細(xì)胞工程基本技術(shù)

第三章細(xì)胞工程基本技術(shù)紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院陶宏征三個(gè)問題如何設(shè)計(jì)一個(gè)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室？第一節(jié)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的基本結(jié)構(gòu)2.細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室中有哪些東西？第二節(jié)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的基本儀器設(shè)備3.在細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室中干些什么事？（用到那些技術(shù)）第三節(jié)細(xì)胞工程的基本操作技術(shù)第四節(jié)

培養(yǎng)基及其配制第一節(jié)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的基本結(jié)構(gòu)一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室二、無菌操作室一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室主要用于細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)的基本準(zhǔn)備工作、基本設(shè)備放置、物品與器械貯藏等。

（一）洗滌區(qū)（二）滅菌區(qū)（三）貯藏區(qū)（四）操作液體培養(yǎng)基配制區(qū)（一）洗滌區(qū)用于各種實(shí)驗(yàn)用具和實(shí)驗(yàn)材料的清洗，需要配置專用水龍頭、水池、排水系統(tǒng)、洗滌器具、超聲波清洗儀、控水架、干燥箱、工作臺(tái)、蒸餾水器、超純水儀等，另外應(yīng)準(zhǔn)備適宜的洗滌劑（二）滅菌區(qū)熱穩(wěn)定溶液和耐熱器材的高壓蒸汽滅菌或干熱滅菌工作在滅菌區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

滅菌區(qū)需要電爐、高壓蒸汽滅菌器、干熱滅菌箱（鼓風(fēng)干燥箱）等設(shè)備，用于操作器械、物品、操作液及培養(yǎng)基的滅菌。

物品滅菌后存到無菌貯藏柜或?qū)Ｓ脽o菌貯藏區(qū)（三）貯藏區(qū)用于各種試驗(yàn)器皿、培養(yǎng)基、化學(xué)藥品等的放置。

需要不同規(guī)格和類型的貯藏柜，不同制冷溫度冰箱（普通冰箱、低溫冰箱、超低溫冰箱）等設(shè)備，用于配制培養(yǎng)基所需要的化學(xué)試劑、藥品和器皿等的貯藏.（四）操作液體和培養(yǎng)基配制區(qū)操作液體和培養(yǎng)基配制區(qū)用于培養(yǎng)基滅菌前試劑的稱量、稀釋等。二、無菌操作室（一）標(biāo)準(zhǔn)無菌操作室（二）層流凈化實(shí)驗(yàn)室（一）標(biāo)準(zhǔn)無菌操作室1.緩沖準(zhǔn)備區(qū)2.操作液體和培養(yǎng)基的無菌配制區(qū)3.無菌貯藏區(qū)4.無菌操作區(qū)5.培養(yǎng)區(qū)6.鑒定分析區(qū)1.緩沖準(zhǔn)備區(qū)用于操作者手臂清洗消毒、更換滅菌衣帽和拖鞋等，以保證其他無菌操作區(qū)域的無菌環(huán)境。需配備腳踏式水龍頭、專用水池、手臂消毒筒及消毒液、鞋帽架、紫外殺菌燈等設(shè)備2.操作液體和培養(yǎng)基的無菌配制區(qū)

用于將配置好的操作液體和培養(yǎng)基進(jìn)行無菌處理。

主要配備超凈工作臺(tái)、過濾滅菌裝置等，如大量液體配制用的正壓（大容量細(xì)菌濾器）、負(fù)壓過，以及少量液體配置用的針頭濾器、濾膜等。濾除菌設(shè)備（真空泵、抽濾瓶及細(xì)菌濾器）及消耗品（濾膜）3.無菌貯藏區(qū)

主要用于貯藏滅菌后需在無菌操作區(qū)使用的器械物品。

可設(shè)置專門的無菌貯藏柜，其好處在于可將無菌操作區(qū)不同區(qū)域使用的無菌器械物品分開存放，便于隨時(shí)取用。無菌貯藏區(qū)可放置液氮生物容器，以保存培養(yǎng)材料。4.無菌操作區(qū)用于培養(yǎng)物的無菌操作及放置所需儀器設(shè)備等，應(yīng)能長(zhǎng)時(shí)間保持良好的無菌狀態(tài)。

需配備隔水式恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、操作用顯微鏡、顯微操作系統(tǒng)、細(xì)胞電融合電穿孔儀、細(xì)胞程序冷凍儀、超凈工作臺(tái)、工作臺(tái)、酒精燈、紫外線殺菌燈、各種消毒滅菌制劑等，還需配備用于無菌解剖、取材、剪切組織的金屬鑷（直鎳、彎頭鑷、眼科鑷）、剪刀（眼科剪、手術(shù)剪等）、解剖刀以及其他無菌操作用器械、器械支架等5.培養(yǎng)區(qū)

用于培養(yǎng)物的體外培養(yǎng)、貯存及所需儀器設(shè)備的放置。

根據(jù)培養(yǎng)工作的不同需要，主要配備二氧化碳培養(yǎng)箱、二氧化碳?xì)怏w鋼瓶（可放置在非無菌區(qū)采用管道供氣）、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)架、暗培養(yǎng)箱、恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱、培養(yǎng)顯微鏡（活細(xì)胞工作站）、振蕩器、離心機(jī)、計(jì)時(shí)器、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。培養(yǎng)區(qū)環(huán)境溫度一般要求在25-27℃，故應(yīng)裝備恒溫設(shè)備6.鑒定分析區(qū)鑒定分析區(qū)用于培養(yǎng)物的研究、觀察與分析、照相及相應(yīng)的儀器設(shè)備的放置。

主要有相差顯微鏡、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡、體式顯微鏡及配套顯微照相系統(tǒng)和圖像分析系統(tǒng)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、細(xì)胞分選儀、染色體圖像分析系統(tǒng)、離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、液氮生物容器、精密電子天平等等。精密儀器設(shè)備應(yīng)固定安置在臺(tái)架上。有條件可單設(shè)流式細(xì)胞儀和酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)室等?！?溫室（植物細(xì)胞工程）（二）層流凈化實(shí)驗(yàn)室1.緩沖準(zhǔn)備區(qū)12.緩沖準(zhǔn)備區(qū)23.風(fēng)淋區(qū)4.層流區(qū)（操作者液體和培養(yǎng)基的無菌配制區(qū)、培養(yǎng)物無菌操作區(qū)、培養(yǎng)區(qū)及鑒定分析區(qū)）。風(fēng)淋設(shè)備層流區(qū)請(qǐng)分析這個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)圖第二節(jié)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的基本儀器設(shè)備一、常用器皿與器材二、常用儀器設(shè)備一、常用器皿與器材（一）培養(yǎng)器皿培養(yǎng)瓶培養(yǎng)皿培養(yǎng)板

（二）盛裝器皿（三）計(jì)量器皿（四）金屬器械（五）其他器材、物品試管刷、牛皮紙、硫酸紙、錫箔紙、棉繩、紗布、棉布、鋁盒、飯盒、消毒架、鞋帽架、紫外線殺菌燈二、常用儀器設(shè)備（一）清洗滅菌設(shè)備（二）藥品試劑存貯和配制設(shè)備（三）無菌操作設(shè)備（四）培養(yǎng)設(shè)備（五）觀察分析設(shè)備（六）其他儀器設(shè)備（一）清洗滅菌設(shè)備金屬蒸餾水器超純水儀1.水處理設(shè)備2.高壓蒸汽滅菌器臥式高壓蒸汽滅菌鍋中型立式滅菌鍋小型手提式滅菌鍋日本YAMATO中型立式滅菌器3.干燥箱4.過濾除菌裝置大型過濾除菌器（二）藥品試劑存貯和配制設(shè)備

（三）無菌操作設(shè)備（四）培養(yǎng)設(shè)備培養(yǎng)架人工氣候箱CO2培養(yǎng)箱（五）觀察分析設(shè)備（六）其他儀器設(shè)備第三周進(jìn)無菌操作室需要穿戴鞋套口罩實(shí)驗(yàn)帽第三節(jié)細(xì)胞工程的基本操作技術(shù)一、清洗二、消毒滅菌三、無菌操作一、清洗（一）玻璃器皿的清洗透亮無任何水漬或油漬。玻璃容器的內(nèi)壁既不聚成水滴，也不成股流下。（二）金屬器皿的清洗金屬器皿不能過酸，清洗時(shí)用洗滌劑刷洗，自來水沖洗干凈，然后用75%酒精擦拭，蒸餾水沖洗，再烘干或晾干。（三）除菌過濾器的清洗除菌過濾器用清水沖洗后，用清潔液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，烘干或晾干備用。二、消毒滅菌消毒和滅菌的差異：

消毒是指殺死物體上病原微生物的方法，并不一定能殺死含芽孢的細(xì)菌或非病原微生物。滅菌是指殺滅物體上所有微生物的方法。滅菌碧霄度要求高，包括殺滅細(xì)菌芽胞在內(nèi)的全部病原微生物和非病原微生物。消毒滅菌所采用的方法（一）物理滅菌方法（二）化學(xué)滅菌方法（一）物理滅菌方法1.高溫滅菌法（1）干熱滅菌法：燒灼、干烤和紅外線→干燥箱、恒溫箱（160℃維持30-40min或120℃維持120min）（2）濕熱滅菌法：高壓蒸汽→高壓蒸汽滅菌鍋2.過濾除菌法：主要用于一些不耐高溫滅菌的血清、毒素、抗生素以及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等的除菌3.射線滅菌法：紫外線、電離輻射（γ射線）以及微波→橡膠、塑料、某些醫(yī)藥產(chǎn)品、醫(yī)療用品、空間、操作臺(tái)面等4.超聲波滅菌法

：超聲波→細(xì)菌（二）化學(xué)滅菌方法消毒劑消毒法（1）70-75%乙醇、0.5%過氧乙酸、2%-5%來蘇爾、0.1%新潔爾滅等化學(xué)消毒劑對(duì)實(shí)驗(yàn)器皿、操作表面、皮膚等進(jìn)行消毒（2）70%-75%乙醇、0.1%-0.2%氯化汞、10%次氯酸鈉、飽和漂白粉等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料的消毒（3）2mL甲醛+1g/m3高錳酸鉀或乙二醇（6ml/m3）等加熱熏蒸進(jìn)行無菌室和培養(yǎng)室的消毒。2.抗菌素抑菌法

：青霉素、鏈霉素和新霉素等（三）影響消毒滅菌的因素1.消毒劑的性質(zhì)、濃度與作用時(shí)間2.微生物的種類與數(shù)量

3.溫度和酸堿度

4.有機(jī)物（四）不同種類物品及培養(yǎng)物的滅菌方法1.培養(yǎng)基濕熱滅菌

2.器械和器皿灼燒或干熱滅菌

3.不耐熱物質(zhì)過濾除菌4.空間紫外線和熏蒸滅菌

5.物體表面藥劑噴霧消毒

6.實(shí)驗(yàn)材料消毒劑消毒滅菌1.培養(yǎng)基濕熱滅菌

（1）培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)需完成滅菌工序。（2）高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其pH會(huì)下降0.2-0.3單位；。2.器械和器皿灼燒或干熱滅菌：鑷子、剪子、解剖刀等器械→酒精燈、接種器械滅菌器3.不耐熱物質(zhì)過濾除菌赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素→過濾滅菌法4.空間紫外線和熏蒸滅菌接種室和超凈工作臺(tái)→紫外線空間→紫外線、熏蒸5.物體表面藥劑噴霧消毒

桌面、墻面、雙手表面、材料表面→70%酒精、1%-2%來蘇爾溶液、0.25%-1%新潔爾等涂擦、噴霧6.

實(shí)驗(yàn)材料消毒劑消毒滅菌

三、無菌操作（一）無菌操作前的準(zhǔn)備工作（二）無菌操作步驟（一）無菌操作前的準(zhǔn)備工作1.所需器皿和器械提前消毒滅菌放于工作臺(tái)2.肥皂洗手及手臂3.穿戴無菌工作裝備4.工作前用70%-75%的酒精擦拭雙手、前臂和工作臺(tái)面5.取出已消毒滅菌的實(shí)驗(yàn)用品和器械備用（二）無菌操作步驟1.打開無菌工作臺(tái)及凈化室的紫外燈，消毒半小時(shí)以上。2.進(jìn)入凈化室前先關(guān)閉紫外燈，打開超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)，以排盡臭氧。3.手用70%酒精棉球擦拭。4.點(diǎn)燃酒精燈；超凈臺(tái)內(nèi)應(yīng)避免放入過多的物品；使用的吸管，滴管，試管，培養(yǎng)瓶等均事先滅菌。

5.打開各類瓶蓋前先過火；打開的瓶口、試管口

過火焰，鑷子使用前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼。

6.同一根吸管或滴管不應(yīng)連續(xù)用于幾個(gè)不同的細(xì)

胞系；吸取培養(yǎng)基的吸管應(yīng)離開培養(yǎng)瓶或試管

口0.5cm，避免伸入培養(yǎng)瓶口或試管口；以防止互

相混雜污染。

7.漏在培養(yǎng)瓶上或臺(tái)上的液體，立即用酒精棉球擦凈。

8.

操作完畢后恢復(fù)工作臺(tái)面。第四節(jié)

培養(yǎng)基及其配制一、植物培養(yǎng)基及其配制二、動(dòng)物培養(yǎng)基及其配制三、微生物培養(yǎng)基及配制一、植物培養(yǎng)基及其配制（一）植物培養(yǎng)基成分1.水2.無機(jī)元素

（1）大量元素：碳（C）氫（H）氧（O）氮（N）硫（S）磷（P）鉀（K）鈣（Ca）鎂（Mg）9種元素（2）微量元素：鐵（Fe）銅（Cu）鉬（Mo）鋅（Zn）鈉（Na）錳（Mn）鈷（Co）硼（B）8種元素。3.有機(jī)元素（1）氨基酸類（2）維生素類（3）肌醇（4）天然有機(jī)添加物①椰乳②香蕉③馬鈴薯④其他添加物類4.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)5.碳源和能源：常用蔗糖6.瓊脂

：在固體培養(yǎng)基時(shí)瓊脂是最好的固化劑7.活性炭：可以吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中所含雜質(zhì)（二）培養(yǎng)基種類高鹽成分培養(yǎng)基：MS、LS、BL、BM、ER2.硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基

：B5、N6、SH、GS3.中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基

：H、尼奇、米勒4.低無機(jī)鹽培養(yǎng)基：改良懷特培養(yǎng)基、WS培養(yǎng)基、克諾普培養(yǎng)基（花卉培養(yǎng)上用的多）、貝爾什勞培養(yǎng)基和HB培養(yǎng)基（三）培養(yǎng)基配制（詳見視頻、實(shí)驗(yàn)課本）1.母液的配制和保存（1）母液的配制和保存（2）母液的保存2.培養(yǎng)基的配制

二、動(dòng)物培養(yǎng)基及其配制（一）培養(yǎng)及成分（二）培養(yǎng)基制備（三）培養(yǎng)基的選擇（四）動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的其他常用液（一）培養(yǎng)基成分1.生長(zhǎng)培養(yǎng)基:使培養(yǎng)細(xì)胞快速生長(zhǎng)增殖的培養(yǎng)基生長(zhǎng)（1）水（2）無機(jī)鹽：Na+、K+、Mg2+、Cl-、SO42-、PO42-、HCO3-（3）微量元素（4）維生素（5）緩沖系統(tǒng)由緩沖劑配制成的溶液，在加入一定量的酸或堿時(shí)，其氫離子濃度改變甚微或幾乎不變，把這種溶液稱為緩沖（溶）液。

緩沖系統(tǒng)對(duì)維持動(dòng)物培養(yǎng)基的pH是至關(guān)重要的（6）能源和碳源：葡萄糖是動(dòng)物細(xì)胞的主要碳源（7）氮源①成分明確的氮源：成分明確的氮源指動(dòng)物細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和生長(zhǎng)所必須不可少的一些必需氨基酸和非必需氨基酸②成分不明確的氮源：：成分不明確的氮源指動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中加入的各種動(dòng)物血清，組織提取液以及蛋白水解產(chǎn)物（如LH）等（8）激素和生長(zhǎng)因子：調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖或分化，以及細(xì)胞貼附的作用（9）添加劑：抗生素、核酸合成前體、抗氧化劑及pH指示劑2.維持培養(yǎng)基

維持培養(yǎng)基主要特點(diǎn)是能在數(shù)周內(nèi)保持培養(yǎng)細(xì)胞處于良好狀態(tài)，而不會(huì)使得細(xì)胞的特性受到損害（二）培養(yǎng)基制備1.天然培養(yǎng)基

（血清、水解乳蛋白（LH）、胚胎浸出液（胎汁）和膠原）2.合成培養(yǎng)基3.無血清培養(yǎng)基

4.平衡鹽溶液

（生理鹽水、平衡鹽溶液）（三）培養(yǎng)基的選擇選擇適宜的培養(yǎng)液主要是參考這種細(xì)胞系最初建系時(shí)發(fā)表的文章或類似細(xì)胞系的培養(yǎng)（四）動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的其他常用液1.消化液

：在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，使細(xì)胞離散。（1）胰蛋白酶溶液（2）膠原酶溶液（3）EDTA溶液。2.消化酶的抑制劑3.pH調(diào)整液

4.谷氨酰胺溶液

5.