液泡系和線粒體的活體染色及觀察

液泡系和線粒體的活體染色及觀察CollegeofLifeScienceandTechnology,XINJIANGUnivercity一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并了解線粒體和液泡系超活染色的基本原理、方法和注意事項(xiàng)；學(xué)習(xí)如何觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系；了解動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布；學(xué)習(xí)并掌握線粒體和液泡系的超活染色技術(shù)。了解植物細(xì)胞液泡系的發(fā)育過程。二、實(shí)驗(yàn)原理

活體染色是指對(duì)生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡?；钊炯夹g(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。

活體染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無毒性或毒性較小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用。一般是以堿性染料最為適用，可能因?yàn)樗哂腥芙庠陬愔|(zhì)（如卵磷脂、膽固醇等）的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹姆斯綠B（JanusgreenB）和中性紅（neutralred）兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對(duì)于線粒體和液泡系的染色各有專一性。二、實(shí)驗(yàn)原理線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶能使詹姆斯綠B保持在氧化狀態(tài)，呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而細(xì)胞質(zhì)中的染料被還原成無色。液泡是細(xì)胞內(nèi)濃縮產(chǎn)物的主要場所，有十分重要的功能。中性紅是液泡的特殊染色劑，將液泡染成紅色。在活細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不著色。如果細(xì)胞死亡，染料會(huì)彌散開來，使核著色。二、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)用品（一）器材顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙等。（三）材料人口腔上皮細(xì)胞洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞蟾蜍胸骨劍突軟骨細(xì)胞小麥或黃豆幼根根尖四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）線粒體的超活染色與觀察1、線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場所，其形態(tài)和數(shù)量雖不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。1）人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察⑴取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2滴1/5000詹納斯綠B染液。⑵實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自己口腔頰部粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將第一次刮下的粘液狀物洗去，將第二次刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10～15min（注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。⑶在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察?？梢姳馄綘钌掀ぜ?xì)胞的核周圍胞質(zhì)中分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即線粒體。

四、實(shí)驗(yàn)步驟2．液泡系的超活染色與觀察

中性紅為弱堿性.染料，對(duì)液泡系（即高爾基體）的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。

1）蟾蜍胸骨劍突軟骨細(xì)胞的液泡系中性紅染色與觀察軟骨細(xì)胞能分泌軟骨粘蛋白和膠原纖維等，因而粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾集體都發(fā)達(dá)，用中性紅超活染色后，可明顯地顯示出液泡系。將蟾蜍處死，剪取胸骨劍突最薄的部分一小塊，放入載玻片上的1/3000中性紅染液滴中，染色5~10min。用吸管吸去染液，滴加Ringer液，蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察。在高倍鏡下，可見軟骨細(xì)胞為橢圓形，細(xì)胞核及核仁清楚易見，在細(xì)胞核的上方胞質(zhì)中，有許多被染成玫瑰紅色大小不一的泡狀體，這一特定區(qū)域叫“高爾基區(qū)”，即液泡系。2）小麥或黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染色觀察⑴實(shí)驗(yàn)前，把小麥種子或黃豆培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)潮濕的濾紙上，使其發(fā)芽，胚根生長到1以上備用。⑵用雙面刀片把小麥或黃豆幼苗根尖（約1~2cm長）小心切一縱切面，放入載玻片上的1/3000中性紅染液滴中，染色5~10min。⑶吸去染液，滴一滴Ringer液，蓋上蓋玻片，并用鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。⑷在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點(diǎn)的細(xì)胞，可見細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點(diǎn)向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個(gè)淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分空間，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。

4.在小麥或黃豆根尖細(xì)胞制片中，可見細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點(diǎn)向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一