生化物質(zhì)的分離純化技術(shù)

生化物質(zhì)的分離純化技術(shù)第1頁/共82頁5.對酸性物質(zhì)的提取，常在什么條件下進行？對堿性物質(zhì)的提取，常在什么條件下進行？對兩性物質(zhì)的提取，常在什么條件下進行？6.以細(xì)丙為例解釋提取制備每步的基本原理？4.什么叫動態(tài)吸附和靜態(tài)吸附？它們在應(yīng)用上有何區(qū)別？第2頁/共82頁生化物質(zhì)的制備第3頁/共82頁

一般從天然生物材料制作生化物質(zhì)的過程大體可分為六個階段：

1.原料的選擇和預(yù)處理

2.原料的粉碎；

3.提取，即從原料中經(jīng)溶劑分離有效成分，制成粗品的工藝過程；

4.純化，即粗制品經(jīng)鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、膜分離、結(jié)晶等步驟進行精制的工藝過程；

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利用生化制備技術(shù)從生物材料中獲得特殊的生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酶、激素、核酸等生化產(chǎn)品時，通常要注意以下幾個問題：

6.成品及.制劑，即半成品或原料藥經(jīng)精細(xì)加工制成片劑、口服液、針劑、凍干劑等供飲用或臨床應(yīng)用的各種劑型。5.干燥及保存；第5頁/共82頁1．生物材料的組成成分非常復(fù)雜，有數(shù)百種甚至更多，各種化合物的形狀、大小、相對分子質(zhì)量和理化性質(zhì)都各不相同，有的迄今還是未知物，而且這些化合物在分離時仍在不斷的代謝變化中。第6頁/共82頁

2．在生物材料中，有些化合物含量很低或極微，有的只有1／l0000，甚至更少。制備時，原材料用量很大，得到產(chǎn)品很少，與投料量相比“虎頭蛇尾”。近年來，用所謂“釣魚法”，利用某些分子特有的專一親和力，將某一化合物從極復(fù)雜的體系中“釣”出來，與其他化學(xué)分離技術(shù)相比具有很大的優(yōu)越性。

第7頁/共82頁3．許多生物活性物質(zhì)，一旦離開了生物體內(nèi)環(huán)境，很易變性及被破壞，應(yīng)十分注意保護這些化合物生物的活性，常選擇十分溫和的條件，盡可能在較低溫度和潔凈環(huán)境中進行。一般來說制備的操作時間長、手續(xù)較繁瑣。因為許多大分子在分離過程中，過酸、過堿、重金屬離子、高溫、劇烈的機械作用、強烈的輻射和機體內(nèi)自身酶的作用，均可破壞這些分子的結(jié)構(gòu)或生理活性。第8頁/共82頁

4．生化分離制備過程幾乎都在溶液中進行，各種溫度、pH、離子強度等參數(shù)，對溶液中各種組成的綜合影響，常常無法固定，有些實驗或工藝的設(shè)計理論性不強，常帶有很大的經(jīng)驗成分。因此，要建立重復(fù)性好的成熟工藝，對生物材料、各種試劑及其輔助材料等都要嚴(yán)格地加以規(guī)定。

第9頁/共82頁5．生化制備方法最后均一性的證明與化學(xué)上純度的概念并不完全相同，這是由于生物分子對環(huán)境反應(yīng)十分敏感，結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系比較復(fù)雜，評定其均一性時，要通過不同角度測定，才能得出相對“均一性”結(jié)論，只憑一種方法所得純度的結(jié)論，往往是片面的，甚至是錯誤的。第10頁/共82頁原料選擇和預(yù)處理

選什么樣的原材料應(yīng)視生產(chǎn)目的而定。一般要注意以下幾個方面:

1．要選擇有效成分含量高的新鮮材料；

2．來源豐富易得；

3．制造工藝簡單易行；

4．成本比較低；

5．經(jīng)濟效果要好。

第11頁/共82頁如蛋白質(zhì)原料的選擇

蛋白質(zhì)類生化產(chǎn)品的原料來源有動植物組織和微生物等，原則是要選擇富含所需蛋白質(zhì)多肽成分的、易于獲得和易于提取的無害生物材料。

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對天然蛋白質(zhì)生化產(chǎn)品，為提高其質(zhì)量、產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本，對原料的種屬、發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來源、解剖部位、生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主菌或細(xì)胞都有一定的要求，了解這些，可使分離純化工作事半功倍，反之則收效甚微。

第13頁/共82頁1．種屬

牛胰含胰島素（isulin)單位比豬胰高，牛為4000IU／kg胰臟，豬為3000IU／kg胰臟?？乖詣t豬胰島素比牛胰島素低，前者與人胰島素相比，只有1個氨基酸的差異，而牛有3個氨基酸的差異。

第14頁/共82頁2．發(fā)育生長階段

幼年動物的胸腺比較發(fā)達，老齡后逐漸萎縮，因此胸腺原料必須采自幼齡動物。

第15頁/共82頁3．生物狀態(tài)

動物飽食后宰殺，胰臟中的胰島素含量增加，對提取胰島素有利，但膽囊收縮素的分泌使膽汁排空，對膽汁的收集不利。嚴(yán)重再生障礙性貧血癥患者尿中的EPO（erythropoietin,紅細(xì)胞生成素）含量增加。

第16頁/共82頁4．原料來源

血管舒緩素可分別從豬胰臟和豬顎下腺中提取，兩者生物學(xué)功能并無二致，而穩(wěn)定性以顎下腺來源為好，因其不含蛋白水解酶。第17頁/共82頁5．原料解剖學(xué)部位

豬胰臟中，胰尾部分含激素較多，而胰頭部分含消化酶較多。如分別摘取則可提高各產(chǎn)品的收率。

胃膜素以采取全胃粘膜為好，胃蛋白酶(pepsin)則以采取胃底部粘膜為好，因胃底部粘膜富含消化酶。

第18頁/共82頁6.從簡化提純步驟著手

如從鴿肝中提取乙?；?，需將動物饑餓后取材，可減少肝糖原，以簡化純化步驟。第19頁/共82頁7．對生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的要求

選擇生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主受體菌或細(xì)胞也應(yīng)考慮到后處理的問題。如用大腸桿菌表達，由于其不能將所表達的蛋白質(zhì)分泌到體外，故提取時必須破壁，增加了提取的困難，而且還可能含有毒素類有害因子；用枯草桿菌

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用腫瘤細(xì)胞作宿主細(xì)胞制成的生化產(chǎn)品還應(yīng)考慮到其安全性，制造體外診斷用試劑則是很好的高產(chǎn)方法?；蚪湍妇魉拗骶?，雖可解決這一矛盾，但表達的蛋白質(zhì)成分仍有缺乏糖基化等翻譯及修飾的缺陷；用動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞表達則能比較好地解決后處理及完整表達的問題。第21頁/共82頁原料的粉碎

在提取前先將大塊的原料粉碎或絞碎成適用的粒度，或?qū)⒓?xì)胞破碎，使胞內(nèi)生物活性物質(zhì)充分釋放到溶液中，有利于提取或吸附。不同的生物體或同一生物體不同的組織，其破碎的難易不一樣，使用的方法也不完全相同。動物的臟器組織，第22頁/共82頁常用絞肉機機械法粉碎；植物肉質(zhì)組織可以磨碎；許多微生物均具有堅韌的細(xì)胞壁，常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、超聲波、加壓處理等破碎方法。如果提取的有效成分是體液或細(xì)菌胞外某些多肽激素、酶等，則不需要破碎細(xì)胞。第23頁/共82頁

主要通過機械力的作用，使組織粉碎。粉碎少量原料時，可使用高速組織搗碎機（10000r／min）、勻漿器、研缽、研船等。工業(yè)生產(chǎn)上一般常用的粉碎設(shè)備有電磨機、球磨機、萬能粉碎機、絞肉機、擊碎機等。

一、機械法

第24頁/共82頁二、物理法1.反復(fù)凍融法

把待破碎的樣品冷至－15～－20℃，使之凝固，然后緩慢地溶解，如此反復(fù)操作，大部分動物性的細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？梢云扑?。第25頁/共82頁

在細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此法。操作時，將材料投入沸水中，在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中，使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。

2.冷熱交替法

第26頁/共82頁3．超聲波處理法

多用于微生物材料，處理的效果與樣品濃度、使用頻率有關(guān)。用大腸桿菌制備各種酶時，常用50～100mg／L菌體的濃度，在1KHz～10KHz（千赫茲）頻率下處理10～15min。對于其他細(xì)菌，則視具體情況而定。操作中注意避免溶液中氣泡的存在，制備對超聲波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。第27頁/共82頁

4.壓破碎法

加氣壓或水壓（如上海高壓勻漿泵廠生產(chǎn)的高壓勻質(zhì)機），達20.59～34.32（兆帕）MPa（210～350kgf／cm2）的壓力時，可使90%以上細(xì)胞被壓碎。多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備。第28頁/共82頁

三、生化及化學(xué)法

1．自溶法

即新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當(dāng)溫度下，利用組織細(xì)胞中自身的酶系將細(xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來的方法。自溶的溫度，動物材料選在0～4℃，微生物材料則多在室溫下進行。第29頁/共82頁

自溶時，需加少量的防腐劑，如甲苯、氯仿等，以防止外界細(xì)菌的污染。因自溶的時間較長，不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白質(zhì)時比較少用。第30頁/共82頁2．酶處理法

用外來酶處理生物材料，如溶菌酶（Lysozyme）是專一地破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的酶。如用噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞制造DNA時，采用pH8的0.1mol／L三羥甲基氨基甲烷（Tris）－0.01mol／L乙二胺四乙酸（EDTA）制成每毫升含2億個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，第31頁/共82頁然后加入100μg～1mg的溶菌酶，在37℃保溫10min，細(xì)菌胞壁即被破壞；還有把蝸牛酶用于酵母細(xì)胞的破碎；用胰酶處理豬腦制備腦安素。用于專一性分解細(xì)胞壁的酶還有纖維素酶（破壞植物細(xì)胞）、細(xì)菌蛋白酶、酯酶、殼糖酶等。

第32頁/共82頁3.表面活性劑處理法

表面活性劑的分子中，兼有親脂性和親水性基團，能降低水的界面張力，具有乳化、分散、增溶作用。較常用的有十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。第33頁/共82頁

生化物質(zhì)的提取

利用一種溶劑對不同物質(zhì)溶解度的差異，從混合物中分離出一種或幾種組分的過程稱為提?。╡xtraction），提取又稱萃取或抽提，其含義基本相同。用冷溶劑從固體物質(zhì)提取的過程可稱為浸漬（maceration）；用熱溶劑者可稱為浸提（digestion），也稱浸煮

第34頁/共82頁一、物質(zhì)的性質(zhì)與提?。ㄒ唬┪镔|(zhì)的性質(zhì)與提取方法的選擇

選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。

（二）活性物質(zhì)的保護措施

1．采用緩沖系統(tǒng)

2．添加保護劑（半胱氨酸，還原性谷胱甘肽等）

3．抑制水解酶的作用(SDS,EDTA)第35頁/共82頁

4．其他保護措施(避免過酸過堿和劇烈攪拌）（三）生化物質(zhì)的提取

一般生產(chǎn)上多用2～3次提取。溶劑用量（L）為生物材料的2～5倍，少數(shù)情況也有用10～20倍量溶劑作一次性提取。目的是節(jié)省提取時間，降低有害酶的作用。

第36頁/共82頁二、影響提取的因素

（－）溫度（二）酸堿度

（三）鹽濃度

第37頁/共82頁四、提取方法

（—）用酸、堿、鹽水溶液提取（二）用表面活性劑提?。ㄈ┯袡C溶劑提取

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對酸性物質(zhì)的提取，常在堿性條件下進行；對堿性物質(zhì)的提取，常在酸性條件下進行；對兩性物質(zhì)的提取，則使水溶液的pH值在該兩性物質(zhì)的等電點附近為佳。第39頁/共82頁三、超臨界氣體的萃取技術(shù)

以氣體為萃取劑，當(dāng)氣體處于超過臨界溫度和臨界壓力時，呈現(xiàn)一種既非液相又非氣相的流體，兼有液體和氣體的特性。如密度接近于液體，粘度卻接近于氣體，具有良好的溶劑性質(zhì)。

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氣體萃取劑必須具有臨界壓力低，臨界溫度接近于室溫，化學(xué)穩(wěn)定性好，價廉易得等特點。主要有二氧化碳、氮氣、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等溫法和等壓法兩種，借助于壓力或溫度的調(diào)節(jié)分離萃取劑與被萃取物。第41頁/共82頁

該技術(shù)應(yīng)用于酶、不飽和脂肪酸的提?。ㄈ玺~油和卵磷脂的提?。?、精制和回收，也可用于生化產(chǎn)品的溶劑脫除。某些生化產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中，采用了丙酮和甲醇溶劑，欲脫去溶劑又要避免產(chǎn)品的分解，需選擇超臨界氣體提取。與減壓干燥法相比較，前者不多消耗能源，且縮短脫溶時間。第42頁/共82頁

五、提取液的分離

提取所得到的溶液，需與固體或另一液體分離。溶液與固體的分離，一股處理方法有三種：自然沉降、過濾、離心。自然沉降是在液體介質(zhì)中，固體自然下沉而分離的過程。當(dāng)混懸液處理量較大，且固體和液體的比重懸殊時，可用此法。沉降分層后，可用虹吸等方法將液體部分移去。過濾系利用多孔材料阻留固體，而使液體

第43頁/共82頁通過，達到固體與液體分離的過程。離心是利用旋轉(zhuǎn)運動的離心力進行分離物料的一種操作，其中通過過濾介質(zhì)分離液體和固體者為離心過濾；利用液體比重的大小分離出不同比重的液體者為離心分離；利用液固兩相比重的差異進行沉降分離者為離心沉降。第44頁/共82頁生化物質(zhì)的分離純化技術(shù)

生化物質(zhì)分離純化技術(shù)包括：生化產(chǎn)品的分離分析和生化產(chǎn)品的制備。前者主要對生物體內(nèi)各組份加以分離后進行定、定量鑒定，它不一定要把某組分從混合物中分離提取出來；而后者則主要是為了獲得生物體內(nèi)某一單純組分。第45頁/共82頁

為了保護目的物的生理活性及結(jié)構(gòu)上的完整性，生物產(chǎn)品的制備中的分離方法多采用溫和的“多階式”方法進行，即常說的“逐級分離”方法。為了純化一種生化物質(zhì)常常要聯(lián)合幾個，甚至十幾個步驟，并不斷變換各種不同類型的分離方法，第46頁/共82頁才能達到目的。因此操的時間長，手續(xù)繁瑣，給制備工作帶來眾多影響。親和層析法具有從復(fù)雜生物組成中專一的“釣出”特異生化成分的特點，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗體和核酸等的純化中得到廣泛應(yīng)用。第47頁/共82頁一分離純化原理

（1）根據(jù)分子形狀和大小不同進行分離。如差速離心與超離心，膜分離（透析、電滲析）與超濾法，凝膠過濾法。

（2）根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）的差異進行分離。如離子交換法，電泳法，等電聚焦法。

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（3）根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點沉淀法及有機溶劑分級沉淀法。（4）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同進行分離。如選擇性吸附與吸附層析法。

（5）根據(jù)配體特異性進行分離——親和層析法。第49頁/共82頁二分離純化的程序和生產(chǎn)設(shè)計（1）確定制備物的研究目的及建立相應(yīng)的分析鑒定方法；（2）制備物的理化性質(zhì)穩(wěn)定性的預(yù)備試驗；（3）材料處理及抽提方法的選擇；

（4）分離純化方法的摸索；第50頁/共82頁

（5）產(chǎn)物的均一性測定。

1．分離純化初期使用方法的選擇

早期分離純化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法較為有利，這些方法負(fù)荷能力大，分離量多兼有分離提純和濃縮作用，為進一步分離純化創(chuàng)造良好的基礎(chǔ)。

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早期分離方法的選擇原則是從低分辨能力到高分辨能力，而且負(fù)荷量較大者為合適，但隨著許多新技術(shù)的建立，一個特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡化，收率愈高，生化物質(zhì)的變性危險愈少，因此親和層析法，纖維素離子交換層析法、連續(xù)流動電泳、連續(xù)流動等電聚焦等在一定條件下，也用于從粗提取液中分離制備小量目的物。第52頁/共82頁2．各種分離純化方法的使用程序

生化物質(zhì)的分離都是在液相中進行，故分離方法主要根據(jù)物質(zhì)的分配系數(shù)，分子量大小，離子電荷性質(zhì)及數(shù)量和外加環(huán)境條件的差別等因素為基礎(chǔ)。

例如純化其一兩性物質(zhì)時，前一步已利用該物質(zhì)的陰離子性質(zhì)，使用了陰離子交換層析法，下一步提純時再應(yīng)用其陽離子性質(zhì)作層析或電泳分離便會取得較好分離效果。第53頁/共82頁

如有些雜質(zhì)在各種條件下帶電荷性質(zhì)可能與目的物相似，其分子形狀與大小與目的物相差較大，而另一些雜質(zhì)的分子形狀與大小可能與目的物相似，但在某條件下與目的物的電荷性質(zhì)不同，在這種情況下，先用分子篩，用離心或膜過濾法除去分子量相差較大的雜質(zhì)，然后在一定pH值和離子強度范圍下，使目的物變成有利的離子狀態(tài)，便能有效地進行色層析分離。

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在安排純化方法順序時，還要考慮到有利于減少工序，提高效率，如在鹽析后采取吸附法，必然會因離子過多而影響吸附效果，如增加透析除鹽，則使操作大大復(fù)雜化。如倒過來進行，先吸附，后鹽析就比較合理。第55頁/共82頁

3．分離后期的保護性措施

在分離操作的后期必須注意避免產(chǎn)品的損失，主要損失途徑是器皿的吸附，操作過程樣品液體的殘留，空氣的氧化和某些事先無法了解的因素。為了取得足夠量的樣品，常常需要加大原材料的用量，并在后期純化工序中注意保持樣品溶液有較高的濃度，以防制備物在稀溶液中的變性，有時常加入一些電解質(zhì)以保護生化物質(zhì)的活性，減少樣品溶液在器皿中的殘留量。第56頁/共82頁三分離純化方法的評估

每一個分離純化步驟的好壞，除了從分辨能力和重現(xiàn)性兩方面考慮外，還要注意方法本身的回收率，特別是制備某些含量很少的物質(zhì)時，回收率的高低十分重要。一般經(jīng)過5～6步提純后，活力回收在25％以上。但不同物質(zhì)的穩(wěn)定性不同、分離難易不同，回收率也不同。第57頁/共82頁

對每一步驟方法的優(yōu)劣的記錄，體現(xiàn)在所得產(chǎn)品重量及活性平衡關(guān)系上。這一關(guān)系，可通過每一步驟的分析鑒定求出。例如酶的分離純化，每一步驟產(chǎn)物重量與活性關(guān)系，通過測定酶的比活力及溶液中蛋白質(zhì)濃度的比例。其他活性物質(zhì)也可通過測定總活性的變化與樣品重量或體積與測出的活力列表進行對比分析，算出每步的提純倍數(shù)及回收率。

第58頁/共82頁四生化產(chǎn)品純度的鑒定

一個制備物是否純，常以“均一性”表示。均一性是指所獲得的制備物只具有一種完全相同的成分，均一性的評價常須經(jīng)過數(shù)種方法的驗證才能肯定。有時某一種測定方法認(rèn)為該物質(zhì)是均一的，但另一種測定方法卻可把它分成兩個甚至更多第59頁/共82頁的組分，這就說明前一種鑒定方法所得的結(jié)果是片面的。如果某物質(zhì)所具有的物理、化學(xué)等方面性質(zhì)經(jīng)過幾種高靈敏度方法的鑒定都是均一的，那么大致可以認(rèn)為它是均一的。當(dāng)然，隨著更好的鑒定方法的出現(xiàn)．還可能發(fā)現(xiàn)它不是均一的。絕對的標(biāo)準(zhǔn)只有把制備物的全部結(jié)構(gòu)搞清楚，并經(jīng)過人工合成證明具有相同生理活性時，才能肯定制備物是絕對純凈的。第60頁/共82頁

生物分子純度的鑒定方法很多，常用的有溶解度法，化學(xué)組成分析法，電泳法，免疫學(xué)方法，離心沉降分析法，各種色譜法，生物功能測定法，以及質(zhì)譜法等。第61頁/共82頁細(xì)胞色素C的制備與測定第62頁/共82頁

細(xì)胞色素C的性質(zhì)

細(xì)胞色素（Cytochrome）是包括多種能夠傳遞電子或能夠激活氧的含鐵蛋白質(zhì)的總稱，廣泛存在于自然界，在各種動物，植物組織和微生物中都能找到。在生物氧化過程中，細(xì)胞色素是重要的呼吸傳遞體。細(xì)胞色素C（CytochromeC）又稱細(xì)胞色素丙，第63頁/共82頁簡稱細(xì)丙。主要存在于線粒體中，需氧多的組織含細(xì)胞色素C最多，如心肌及酵母細(xì)胞的細(xì)胞色素C含量比一般組織細(xì)胞的高。所以制備中多采用心肌和酵母作為提取分離細(xì)胞色素C的原料。第64頁/共82頁

細(xì)胞色素C是含鐵卟啉的結(jié)合蛋白質(zhì)。鐵卟啉和蛋白質(zhì)部分的比例為1:1。由碳、氫、氧、氮、硫、鐵6種元素組成。牛、馬、豬、人心的細(xì)胞色素C蛋白質(zhì)部分均由104個氨基酸組成，其中只有數(shù)個氨基酸不同，氨基酸中含有較多第65頁/共82頁的精氨酸，故呈鹽基性。豬心肌的細(xì)胞色素C含鐵量為0.38～

0.43％，相對分子質(zhì)量12200，等電點pI為10.2～10.8。細(xì)胞色素C的結(jié)構(gòu)中的輔基通過卟啉環(huán)上乙烯基的α-碳和酶蛋白的一SH基按1:1連接成硫醚鍵，其連接方式見下圖。第66頁/共82頁

圖細(xì)胞色素C的結(jié)構(gòu)式第67頁/共82頁

細(xì)胞色素C溶于水，易溶于酸性溶液，故可自酸水中提取。它可分為氧化型和還原型兩種。細(xì)胞色素C的傳遞電子作用是由于細(xì)胞色素C中的鐵原子可以進行可逆的氧化和還原反應(yīng)。R一Fe3+R－Fe2+

氧化型細(xì)胞色素C還原型細(xì)胞色素C

第68頁/共82頁這里R代表細(xì)胞色素C分子中鐵原子以外的卟啉蛋白部分。從以上反應(yīng)式可見，當(dāng)細(xì)胞色素C分子中的鐵原子為三價時(Fe3十)，是氧化型的，但接受一個電子后變成二價鐵（Fe2+），成了還原型的細(xì)胞色素c分子，電子一旦給出后又成了氧化型的。兩者在水溶液中的顏色明顯不同：其氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。第69頁/共82頁細(xì)胞色素C對熱較穩(wěn)定，不易變性，在pH7.2～10.2時，加熱至100℃3min，變性才18～28%。對酸堿比較穩(wěn)定，可抵抗0.3mol／LHCl和0.1mol/LKOH的長時間處理。但三氯醋酸和乙酸可使之變性，引起某些失活。第70頁/共82頁其還原型較氧化型穩(wěn)定，不易與一氧化碳（CO）、氰化鉀（KCN）結(jié)合，故一般都制成還原型，比較穩(wěn)定，易保存細(xì)胞色素C溶液容易染菌，故需加少量氯仿和低溫保存，亦可保存于硫酸銨溶液中或加4倍量冷丙酮沉淀制成凍干粉末，可保持活性數(shù)年。第71頁/共82頁細(xì)胞色素C的臨床作用

細(xì)胞色素C是一種細(xì)胞呼吸激活劑。在臨床上細(xì)胞呼吸障礙引起的一系列缺氧狀態(tài)，在使用細(xì)胞色素C后就可以糾正其物質(zhì)的代謝，使細(xì)胞恢復(fù)正常呼吸，病情得到緩解第72頁/共82頁或痊愈。細(xì)胞色素C目前在臨床上雖非特效藥物，但可用于缺氧急救、解毒及其輔助治療，是治療組織缺氧及由缺氧所引起的一系列癥狀的重要生物藥品。第73頁/共82頁如用細(xì)胞色素C治療腦血管障礙、腦軟化、腦出血、中風(fēng)后遺癥、腦動脈硬化癥、腦外傷、嬰幼兒百日咳、腦病、不可逆休克期缺氧、腦栓塞、腦震蕩后遺癥、乙型腦炎的神經(jīng)精神癥狀、心代償不全、心肌炎、狹心癥、白喉心肌炎、肺心病、心絞痛、第74頁/共82頁心肌梗塞、肺炎、肺癌、硅肺、喘息、肺氣腫及支氣管擴張引起的呼吸困難、一氧化碳中毒、安眠藥中毒、麻醉前處理、新生兒假死、神經(jīng)麻痹癥等。對抗癌藥物引起的白血球降低、四肢血行障礙、肝疾患、腎炎等亦有一定療效。第75頁/共82頁細(xì)胞色素C(Cyt.C)的制備及含量測定

每組稱心肌碎肉150g，加自來水300mL（水預(yù)先用6～7mL1mol/LH2SO4酸化）

用1mol/LH2SO4調(diào)pH3.8～4.0（需不斷調(diào)整）

攪拌提取1.5h

用1mol/LNH4OH調(diào)pH6.0用四層紗布擠壓過濾，收集濾液（暗紫色，渾濁），肉渣回收

用1mol/LNH4OH調(diào)pH7.5～8.0，靜置10～30min，使溶液分層

虹吸上部溶液，過濾除雜質(zhì)，下部渾濁液離心（3000rpm，15min）

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每人稱人造沸石4g合并清液

浮選平均分成兩份自來水裝柱

上樣（流速不大于10mL/min）

Cyt.C吸附，沸石呈紅色，流出液為黃色（或淺紅色）

依次用30mL自來水、去離子水、

0.2%NaCl、去離子水洗柱用25%(NH4)2SO4洗脫（流速小于2mL/min）