4高等植物基因工程08課件

四、高等植物基因工程高等植物的遺傳學(xué)特征高等植物基因工程的基本概念高等植物的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)高等植物的基因表達(dá)系統(tǒng)（一）高等植物的遺傳學(xué)特征植物的基本特征遺傳操作的簡(jiǎn)易性整株植物的再生性染色體的多倍體性1、植物的基本特征植物低等植物高等植物含根、莖、葉、花、果分化器官合子經(jīng)胚再發(fā)育為個(gè)體苔蘚門、蕨類門、裸子門、被子門無根、莖、葉等分化器官合子不經(jīng)胚直接發(fā)育為個(gè)體藻類、地衣3、整株植物的再生性將一小片鮮嫩的愈傷組織置于含合適營(yíng)養(yǎng)和植物生長(zhǎng)激素的組織培養(yǎng)基中，細(xì)胞會(huì)持續(xù)生長(zhǎng)并分裂。將這些細(xì)胞涂在特定固體培養(yǎng)基上，會(huì)長(zhǎng)出新的幼芽，并重新分化成葉、根、莖，最終成為整株開花植物。

愈傷組織：植物損傷后，在傷口長(zhǎng)出的軟組織。生長(zhǎng)素/分裂素的比例高，則根部發(fā)育；比例低，則莖部發(fā)育。

愈傷組織的細(xì)胞分化取決于植物生長(zhǎng)素(auxins)和分裂素(cytokinins)的相對(duì)濃度。大多數(shù)單子葉農(nóng)作物（如谷類作物）很難從原生質(zhì)再生出完整細(xì)胞。植物細(xì)胞具有纖維素構(gòu)成的細(xì)胞壁，通常不能有效吸收外源DNA。用纖維素酶處理植物細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體，吸收DNA分子后，經(jīng)過再生、愈傷組織形成，培育出整株植物。（二）高等植物基因工程的基本概念高等植物基因工程高等植物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因植株改良農(nóng)作物遺傳性狀植物工程細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)蛋白多肽藥物高等植物基因工程的發(fā)展歷程1983：美國(guó)和比利時(shí)科學(xué)家首次將外源基因?qū)霟煵莺秃}卜；

1994：世界上第一種耐儲(chǔ)藏番茄在美國(guó)批準(zhǔn)上市；1995：轉(zhuǎn)基因抗蟲、抗除草劑玉米和棉花在美國(guó)投入生產(chǎn)；2000：美國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積首次超過普通大豆。轉(zhuǎn)基因技術(shù)雖然只有27年的歷史，但所涉及的作物種類甚多。包括：水稻、玉米、馬鈴薯、小麥、黑麥、紅薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亞麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡蘿卜、黃瓜、蘆筍、苜蓿、草莓、木瓜、獼猴桃、越橘、茄子、梨、蘋果、葡萄。（三）高等植物的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法植物病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的再生植物基因工程中的選擇標(biāo)記和報(bào)告基因根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，能在自然條件下特異性感染幾乎所有雙子葉植物（尤其豆科類植物）的根部和受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤。1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法根癌農(nóng)桿菌的這種致瘤特性是由其內(nèi)的野生型Ti(Tumor-inducing)質(zhì)粒介導(dǎo)的。

根癌農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，將T-DNA插入植物基因組中，隨其復(fù)制而復(fù)制。

植物生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素：促使植物創(chuàng)傷組織無限制生長(zhǎng)與分裂，形成冠癭瘤。冠癭堿：代謝物為氨基酸和糖類，是根癌農(nóng)桿菌生長(zhǎng)必需的物質(zhì)。：合成植物生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素；Ti質(zhì)粒的功能區(qū)：致瘤區(qū)冠癭堿合成區(qū)冠癭堿代謝區(qū)毒性區(qū)(Vir區(qū))：參與冠癭堿合成；：參與冠癭堿分解；：參與T-DNA轉(zhuǎn)移、插入植物染色體。tmstmr

tmtopine代謝區(qū)Vir區(qū)TiplasmidoriT-DNAleftborderrightborder乙酰丁香酸植物根部羥基乙酰丁香酸COOHCH2OHCH3OCH3H3COCOOHOCH3H3CO損傷的植物根部分泌乙酰丁香酸、羥基乙酰丁香酸，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的vir基因、農(nóng)桿菌染色體上的一個(gè)操縱子表達(dá)。

vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的T-DNA單鏈切下，操縱子表達(dá)產(chǎn)物與單鏈T-DNA結(jié)合成復(fù)合物，后者轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。T-DNA單鏈根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒Vir產(chǎn)物Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制Ti質(zhì)粒的改造原因：大量的生長(zhǎng)素和分裂素會(huì)抑制細(xì)胞再生為整株植物。原因：冠癭堿的合成大量消耗精氨酸、谷氨酸，影響植物細(xì)胞的生長(zhǎng)。1）除去T-DNA上的生長(zhǎng)素和分裂素生物合成基因(tms和tmr)。2）除去T-DNA上的冠癭堿生物合成基因(tmt)。4）安裝E.coli復(fù)制子，使其能在E.coli中復(fù)制，以利于克隆操作。3）除去Ti質(zhì)粒上的其它非必需序列，最大限度地縮短載體長(zhǎng)度。5）安裝植物細(xì)胞篩選標(biāo)記（如新霉素抗性基因neor）、植物基因啟動(dòng)子、polyA化信號(hào)序列。6）安裝MCS，以利于外源基因的克隆。將外源基因克隆在大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的T-DNA區(qū)；轉(zhuǎn)化攜帶Ti輔助質(zhì)粒(只含vir區(qū)、不含T-DNA區(qū))的農(nóng)桿菌；重組農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞。二元整合轉(zhuǎn)化程序重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的方法：葉盤法：共培養(yǎng)法：用重組農(nóng)桿菌感染葉片外植體并短期共培養(yǎng)，不需進(jìn)行原生質(zhì)體操作。把重組農(nóng)桿菌、植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)。轉(zhuǎn)入的外源基因拷貝數(shù)低，大多數(shù)為單拷貝。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法的缺點(diǎn)：宿主局限性，主要用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌極少能感染單子葉植物，一些重要的農(nóng)作物（如水稻、小麥、玉米等）對(duì)其不敏感。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法是目前轉(zhuǎn)基因植物最常用的方法，80%的轉(zhuǎn)基因植物是采用該方法獲得的。植物病毒廣泛存在，且不受單子葉或雙子葉的限制，因此以病毒作為植物基因工程載體日益受到重視。在300種特征清楚的植物病毒中，單鏈RNA病毒占91%，雙鏈RNA病毒、雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒各占3%。2、植物病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染RNA操作困難，不適合作為克隆載體?；ㄒ嘶ㄈ~病毒(CaMV)：雙鏈DNA病毒雙生病毒(Geminivirus)：?jiǎn)捂淒NA病毒兩種常用的植物病毒載體：轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞原生質(zhì)體利用植物病毒載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的戰(zhàn)略：

轉(zhuǎn)染植物組織以雙鏈DNA病毒花椰菜花葉病毒(CaMV)基因組為載體，去除有關(guān)的致病基因，換上外源基因，體外包裝成有感染力的病毒顆粒，轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞原生質(zhì)體，由此再生成整株植物。1）轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞原生質(zhì)體1）即使切除基因組中的非必需序列，其承載外源基因的能力還是有限，只能插入很小的片段?；ㄒ嘶ㄈ~病毒載體：2）宿主范圍非常窄，主要是蕓苔屬植物，如蕪菁、甘藍(lán)、花椰菜等。2）轉(zhuǎn)染植物組織A鏈能單獨(dú)在植物細(xì)胞中復(fù)制，含一部分病毒包衣蛋白基因；B鏈含另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B兩條鏈必須同處于一個(gè)植物細(xì)胞中，方能形成有感染力的病毒。植物雙生病毒(Geminiviruses)為單鏈DNA病毒，成熟病毒呈雙顆粒狀，每個(gè)顆粒中含一條不同的DNA單鏈。轉(zhuǎn)染植物組織雙生病毒家族成員--番茄金色花葉病毒(TGMV)表達(dá)載體的構(gòu)建程序2）可引起破壞性侵染，需嚴(yán)格防護(hù)，防止載體從宿主中逃逸，侵染自然中的植物。雙生病毒載體：1）宿主范圍廣，是一種很有潛力的植物病毒載體，可侵染重要的作物（如玉米、小麥）。3、植物細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化程序基因槍轉(zhuǎn)化法電穿孔轉(zhuǎn)化法激光微束穿孔法多聚物介導(dǎo)法花粉管通道法基因槍轉(zhuǎn)化法快速簡(jiǎn)便，不受宿主范圍限制，而受體植物細(xì)胞不需去除細(xì)胞壁，被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織容易再生成植株；但成本高，轉(zhuǎn)化率低。所有涉及植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法（農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、植物病毒轉(zhuǎn)化法、電穿孔法、多聚物介導(dǎo)法）均存在一個(gè)難題：原生質(zhì)體很難再生出整株植物。4、植物原生質(zhì)體的再生原生質(zhì)體的再生效率在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中至關(guān)重要。植物原生質(zhì)體的再生程序1）將植物嫩葉、幼芽或愈傷組織切成碎片，浸入含纖維素酶的緩沖液中保溫，懸浮物離心去除細(xì)胞碎片。2）將原生體懸浮液滴在無菌濾紙片上，置于含普通植物細(xì)胞（滋養(yǎng)細(xì)胞）的固體再生培養(yǎng)基表面。原生質(zhì)體不直接接觸滋養(yǎng)細(xì)胞，但可吸收其分泌擴(kuò)散的植物生長(zhǎng)因子及其它化合物。3）培養(yǎng)2-3周后，將濾紙上的植物細(xì)胞蔟轉(zhuǎn)移至含高濃度分裂素、低濃度生長(zhǎng)素的固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)培育2-4周，濾紙片上便長(zhǎng)出嫩芽。4）將嫩芽置于含低濃度生長(zhǎng)素、無分裂素的固體培養(yǎng)基上，使其根部發(fā)育。5）3周后，將之移植于土壤中，長(zhǎng)成整株植物。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法回顧新霉素抗性基因（neor）慶大霉素抗性基因（gentr）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）1）植物基因工程中的選擇標(biāo)記：5、植物基因工程中的選擇標(biāo)記和報(bào)告基因-葡萄糖苷酸酶基因（gus）胭脂堿和章魚堿氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat

）熒光素酶基因（luc）綠色熒光蛋白基因（gfp）2）植物基因工程中的報(bào)告基因：（四）高等植物的基因表達(dá)系統(tǒng)花椰菜花葉病毒CaMV的35S啟動(dòng)子能在許多植物物種、幾乎所有發(fā)育階段、所有組織中高效表達(dá)，被廣泛用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株。啟動(dòng)子是決定基因表達(dá)部位、時(shí)間、強(qiáng)度的主要調(diào)控元件。在高等植物基因工程中，外源基因的時(shí)空特異性表達(dá)尤為重要，因?yàn)楹芏嗤庠椿虻谋磉_(dá)產(chǎn)物對(duì)植物早期的生長(zhǎng)、發(fā)育有影響，甚至?xí)滤乐仓?。高等植物的基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)外源基因的乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)外源基因的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)外源基因的類固醇誘導(dǎo)系統(tǒng)1、外源基因的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)Tc-on型四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantnosTGUStet操作子顯色反應(yīng)四環(huán)素CaMV

35SPPlantnosT-葡萄糖苷酸酶基因GUStet操作子四環(huán)素誘導(dǎo)型報(bào)告基因表達(dá)盒CaMV35SPPlantnosTE.colitetR四環(huán)素阻遏蛋白基因表達(dá)盒TetRTc-off型四環(huán)素阻遏系統(tǒng)35SPPlantnosTGFPtet四環(huán)素tTA融合蛋白DNA結(jié)合活性轉(zhuǎn)錄激活作用tTA激活因子表達(dá)盒CaMV35SPPlantnosTtetRVP1635SPPlantnosT綠色熒光蛋白基因GFP四環(huán)素阻遏型報(bào)告基因表達(dá)盒7個(gè)tet操作子嵌合啟動(dòng)子Top102、外源基因的乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)CaMV35SPPlantnosT巢曲霉菌

alcR轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)盒CaMV35SPPlantnosT氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因CAT乙醇誘導(dǎo)型報(bào)告基因表達(dá)盒alcA啟動(dòng)子控制區(qū)（alcA編碼乙醇降解酶）AlcRCaMV35SPPlantnosTCAT乙醇氯霉素抗性3、外源基因的地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)tTA激活因子表達(dá)盒PlantPPlantnosTGFPGal4結(jié)合區(qū)地塞米松tTA融合蛋白CaMV35SPPlantnosT轉(zhuǎn)錄因子Gal4轉(zhuǎn)錄激活因子VP16激素受體GRPlantPPlantnosT綠色熒光蛋白基因

GFP地塞米松誘導(dǎo)型報(bào)告基因表達(dá)盒Gal4結(jié)合區(qū)地塞米松誘導(dǎo)、四環(huán)素抑制型系統(tǒng)四環(huán)素顯色反應(yīng)地塞米松tetR:tet結(jié)合蛋白NLS:核定位信號(hào)序列GR:激素受體VP16:轉(zhuǎn)錄激活因子GUS:-葡萄糖苷酸酶報(bào)告基因35SPpAocsTVP16GRtetRNLSpA35STGUS35SP7個(gè)tet操作子4、外源基因的類固醇誘導(dǎo)系統(tǒng)雌激素誘導(dǎo)型的外源基因表達(dá)系統(tǒng)雌激素PG10-90TE9hERlexAVP16TNOShptMCSPNOSOlexAP35ST3AXVE轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)盒潮霉素標(biāo)記基因表達(dá)盒外源基因表達(dá)盒l(wèi)exA：細(xì)菌lexA蛋白VP16：轉(zhuǎn)錄激活因子MCS：多克隆位點(diǎn)hER