fā)醫(yī)療器械注冊(cè)證2005年6月和2007月7月北京醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心的注冊(cè)檢驗(yàn)2007年12月獲得國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。2010年1月完成上海長(zhǎng)海醫(yī)院、青海省人民醫(yī)院和吉林大學(xué)中日友誼醫(yī)院臨床試驗(yàn)。2010年3月獲得中國(guó)藥品生物制品檢定所注冊(cè)檢驗(yàn)報(bào)告2011年7月獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局產(chǎn)品注冊(cè)證當(dāng)前29頁，總共42頁。獲獎(jiǎng)證書當(dāng)前30頁，總共42頁。免疫印跡法背景介紹免疫印跡技術(shù)：它與內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和PCR基因擴(kuò)增技術(shù)一起，在上世紀(jì)做為分子生物學(xué)領(lǐng)域三大發(fā)現(xiàn)之一。給人類生物工程帶來了革命性進(jìn)展?；驹恚簩⑻崛〉牡鞍谆旌衔锵冗M(jìn)行SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)按照分子量大小不同分離然后再轉(zhuǎn)印至印跡膜，顯色后按照顯色帶位置不同判斷分子量多少和所含蛋白質(zhì)數(shù)量，稱為Southernblot。其制造主要有三個(gè)工序：將蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳按分子量大小不同依次分離；將分離的組分轉(zhuǎn)印到印跡膜上；對(duì)轉(zhuǎn)印到印跡膜的蛋白成分進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。當(dāng)前31頁，總共42頁。免疫印跡檢測(cè)原理本產(chǎn)品是將CagA、VacA的菌體抗原利用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白按分子量大小不同依次分開，再轉(zhuǎn)印至印跡膜上。采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)技術(shù)，如果被檢者血清有相應(yīng)抗體則在抗原的相應(yīng)位置出現(xiàn)顯色區(qū)帶，根據(jù)條帶顯色位置判斷被檢血清中各種HP抗體。

由抗體出現(xiàn)的種類不同推斷HP類型，再根據(jù)顯色帶的強(qiáng)弱、消長(zhǎng)可觀察治療效果，預(yù)測(cè)潰瘍有無復(fù)發(fā)的可能性。當(dāng)前32頁，總共42頁。反應(yīng)過程當(dāng)前33頁，總共42頁。實(shí)驗(yàn)材料蒸餾水1000ul可調(diào)加樣槍一支10ul加樣槍一支吸嘴500ml帶蓋瓶搖床一臺(tái)當(dāng)前34頁，總共42頁。操作步驟在量杯中將濃縮洗滌液用蒸餾水按1：10的比例稀釋成洗滌應(yīng)用液。每槽加入洗滌液1ml，再加待測(cè)血清或全血10ul，放在搖床上搖動(dòng)30分鐘。取出反應(yīng)槽，棄去槽中液體，并在平鋪的紙巾上將其倒置經(jīng)磕以拍干剩余液體，每槽加入洗滌液1ml，搖動(dòng)洗滌1分鐘，棄去槽中液體，并在平鋪的紙巾上將其倒置經(jīng)磕以拍干剩余液體，重復(fù)洗滌3次；每槽加入洗滌應(yīng)用液500ul，再加酶聯(lián)試劑10ul，放在搖床上搖動(dòng)30分鐘。同（

3）洗滌3次。加顯色劑0.5ml，5分鐘后觀察結(jié)果。待質(zhì)控帶和陽性帶顯色清晰，棄去槽內(nèi)液體，用流水（自來水或蒸餾水）沖洗后取出印跡膜，等干后對(duì)比《標(biāo)準(zhǔn)帶》判斷結(jié)果。當(dāng)前35頁，總共42頁。結(jié)果判斷當(dāng)前36頁，總共42頁。判斷標(biāo)準(zhǔn)CagA抗體+-VacA抗體+-UreA抗體+-UreB抗體+-1、質(zhì)控帶未出現(xiàn)：表示本次試驗(yàn)無效