免疫檢驗第十二章免疫組化

免疫檢驗第十二章免疫組化第1頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三活體組織：組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）；大?。?×1×0.5cm）；取病變組織與正常組織交界處；避免對組織標本的損傷和擠壓。印片：肝、脾、淋巴結等器官或組織(經(jīng)新鮮標本最大面積剖開，充分暴露病灶，將載玻片輕輕壓與組織切面，細胞粘附于玻片上，然后固定）（缺點是細胞分布不均勻，細胞有重疊）各種體液、穿刺液：可直接涂片（血液、組織液等）或離心后涂片（細胞少腦脊液、腹水等）。培養(yǎng)細胞：懸浮細胞離心后涂片；貼壁細胞可爬片。取材時間要早（24小時以內），避免組織自溶，使抗原變性消失或嚴重彌散。組織切塊厚度不易超過0.5cm，以便固定液的及時滲透及脫水。第2頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三①凝固蛋白，終止細胞內酶的作用,防止細胞自溶；固定細胞形態(tài)和結構②保持組織細胞的抗原性③防止細胞層脫落④去除細胞內的脂類（妨礙抗體結合）⑤防腐

不損傷組織細胞的固有形態(tài)、結構、抗原性和細胞膜的通透性；不干擾固定后的抗原與抗體的識別與結合。固定時間：一般12小時內，不易超過24小時。第3頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三固定劑的選擇：所有的標本固定必須根據(jù)其性質及所進行的組織化學反應選擇適當?shù)墓潭▌Ｈ缂状?、丙酮、甲醛等（根?jù)抗原的耐受性選擇）

缺點：抗原容易被掩蓋，特別是甲醛固定后，形成醛鍵或羧甲基，使蛋白交聯(lián)封閉部分抗原表位。第4頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三能做石蠟切片的就能做冰凍切片，能做冰凍切片的不一定能做石蠟切片

石蠟切片：優(yōu)點：對組織結構形態(tài)保存好，對組織的定位很準確，是觀察組織和細胞結構的理想方法，可以用于回顧性研究。缺點：抗原常被封閉和破壞。對抗原的保存不如冰凍切片。冰凍切片：優(yōu)點：能避免石蠟切片因固定，脫水，浸蠟等對抗原的損失，較好的保存組織抗原的免疫活性，適用于不穩(wěn)定的抗原。缺點：不易保存（-800C）；細胞內易形成冰晶而破壞抗原結構，造成抗原的彌散使定位不準確。

第5頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三二、抗原的保存與修復抗原修復:免疫組化在制片的過程中由于廣泛的蛋白交聯(lián)而使其組織的某些抗原決定簇發(fā)生遮蔽、致使免疫細胞化學的信號減弱或消失等不良效應。使遮蔽的組織抗原決定簇重新暴露的方法，即抗原修復。第6頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三常用的方法有：

酶消化法：胃蛋白酶、胰蛋白酶和無花果酶鹽酸水解暴露抗原法：注意溫度和時間微波爐恢復抗原法：微波是一種高頻電磁波，可以打開蛋白質之間的交聯(lián)健，從而使抗原修復。高壓鍋恢復抗原法煮沸恢復抗原法抗原修復液中的化學成分或離子與部分抗原表位結合產(chǎn)生化學反應，增加了細胞和組織的通透性，便于抗原抗體的充分結合。高溫可以使某些已經(jīng)封閉的抗原表位得以重新暴露和修復第7頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三第8頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三三、抗體的處理與保存（一）抗體的選擇注意選擇具有高特異性、穩(wěn)定的優(yōu)質抗體多克隆抗體：敏感性較高、特異性相對較低單克隆抗體：特異性較高、敏感性相對較低（二）抗體的稀釋抗原抗體反應要比例合適才能達到預期效果使用前根據(jù)預實驗結果得出抗體的最佳稀釋度第9頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三（三）抗體的保存分裝密封保存，避免對抗體的污染并注明標記（批號、名稱、效價、量）根據(jù)廠家提供的保存條件保存避免反復凍融而使抗體效價降低第10頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三(三）陰性結果和抗原不表達（五）免疫組化結果與HE染色結果(一）必須設立對照（二）陽性結果（四）特異性染色與非特異性染色四、免疫組化的結果判斷第11頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三確證實驗

(一）必須設立對照空白實驗替代試驗吸收或阻斷試驗對照實驗：

陽性對照：選擇含已有抗原的標本(證明顯示程序正確，尤其實驗結果呈陰性時更為重要）陰性對照：選擇不含已知抗原的標本（排除假陽性）第12頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三確證實驗：

空白實驗：PBS（排除內源性酶）

替代試驗：同一動物免疫前的非免疫血清（證明陽性反應不是由異嗜性抗原引起的非特異性反應）（這可證明待檢切片中陽性結果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細胞內待檢抗原的特異性反應的結果。）

吸收或阻斷試驗：用過量的已知抗原與特異性抗體反應，本已經(jīng)是陽性的標本應呈陰性（證明免疫組化的陽性結果是與天然抗原相同的抗原抗體反應。）第13頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三顯色分布:（二）陽性結果可以作為判定抗原定位的依據(jù)（三）陰性結果及抗原不表達第14頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三（四）特異性染色與非特異性染色

特異性染色

非特異性染色分布在特定的部位，顯色不均一無分布規(guī)律，均勻顯色特異性染色非特異性染色分布在特定的部位,具結構性無分布規(guī)律，常出現(xiàn)在切片邊緣、刀痕或皺折部位及壞死或擠壓的細胞區(qū)域由于細胞內抗原含量不同，所以顯色不均一不限于單個細胞，而是累及一片細胞，均勻顯色陽性與陰性細胞相互交雜，同一切片上顯色強度不一細胞和周圍的結締組織均無區(qū)別的著色第15頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三出現(xiàn)假陰性的原因第16頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三出現(xiàn)假陽性的原因第17頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三（五）免疫組化結果與HE染色結果第18頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三五、質量控制（一）試劑質量控制

抗體特異性、敏感性測試,抗體最佳稀釋度的選擇,稀釋劑,抗體孵育溫度、時間非特異性染色：縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。（二）儀器的質量控制相關技術設備、儀器和器具定期校對、消毒第19頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三（三）操作過程質量控制操作：步驟是否正確規(guī)范；每日之間、操作人員之間的變異；試劑復溶、狀態(tài)是否良好標本：陰性、陽性或自身組織對照三種類型質控品，可用于監(jiān)控標本制備、操作過程、染色步驟、試劑質量等問題引起的誤差第20頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三★酶免疫組織化學技術酶標記已知抗體（抗原），與標本中靶抗原（抗體）發(fā)生反應，催化底物產(chǎn)生顯色反應，在顯微鏡下識別標本中抗原（抗體）的分布位置和性質，也可通過圖像分析技術達到定量的目的。第21頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三標本處理與熒光免疫相似標本可長期保存，可用普通顯微鏡觀察分類酶標記抗體免疫組化非標記抗體酶免疫組化一、組織處理

第22頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三★原理

酶直接標記在抗體上，與靶抗原反應，通過酶對底物的特異性催化作用，產(chǎn)生的有色物質沉積在靶抗原部位，從而對靶抗原定位、定性和定量檢測。二、酶標記抗體免疫組化染色第23頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三直接法抗原標本載玻片優(yōu)點：操作簡便、特異性高缺點：敏感度偏低、抗體制備麻煩標記抗體底物第24頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三標記二抗體間接法抗原優(yōu)點：敏感度高缺點：特異性偏低,操作繁瑣底物第25頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三★原理

用酶免疫動物制備抗酶抗體，再將組織抗原與抗酶抗體結合形成復合物，通過酶的底物顯色而檢測抗原，避免了用酶標記時對抗體的損傷，提高了檢測敏感性。PAP法酶橋法

雙橋PAP法APAAP法三、非標記抗體酶免疫組化染色第26頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三（一）酶橋法：抗酶抗體作為第三抗體，通過第二抗體作橋抗體，將結合在組織抗原上的第一抗體與第三抗體連接起來，最后形成酶聯(lián)的抗原-抗體復合物，底物顯色第27頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三

抗酶抗體抗原優(yōu)點：敏感性比酶標法高缺點：操作繁瑣底物酶橋法橋抗體酶第28頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三

優(yōu)點：

敏感性較酶標法有所提高

缺點：

操作分四步，較復雜如果抗酶抗體與酶結合弱，在操作中酶常被沖洗掉如果酶標記在非特異性抗體上會存在背景著色問題如果抗酶抗體的非特異性成分與橋抗結合，結果就與抗酶抗體競爭橋抗的結合位點，也會影響方法的敏感性

+++HRP底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源抗酶抗體/Ab3Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP復合物AgAgAgAg第29頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三（二）PAP法：是酶橋法的改良法。PAP法將酶橋法的第三抗體（抗酶抗體）與酶形成一種穩(wěn)定可溶性(PAP復合物)

第30頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三抗原底物PAP法橋抗體

PAP復合物第一抗與第三抗的動物種屬須相同第31頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三操作只需三步

PAP復合物穩(wěn)定，酶不易洗脫，避免了酶橋法的弊端大大減弱背景著色①橋連抗體存在的非特異性抗體，因其與第1抗體并非同種屬，不能與抗酶抗體結合②抗酶抗體中存在的非抗酶抗體，雖可與組織成分結合，但此抗體不能與酶結合，不會有酶活性。+++底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源PAP復合物AgAgAgAg-Ab1-Ab2-PAP復合物第32頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三（三）雙橋PAP法基本原理:是在PAP法中通過兩次連接橋抗體和PAP而建立起來的，通過雙橋可結合更多的PAP復合物于抗原分子上。這種放大方式由于重復使用橋抗體，使橋抗與PAP復合物中的抗酶抗體未充分飽和的Fc段結合，或橋抗體與特異性一抗尚未飽和的Fc段結合。對抗原有明顯放大作用，對于組織細胞微量抗原的檢測更有實用價值。第33頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三

抗原底物雙橋PAP法橋抗體第一抗與第三抗的動物種屬須相同

PAP復合物第34頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三四、酶免疫組化染色中的常用的酶及顯色底物常用種類:

辣根過氧化物酶/HRP底物顯色（DAB)棕色或灰藍色(AEC)最常用

堿性磷酸酶/AP

底物顯色玫瑰紅色(α-萘酚磷酸鹽與快紅反應）或深藍色(α-萘酚磷酸鹽與快藍反應）;靛藍四唑（紫藍色）最敏感

葡萄糖氧化酶/GO

底物為葡萄糖，配以NBT和PMS顯色藍色敏感性較低，顯色底物不易保存

β-半乳糖酶等酶的選擇:

HRP染色結果比AP染色結果保存時間長含有內源性HRP的組織切片:首選標記酶為APAP和HRP結合可進行雙重或3重免疫組化標記,對比清晰第35頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三

采用熒光素標記已知抗體（或抗原）作為探針，檢測標本中靶抗原（或抗體），在熒光顯微鏡下，分辨出抗原(或抗體）的所在位置及其性質，并可利用熒光定量技術計算其含量。以達到對抗原(或抗體）物質定位、定性和定量測定的目的?！餆晒饷庖呓M織化學技術第36頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三一、組織的處理標本的類型：涂片和印片組織切片細胞培養(yǎng)標本活細胞標本的保存：標本固定干燥后，最好立即檢測保持干燥、置4℃甚至-20℃以下保存第37頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三二、熒光免疫組化染色

直接法：優(yōu)點：操作簡便、特異性高

缺點：敏感度偏低、抗體制備麻煩

間接法：

優(yōu)點：較直接法靈敏，標記一種抗體可以鑒定多種抗原

缺點：非特異熒光、操作時間較長

第38頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三雙標記熒光免疫染色法用兩種熒光素分別標記不同抗體，對同一標本中的相應兩種抗原同時檢測

標記抗體A抗原A抗原B標記抗體B標本載玻片第39頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三親和組織化學（Affinityhistochemistry）

利用兩種物質之間的高度親合力而建立的一種方法。一些具有雙價或多價結合力的物質如植物凝集素（與蛋白糖基）、生物素（親和素）和葡萄球菌A蛋白（IgGFC段結合）等，都對某種組織成分具有高親和力的特點，可以與標記物如熒光素、酶、同位素、鐵蛋白及膠體金等結合,可采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應、放射自顯影或電子顯微鏡，在細胞或亞細胞水平進行對應親和物質的定位或定量。第40頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三待測抗原非特異性抗原A-親合素B-生物素E-酶ABC直接法原理示意圖原理：預先按一定比例將親合素與酶標生物素結合形成可溶性的ABC復合物。當其與檢測反應體系中的生物素化抗體相遇時，ABC中末飽和的親和素結合部位即可與抗體上的生物素結合，使抗原－抗體反應體系與ABC標記體系連成一體進行檢測。（一)親合素-生物素-過氧化酶復合物技術ABC第41頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三ABC間接法原理示意圖待測抗原非特異性抗原A-親合素B-生物素E-酶原理：預先按一定比例將親合素與酶標生物素結合形成可溶性的ABC復合物。當其與檢測反應體系中的生物素化第二抗體相遇時，ABC中末飽和的親和素結合部位即可與抗體上的生物素結合，使抗原－抗體反應體系與ABC標記體系連成一體進行檢測。第42頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三

缺點：有些組織如肝、腎、白細胞、脂肪組織和乳腺等有內源性生物素活性，需要對組織進行預處理

ABC復合物在中性時帶正電荷，容易與細胞核等帶負電荷結構非特異結合，親合素為糖蛋白，可以與凝集素等碳水化合物結合

優(yōu)點：

敏感性高特異性高一抗和二抗工作濃度低操作時間縮短可以多重標記第43頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三(二）橋聯(lián)親合素-生物素技術

BridgedAvidin-Biotintechnique，BRAB

原理：是以游離的親合素作為橋聯(lián)劑，利用親合素的多價性，將檢測反應體系中抗原、生物素化抗體復合物與標記生物素(酶標生物素)聯(lián)結起來，達到檢測反應分子的目的。由于生物素化抗體分子上連有多個生物素，因此，最終形成的抗原-生物素化抗體-親合素-酶標生物素復合物可積聚大量的酶分子；加入相應酶作用底物后，即會產(chǎn)生強烈的酶促反應，從而提高檢測的靈敏度。第44頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三BRAB直接法原理示意圖待測抗原非特異性抗原A-親合素B-生物素E-酶第45頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三BRAB間接法原理示意圖待測抗原非特異性抗原A-親合素B-生物素E-酶第46頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三（三）標記親和素-生物素技術

LabelledAvidin-biotintechnique，LAB原理:以標記親合素直接與免疫復合物中的生物素化抗體連接進行檢測。特點:

相當高的靈敏度，省略了加標記生物素步驟，操作較BRAB法簡便。間接LAB法采用生物素化第二抗體，可進一步提高檢測靈敏度第47頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三二、葡萄球菌A蛋白法定義:葡萄球菌蛋白A/SPA是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質，由于它能與多種動物（人、豬、兔、小鼠等）IgG的Fc段結合，用SPA標記物（酶、熒光素、放射性物質等）顯示抗原與抗體結合反應的各種免疫檢測實驗第48頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三注意：SPA對IgG

亞型的結合有選擇性（如IgG3不結合），不結合IgA1,可能出現(xiàn)的假陰性結果。優(yōu)點：解決不同動物樣本檢測時，需分別標記相對應的二抗的問題。第49頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三三、凝集素法凝集素lectin

是指一類從植物種子、無脊椎動物和較高等動物組織中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白質，可使紅細胞凝集故稱凝集素，凝集素具有與特定糖基專一結合的特性，是研究腫瘤細胞膜糖分子變化的一種理想工具，凝集素法就是一方面利用凝集素可以與標記物結合，另一方面又可以與細胞膜糖基結合所形成一種親合反應直接法是將標記物直接標記在凝集素上，與組織細胞相應的糖蛋白或糖脂相結合。第50頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三間接法是先將凝集素與組織細胞膜糖基結合，然后再用標記的抗凝集素抗體與結合在細胞上的凝集素反應。糖-凝集素-糖法，這種方法是利用生物細胞膜的特殊糖基與凝集素結合后，再用標記的已知糖基與其反應，形成一個“三明治樣”的結合物。第51頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三四、鏈霉親合素-生物素法(LSAB）

鏈霉親合素(StreptavidinSA)是從鏈霉菌培養(yǎng)物提取的一種純蛋白，不含糖基，有4個生物素結合位點，并且具有高度的親和力，其功能類似親合素。利用生物素結合的二抗與酶標記的鏈霉親合素蛋白就組合成酶標鏈霉親合素-生物素方法第52頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三LSAB法具有幾大特點：可結合更多的生物素化的二抗，放大效應遠遠超過ABC法低背景著色操作時間縮短第53頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三

免疫電子顯微鏡（ImmunoelectronMicroscope，IEM）技術是利用高電子密度的顆粒性標記物（如膠體金、鐵蛋白等）標記抗體，或用經(jīng)免疫組織/細胞化學反應能產(chǎn)生高電子密度產(chǎn)物，在電子顯微鏡下對高電子密度標記的抗原（抗體）進行亞細胞水平定位的技術。

特點:

定位更為精確，可定位至細胞膜、細胞器在探索病因、發(fā)病機制、組織發(fā)生等方面有其獨特的優(yōu)點一、免疫標記電鏡技術的原理第54頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三標本制備的要求是保存良好的細胞超微結構，注意保持組織的抗原性，因此在組織固定與取材時選用固定劑不宜過強。在免疫染色方面，又分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三種。二、免疫標記電鏡技術標本的制備要求第55頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三第56頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三從動物到電鏡照片第57頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三（—）免疫膠體金染色法

免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體檢測的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸在還原劑作用下，聚合成為特定大小的金顆，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。它在弱堿環(huán)境下可與蛋白質分子形成牢固的靜電結合而不影響蛋白質的生物特性。三、常用的免疫標記電鏡技術第58頁，共69頁，2023年，2月20日，星期三免疫金銀法

(ImmuNogoldsilvertechNiqueIGST)。其基本原理是用特異性抗體與抗原反應，隨后用金標記的間接抗體，再與特異性抗體結合，用乳酸銀處理，使銀顆粒沉積在金顆粒上，還原銀反應而顯示出黑褐色。適用于石蠟切片，冰凍切片，培養(yǎng)細胞，細胞涂片和樹脂包埋的電鏡切片，該法敏感性高，可檢測組織中微量抗原，定位準確，無擴