細菌基因組DNA的提取課件

實驗一細菌基因組DNA的提取一、實驗原理1、核酸的分類DNA

主要存在于細胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。

RNA

存在于細胞質(zhì)中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。分離純化核酸總的原則：

①應保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染。核酸純化應達到的要求：

①核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。2、核酸制備的一般原則一、實驗原理核酸制備時應注意的事項:①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學因素對核酸的降解。③減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解。

3、核酸制備的一般原則一、實驗原理核酸酶的抑制和抑制劑降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當然，幾個條件并用更好。對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。對于RNA，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設法抑制RNase更重要。4、核酸制備的一般方法和原理一、實驗原理核酸酶的抑制和抑制劑

DNase抑制

①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。核酸酶的抑制和抑制劑

RNase抑制①操作要帶手套。②所有器皿要嚴格消毒，③試劑處理④低溫操作⑤在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。

核酸制備中常用的去垢劑核酸本身帶負電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂；

2．溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來；

3．對RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉核酸制備中常用的酶

DNaseRNase

蛋白酶K

溶菌酶

核酸提取的一般過程1）破碎細胞（防止核酸酶的作用）

微生物：溶菌酶、SDS裂解。

高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰凍法：反復凍融或液氮凍后組織搗碎。

動物：液氮處理后用勻漿器破碎。

細胞器DNA：首先純化細胞器。

以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑核酸提取的一般過程

3）核酸的純化根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點除去其它核酸污染,并除去提取過程中的系列試劑(鹽、有機溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。

4）核酸樣品的保存核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)

溫度：

4℃（5℃）最佳和最簡單

-70℃是長期保存的良好溫度，為一次性保存

-20℃保存

保存介質(zhì)：

TE緩沖溶液(最常用)TE緩沖液被用于DNA的穩(wěn)定和儲存10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0二、材料、設備及試劑

菌種：DBT降解菌設備：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺式高速離心機，渦旋振蕩器試劑：LB液體培養(yǎng)基、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5MNaCl、Tris-飽和酚、氯仿、RNA酶A、無水乙醇5、將上層清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管，加等體積的氯仿，混勻后13000rpm離心3min，除去苯酚。6、小心吸出上清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管，用預冷的兩倍體積的無水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30min，然后13000rpm離心15min，可見白色絲狀沉淀物。7、小心吸出液體，棄上清液，用預冷的400μl70％乙醇洗滌2次，室溫干燥后，用50μlTE（含20μg/ml的Rnase）溶解DNA，－20℃冰箱放置備用。

四、注意事項——材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集四、注意事項——細胞裂解材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細胞－－蛋白酶K細菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩四、注意事項——核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解

DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）五、DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應。

原因?qū)Σ卟牧喜恍迈r或反復凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時