生化實驗三果蔬中蛋白質含量測定

生化實驗三果蔬中蛋白質含量測定第1頁/共32頁綜合實驗一：果蔬成分的生化分析實驗一果蔬中維生素C的定量測定（4學時）實驗二果蔬中總糖及還原糖含量的測定（4學時）實驗三果蔬中蛋白質含量的測定（4學時）實驗四果蔬中過氧化物酶分析（12學時）第2頁/共32頁實驗材料：冬棗＋柚子——1～4組梨（2個品種）——5～8組盤菜＋蘿卜——9～12組第3頁/共32頁實驗三果蔬中蛋白質含量的測定（考馬斯亮藍法）第4頁/共32頁一、目的

1、掌握蛋白質測定的方法和技術。

2、了解果蔬中蛋白質的含量。第5頁/共32頁二、原理考馬斯亮藍G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當它與蛋白質結合后變?yōu)樗{色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白質濃度范圍內，蛋白質-染料復合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質含量成正比，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。第6頁/共32頁三、實驗器材1、可見光分光光度計2、旋渦混合器3、試管16支第7頁/共32頁四、實驗試劑1、標準蛋白質溶液——牛血清清蛋白(bsa)：配制成1.0mg/mL和0.1mg/mL的標準蛋白質溶液。2、考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50mL95%的乙醇后，再加入120mL85%的磷酸，用水稀釋至1L。3、0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）4、各種果蔬第8頁/共32頁五、操作1、標準曲線繪制：取6支試管，按下表加入各試劑。

管號試劑012345100g

/mL牛血清白蛋白溶液／mL00.20.40.60.81.0蒸餾水／mL1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍液／mL5.05.05.05.05.05.0第9頁/共32頁

加入考馬斯亮藍G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長下比色測定，記錄A595。以各管相應標準蛋白質含量（g）為橫坐標、A595為縱坐標，繪制標準曲線。第10頁/共32頁2、樣品制備：稱取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內，加入1mLH2O或0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）研成勻漿，轉入離心管，再用2mL水或緩沖液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉入離心管，3500rpm離心15～20min，其上清液即為蛋白質提取液，供分析用。（注：盤菜，蘿卜稀釋至10mL）第11頁/共32頁3、樣品測定：試管中加自制蛋白質樣品1.0mL，再加入5.0mL考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻，放置5min后，在595nm波長下比色，記錄A595。根據所測A595從標準曲線上查得蛋白質含量。第12頁/共32頁注意事項：⑴、如果測定要求很嚴格，可以在試劑加入后的5～20min內測定光吸收，因為在這段時間內顏色是最穩(wěn)定的。比色反應需在1h內完成。⑵、測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，實驗證明此復合物的吸附量是可以忽略的。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，測定完后可用95%的乙醇將藍色的比色杯洗干凈。第13頁/共32頁實驗三果蔬中蛋白質含量的測定（Folin-酚試劑法

）第14頁/共32頁一、目的

1、掌握蛋白質測定的方法和技術。

2、了解果蔬中蛋白質的含量。第15頁/共32頁二、原理

Folin-酚試劑法是雙縮脲法的發(fā)展。其試劑由甲、乙兩部分組成。甲試劑相當于雙縮脲試劑，可與肽鍵起呈色反應。乙試劑（即Folin-酚試劑）在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍色（鉬藍和鎢蘭的混合物），其顏色深淺與蛋白質的含量成正比，因此通過比色可測定蛋白質的濃度。本方法最大的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏100倍，較紫外分光光度法靈敏10～20倍。第16頁/共32頁三、實驗器材1、分光光度計2、電熱恒溫水浴箱3、試管15×150mm4、刻度吸管0.5mL、1mL、5mL5、試管架6、容量瓶500mL7、坐標紙第17頁/共32頁四、實驗試劑1、甲試劑：①：2g無水碳酸鈉，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液100mL混勻；②：稱取CuSO4·5H2O0.5g，加入1%（35mmol/L）酒石酸鉀鈉溶液100mL，混勻。使用前將①與②按50:1混合即成堿性硫酸銅溶液。（混合后，試劑只能使用一天，但堿性溶液和0.5%CuSO4·5H2O溶液可分別長期保存）第18頁/共32頁2、乙試劑：在2L磨口回流裝置中加入100g鎢酸鈉，25g鉬酸鈉及700mL蒸餾水，再加入50mL85%磷酸及100mL濃HCl，充分混合后用小火回流10小時?；亓魍戤吚鋮s后，加入150g鋰，50mL蒸餾水及液體溴數滴，搖勻后再開口沸騰15分鐘，以驅逐過量溴。溶液冷卻后稀釋至1000mL，溶液呈透明淡黃色，置于棕色瓶中暗處冰箱內可長期保存。使用前用標準NaOH溶液標定，以酚酞為指示劑，標定其酸度為1mol/L，此為乙試劑應用液，置冰箱中可長期保存。第19頁/共32頁3、牛血清白蛋白標準液（200g/mL）：準確稱取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/LNaOH溶液潤濕溶解，加蒸餾水到250mL。4、0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）5、各種果蔬第20頁/共32頁五、操作1、標準曲線繪制：取7支試管，按下表加入各試劑。試劑0123456牛血清白蛋白標準液0.0mL0.1mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL蒸餾水1.0mL0.9mL0.8mL0.6mL0.4mL0.2mL0.0mL甲試劑5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL混勻，于20～25℃（或室溫下）放置10min乙試劑0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL第21頁/共32頁

迅速混勻，20～25℃（或室溫下）放置30min，用分光光度計，在波長500nm下，以“0”號管調零，測定各管吸光度。以各管吸光度為縱坐標，各標準蛋白濃度為橫坐標，繪制標準曲線。第22頁/共32頁2、樣品制備：稱取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內，加入1mLH2O或0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）研成勻漿，轉入離心管，再用2mL水或緩沖液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉入離心管，3500rpm離心15～20min，其上清液即為蛋白質提取液，供分析用。（注：盤菜，蘿卜稀釋至10mL）第23頁/共32頁3、樣品測定：取2只試管編號，按下表加入試劑：試劑空白管測定管蛋白質提取液-1.0mL蒸餾水1.0mL-甲試劑5.0mL5.0mL混勻，于20～25℃（或室溫下）放置10min乙試劑0.5mL0.5mL第24頁/共32頁

迅速混勻，20～25℃（或室溫下）放置30min，用分光光度計，在波長500nm下，以“0”號管調零，測定各管吸光度六、結果處理根據測定管吸光度，在標準曲線上查出對應的標準蛋白質的濃度，再乘以稀釋倍數，即為每克鮮果蔬中蛋白質的微克數。第25頁/共32頁注意事項：1、Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，在加入到堿性的銅離子-蛋白質溶液中時（pH約10），必須立即混勻，以便在磷鉬酸、磷鎢酸試劑破壞之前，即發(fā)生還原反應。2、本法受多種因素干擾，凡對雙縮脲反應起干擾作用的基團以及在性質上是氨基酸或肽的緩沖液均可干擾Folin-酚反應。第26頁/共32頁3、所測蛋白質樣品中若含酚類及檸檬酸也會干擾Folin-酚反應。在測試時應排除干擾因素或作空白試驗。濃度較低的尿素、胍、三氯乙酸、乙醚等（各0.5%左右）、硫酸鈉、硝酸鈉（各1%）、乙醇（5%）