菌種擴(kuò)大培養(yǎng)修改

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)修改演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共58頁(yè)。（優(yōu)選）菌種擴(kuò)大培養(yǎng)修改當(dāng)前2頁(yè)，總共58頁(yè)。第一節(jié)、概述第二節(jié)、種子制備的一般流程第三節(jié)、菌種生物活性檢測(cè)第四節(jié)、實(shí)驗(yàn)室種子擴(kuò)大培養(yǎng)第五節(jié)、種子質(zhì)量控制措施

主要內(nèi)容

當(dāng)前3頁(yè)，總共58頁(yè)。第一節(jié)、概述1、定義：菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)就是把保藏的菌種，即砂土管，冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化，再經(jīng)過茄氏瓶和種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，滿足發(fā)酵所需種子的數(shù)量和質(zhì)量的純種培養(yǎng)過程。這些純種的培養(yǎng)物稱為種子。

當(dāng)前4頁(yè)，總共58頁(yè)。2、目前的發(fā)展趨勢(shì)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)與發(fā)酵相分離——種子生產(chǎn)形成工業(yè)化：酒精工業(yè)釀造工業(yè)生物轉(zhuǎn)化某些特除代謝物菌體細(xì)胞固定化發(fā)酵無(wú)細(xì)胞發(fā)酵體系當(dāng)前5頁(yè)，總共58頁(yè)。

目的：1）.生理適應(yīng)：讓菌種從固體試管、液體試管……，逐步適應(yīng)發(fā)酵罐的要求。如：啤酒酵母

2）.質(zhì)量滿足：提供大量而新鮮的、具有較高活力的菌種。a、縮短發(fā)酵周期、降低能耗、減少染菌的機(jī)會(huì)b、為了使培養(yǎng)菌在數(shù)量上取得絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，抑制雜菌的生長(zhǎng)。3).可以提高生產(chǎn)的成功率，減少“倒罐”現(xiàn)象。要求：純種。3、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的及要求：當(dāng)前6頁(yè)，總共58頁(yè)。

4.作為種子必備的條件：1）生命旺盛有活力，移種后，能迅速生長(zhǎng)，縮短延滯期。2）菌體總量適宜，保證發(fā)酵罐的接種量。3）遺傳表現(xiàn)性要穩(wěn)定；4）菌種要純。無(wú)雜菌污染。5）保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力返回當(dāng)前7頁(yè)，總共58頁(yè)。第二節(jié)、從保存菌種到生產(chǎn)用種子的一般流程當(dāng)前8頁(yè)，總共58頁(yè)。確定流程的原則：1、保證發(fā)酵罐的菌種質(zhì)和量；2、盡量縮短流程、以防治染菌?？紤]因素：1、發(fā)酵罐的體積2、菌種的特性3、工藝上菌種量的要求當(dāng)前9頁(yè)，總共58頁(yè)。主要步驟菌種生物活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室種子制備階段：瓊脂斜面至固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)（如茄子瓶斜面培養(yǎng)等或液體搖瓶培養(yǎng)）生產(chǎn)車間種子制備階段：種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)返回當(dāng)前10頁(yè)，總共58頁(yè)。第二節(jié)、菌種生物活性檢測(cè)返回當(dāng)前11頁(yè)，總共58頁(yè)。第三節(jié)、實(shí)驗(yàn)室種子擴(kuò)大培養(yǎng)一、固體種子制備二、液體種子制備當(dāng)前12頁(yè)，總共58頁(yè)。概念：種子罐的級(jí)數(shù)：種子在種子罐中擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。發(fā)酵罐的級(jí)數(shù)：種子罐數(shù)加一。接種量：是指移入的種子液體體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例?；蛞迫氲姆N子液體積占接種前培養(yǎng)液體積的百分?jǐn)?shù)。種齡：生產(chǎn)種子時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。孢子制備：用固體培養(yǎng)的種子叫孢子制備。種子制備：用液體培養(yǎng)的種子叫種子制備。當(dāng)前13頁(yè)，總共58頁(yè)。種子制備的工藝流程通常有兩種方法：固體法：用于釀造業(yè)（醬油、白酒等），也是源于釀造業(yè)，有霉菌的純培養(yǎng)，也有混合培養(yǎng)如：大曲液體法：液體深層培養(yǎng)，適合于眾多發(fā)酵行業(yè)液體培養(yǎng)為主導(dǎo)方式。當(dāng)前14頁(yè)，總共58頁(yè)。斜面孢子孢子米粒孢子種曲菌體一、固體菌種（一）固體菌種制備當(dāng)前15頁(yè)，總共58頁(yè)。1、斜面菌種的制備定義：在試管或扁瓶（茄子瓶）內(nèi)，以瓊脂固化的培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的菌種培養(yǎng)物。斜面種子制備流程：培養(yǎng)基→分裝→滅菌→冷卻→擺斜面→接種恒溫培養(yǎng)→斜面種子制備中應(yīng)注意的問題：1、瓊脂的用量2、裝量3、減少冷凝水4、不含有沉淀的固體物，用蒸餾水或去離子水5、微量元素先配成一定的，用移液管定量加入當(dāng)前16頁(yè)，總共58頁(yè)。2、米粒孢子（米孢子）

米孢子：霉菌的孢子培養(yǎng)，接種到滅菌后的大米或小米顆粒上，恒溫培養(yǎng)一段時(shí)間后所產(chǎn)生的孢子。優(yōu)點(diǎn)：⑴保存期較長(zhǎng)，可用半年以上。⑵孢子量大，107-108個(gè)孢子/g米粒。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：1.無(wú)雜菌污染，每500瓶抽樣檢查1-2瓶；2.足夠孢子數(shù)，發(fā)芽率80%；3.生產(chǎn)能力高；4.真空干燥后含水率小于8%；當(dāng)前17頁(yè)，總共58頁(yè)。大米或小米↓水洗↓瀝干↓分裝↓混勻↓滅菌↓接種（搖勻）↓培養(yǎng)↓米孢子制備工藝流程：斜放，且搖翻動(dòng)注意事項(xiàng)：1、浸泡時(shí)間及加營(yíng)養(yǎng)液的量應(yīng)掌握在滅菌后米粒熟透而不粘連。2、分裝量2-3厘米厚度3、米粒不要碰在瓶口4、前期搖動(dòng)，后期不要再動(dòng)5、米粒可存放半年，冰箱4℃、真空干燥蠟封。無(wú)菌蒸餾水↓斜面孢子↓孢子懸浮液當(dāng)前18頁(yè)，總共58頁(yè)。3、種曲培養(yǎng)材料：麩皮、米糠、木屑、稻殼等檸檬酸、醬油、醋、糖化酶放線菌孢子的制備：瓊脂斜面培養(yǎng)基，碳源和氮源不要太豐富，干燥和限制營(yíng)養(yǎng)可誘發(fā)孢子形成。培養(yǎng)溫度28℃，少數(shù)37℃；培養(yǎng)時(shí)間5-14天。霉菌孢子的制備：一般采用米孢子或種曲，培養(yǎng)溫度25℃-28℃，培養(yǎng)時(shí)間4-14天。細(xì)菌孢子的制備：瓊脂斜面培養(yǎng)基，碳源限量而氮源豐富的配方，牛肉膏、蛋白胨。培養(yǎng)溫度37℃，少數(shù)28℃；培養(yǎng)時(shí)間一般1-2天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌5-10天。當(dāng)前19頁(yè)，總共58頁(yè)。（二）、固體種子質(zhì)量控制措施影響孢子以及斜面質(zhì)量的因素及控制影響孢子質(zhì)量的因素通常有：原材料的質(zhì)量滅菌條件培養(yǎng)條件培養(yǎng)時(shí)間冷藏時(shí)間接種量有害氣體和揮發(fā)物當(dāng)前20頁(yè)，總共58頁(yè)。

1、原材料的質(zhì)量麩皮：蛋白胨：無(wú)機(jī)離子含量不同：微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會(huì)影響孢子的質(zhì)量。水質(zhì)的影響菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。當(dāng)前21頁(yè)，總共58頁(yè)。解決措施（1）培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗(yàn)合格才可使用；（2）嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；（3）斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時(shí)間；（4）供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源。當(dāng)前22頁(yè)，總共58頁(yè)。2、培養(yǎng)條件（1）溫度（2）濕度（培養(yǎng)基內(nèi)濕度，培養(yǎng)基外濕度）不同相對(duì)濕度對(duì)龜裂鏈霉菌斜面生長(zhǎng)的影響當(dāng)前23頁(yè)，總共58頁(yè)。

3、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間（1）培養(yǎng)時(shí)間解決措施：孢子培養(yǎng)的時(shí)間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。（2）冷藏時(shí)間冷藏時(shí)間對(duì)孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如慶大霉素生產(chǎn)中，孢子4℃冷藏15天，發(fā)酵單位比不冷藏的提高12－14％，孢子在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6℃冷藏兩個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏一個(gè)月降低18%，冷藏3個(gè)月后降低35%。當(dāng)前24頁(yè)，總共58頁(yè)。接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進(jìn)而影響菌體的生理狀況。當(dāng)前25頁(yè)，總共58頁(yè)。二次生長(zhǎng)

孢子斜面制備過程中由于營(yíng)養(yǎng)過于豐富，或者濕度過大引起斜面上剛長(zhǎng)出的孢子萌發(fā)形成菌絲體。同步生長(zhǎng)(synchronousculture)：同步培養(yǎng)是一種培養(yǎng)方法，它能使群體中不同步的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成能同時(shí)進(jìn)行生長(zhǎng)或分裂的群體細(xì)胞。以同步培養(yǎng)方法使群體細(xì)胞能處于同一生長(zhǎng)階段，并同時(shí)進(jìn)行分裂的生長(zhǎng)方式稱為同步生長(zhǎng)。通過同步培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞被稱為同步細(xì)胞或同步培養(yǎng)物。當(dāng)前26頁(yè)，總共58頁(yè)。

二、液體種子制備——好氧培養(yǎng)對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。其過程如下：試管→三角瓶→搖床→種子罐當(dāng)前27頁(yè)，總共58頁(yè)。

液體種子培養(yǎng)——厭氧培養(yǎng)

對(duì)于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其種子的制備過程如下：試管→三角瓶→卡式罐→種子罐當(dāng)前28頁(yè)，總共58頁(yè)。制備過程中注意事項(xiàng)：⑴營(yíng)養(yǎng)比斜面要豐富，保持pH穩(wěn)定⑵裝量要適當(dāng)，保持良好的通氣；好氧培養(yǎng)三角瓶40-50mL/250mL、60~80mL/500mL、90-110mL/750mL、120-150mL/1000mL。厭氧培養(yǎng)時(shí)裝液量增加一倍。⑶滅菌時(shí)要注意棉塞不要被打濕。⑷搖床轉(zhuǎn)速。⑸注意搖床上下、邊緣、中心的溫差。當(dāng)前29頁(yè)，總共58頁(yè)。三、實(shí)驗(yàn)室菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)污染,菌落形態(tài)一致。性能穩(wěn)定當(dāng)前30頁(yè)，總共58頁(yè)。實(shí)例：生產(chǎn)啤酒的酵母菌制作返回當(dāng)前31頁(yè)，總共58頁(yè)。實(shí)驗(yàn)室制備的孢子斜面或搖瓶種子移接到種子罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)作用①、使菌種獲得足夠的數(shù)量，②、種子罐中的培養(yǎng)基更接近發(fā)酵罐培養(yǎng)的醪液成分和培養(yǎng)條件，譬如通無(wú)菌空氣，攪拌形式等等，以使菌體適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境

③、使孢子發(fā)芽，生長(zhǎng)繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長(zhǎng)。

第四節(jié)、生產(chǎn)車間種子制備當(dāng)前32頁(yè)，總共58頁(yè)。當(dāng)前33頁(yè)，總共58頁(yè)。當(dāng)前34頁(yè)，總共58頁(yè)。當(dāng)前35頁(yè)，總共58頁(yè)。1、種子罐接種常用接種方法火圈保護(hù)法壓差法接種當(dāng)前36頁(yè)，總共58頁(yè)。當(dāng)前37頁(yè)，總共58頁(yè)。2、種子罐級(jí)數(shù)確定種子罐級(jí)數(shù)的因素：

（1）菌種生長(zhǎng)特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；（2）所采用發(fā)酵罐的容積。確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問題（1）種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡(jiǎn)化工藝和控制，減少染菌機(jī)會(huì)（2）種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會(huì)（3）雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級(jí)數(shù)當(dāng)前38頁(yè)，總共58頁(yè)。細(xì)菌：生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長(zhǎng)較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵孢子懸浮液→一級(jí)種子罐（27℃,40小時(shí)孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級(jí)種子罐（27℃，10~24小時(shí)，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐放線菌：生長(zhǎng)更慢，采用四級(jí)發(fā)酵酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用二級(jí)種子當(dāng)前39頁(yè)，總共58頁(yè)。3、影響種子罐種子質(zhì)量的因素1、培養(yǎng)基：逐步接近發(fā)酵培養(yǎng)基2、培養(yǎng)條件：溫度、溶氧3、種齡：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌絲細(xì)菌霉菌放線菌7-24h16-50h21-64h.4、接種量；當(dāng)前40頁(yè)，總共58頁(yè)。

接種種齡的影響

當(dāng)前41頁(yè)，總共58頁(yè)。接種量的影響通常采用的接種量細(xì)菌1~5%酵母菌5~10%霉菌7~15%，有時(shí)20~25%植物細(xì)胞：30－50％當(dāng)前42頁(yè)，總共58頁(yè)。接種量影響接種量的因素：菌種生長(zhǎng)速度一般情況下：以大接種量較為適合適合的接種量的重要性：過大：菌絲生長(zhǎng)過快，粘稠，營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)缺乏，溶氧不足過?。壕z體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，產(chǎn)生菌絲團(tuán)當(dāng)前43頁(yè)，總共58頁(yè)。培養(yǎng)基的影響種子培養(yǎng)基成分要滿足以下要求：（1）營(yíng)養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要（2）選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基；（3）營(yíng)養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；（4）營(yíng)養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高，并且成分盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基成分一致。（5）營(yíng)養(yǎng)成分、液體環(huán)境（滲透壓、氧化還原電極電位、pH、水的離子活度等）要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。

當(dāng)前44頁(yè)，總共58頁(yè)。

pH通過影響細(xì)胞質(zhì)膜的透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性或電離性來(lái)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響微生物的生長(zhǎng)速度。質(zhì)子是一種唯一不帶電子的陽(yáng)離子，它在溶液里能迅速地與水結(jié)合成水合氫離子(H3O+等)。在偏堿性條件下，0H-占優(yōu)勢(shì)，水合氫離子和0H-對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解度和解離狀態(tài)，細(xì)胞表面電荷平衡和細(xì)胞的膠體性質(zhì)等方面均會(huì)產(chǎn)生重大影響；在酸性條件下，H＋可以與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，并能從可交換的結(jié)合物或細(xì)胞表面置換出某些陽(yáng)離廣，從而影響紉胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；同時(shí)由于pH值較低，CO2溶解度降低，某些金屬離子如Mn2＋、Ca2+等溶解度增加，導(dǎo)致它們?cè)谌芤褐械臐舛仍黾?，從而?duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的作用。培養(yǎng)基的pH的影響當(dāng)前45頁(yè)，總共58頁(yè)。當(dāng)前46頁(yè)，總共58頁(yè)。圖：原核生物細(xì)胞膜上的電子傳遞鏈當(dāng)前47頁(yè)，總共58頁(yè)。圖：與膜結(jié)合的ATP合成酶的結(jié)構(gòu)和功能當(dāng)前48頁(yè)，總共58頁(yè)。當(dāng)前49頁(yè)，總共58頁(yè)。

pH通過影響細(xì)胞質(zhì)膜的透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性或電離性來(lái)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響微生物的生長(zhǎng)速度。質(zhì)子是一種唯一不帶電子的陽(yáng)離子，它在溶液里能迅速地與水結(jié)合成水合氫離子(H3O+等)。在偏堿性條件下，0H-占優(yōu)勢(shì)，水合氫離子和0H-對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解度和解離狀態(tài)，細(xì)胞表面電荷平衡和細(xì)胞的膠體性質(zhì)等方面均會(huì)產(chǎn)生重大影響；在酸性條件下，H＋可以與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，并能從可交換的結(jié)合物或細(xì)胞表面置換出某些陽(yáng)離廣，從而影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；同時(shí)由于pH值較低，CO2溶解度降低，某些金屬離子如Mn2＋、Ca2+等溶解度增加，導(dǎo)致它們?cè)谌芤褐械臐舛仍黾樱瑥亩鴮?duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的作用。培養(yǎng)基的pH的影響當(dāng)前50頁(yè)，總共58頁(yè)。培養(yǎng)的工藝條件的影響培養(yǎng)溫度攪拌溶氧通氣當(dāng)前51頁(yè)，總共58頁(yè)。溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響具體表現(xiàn)在：①影響酶活性，微生物生長(zhǎng)過程中所發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)絕大多數(shù)是在特定酶催化下完成的，每種酶都有最適的酶促反應(yīng)溫度，溫度變化影響酶促反應(yīng)速率，最終影響細(xì)胞物質(zhì)合成。②影響細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性，溫度高流動(dòng)性大，有利于物質(zhì)的運(yùn)輸，溫度低流動(dòng)性降低，不利于物質(zhì)運(yùn)輸，囤此溫度變化影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。③影響物質(zhì)的溶解度，物質(zhì)只有溶于水才能被機(jī)體吸收或分泌，除氣體物質(zhì)以外，溫度升高，物質(zhì)的溶解度增加，溫度降低物質(zhì)的溶解度降低，最終影響微生物的生長(zhǎng)。返回當(dāng)前52頁(yè)，總共58頁(yè)。第五節(jié)、種子質(zhì)量的控制措施

菌種穩(wěn)定性的檢查：將保藏菌株溶于無(wú)菌的生理鹽水中，逐級(jí)稀釋，然后在培養(yǎng)皿瓊脂固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落，選擇形態(tài)優(yōu)良的菌落接入三角瓶進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，檢測(cè)出生產(chǎn)率高的菌種備用

種子液生化分析項(xiàng)目：營(yíng)養(yǎng)消耗的速度，pH變化，溶氧利用情況，色澤、氣味是否異常等。雜菌檢查：顯微鏡觀察，或平板培養(yǎng)試驗(yàn)，即將種子液涂在平板培養(yǎng)皿上劃線培養(yǎng)，觀察有無(wú)異常菌落，定時(shí)檢查，防止漏檢

當(dāng)前53頁(yè)，總共58頁(yè)。

1.種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1）．細(xì)胞或菌體指標(biāo)：菌體形態(tài)、菌體濃度以及