生化實(shí)驗(yàn)三果蔬中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

生化實(shí)驗(yàn)三果蔬中蛋白質(zhì)含量測(cè)定第1頁(yè)/共32頁(yè)綜合實(shí)驗(yàn)一：果蔬成分的生化分析實(shí)驗(yàn)一果蔬中維生素C的定量測(cè)定（4學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)二果蔬中總糖及還原糖含量的測(cè)定（4學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)三果蔬中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（4學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)四果蔬中過(guò)氧化物酶分析（12學(xué)時(shí)）第2頁(yè)/共32頁(yè)實(shí)驗(yàn)材料：冬棗＋柚子——1～4組梨（2個(gè)品種）——5～8組盤菜＋蘿卜——9～12組第3頁(yè)/共32頁(yè)實(shí)驗(yàn)三果蔬中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)法）第4頁(yè)/共32頁(yè)一、目的

1、掌握蛋白質(zhì)測(cè)定的方法和技術(shù)。

2、了解果蔬中蛋白質(zhì)的含量。第5頁(yè)/共32頁(yè)二、原理考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在波長(zhǎng)為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。第6頁(yè)/共32頁(yè)三、實(shí)驗(yàn)器材1、可見(jiàn)光分光光度計(jì)2、旋渦混合器3、試管16支第7頁(yè)/共32頁(yè)四、實(shí)驗(yàn)試劑1、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液——牛血清清蛋白(bsa)：配制成1.0mg/mL和0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。2、考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50mL95%的乙醇后，再加入120mL85%的磷酸，用水稀釋至1L。3、0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）4、各種果蔬第8頁(yè)/共32頁(yè)五、操作1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取6支試管，按下表加入各試劑。

管號(hào)試劑012345100g

/mL牛血清白蛋白溶液／mL00.20.40.60.81.0蒸餾水／mL1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)液／mL5.05.05.05.05.05.0第9頁(yè)/共32頁(yè)

加入考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，記錄A595。以各管相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（g）為橫坐標(biāo)、A595為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。第10頁(yè)/共32頁(yè)2、樣品制備：稱取1g待測(cè)植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi)，加入1mLH2O或0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2mL水或緩沖液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管，3500rpm離心15～20min，其上清液即為蛋白質(zhì)提取液，供分析用。（注：盤菜，蘿卜稀釋至10mL）第11頁(yè)/共32頁(yè)3、樣品測(cè)定：試管中加自制蛋白質(zhì)樣品1.0mL，再加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻，放置5min后，在595nm波長(zhǎng)下比色，記錄A595。根據(jù)所測(cè)A595從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量。第12頁(yè)/共32頁(yè)注意事項(xiàng)：⑴、如果測(cè)定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5～20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。比色反應(yīng)需在1h內(nèi)完成。⑵、測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，實(shí)驗(yàn)證明此復(fù)合物的吸附量是可以忽略的。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，測(cè)定完后可用95%的乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。第13頁(yè)/共32頁(yè)實(shí)驗(yàn)三果蔬中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（Folin-酚試劑法

）第14頁(yè)/共32頁(yè)一、目的

1、掌握蛋白質(zhì)測(cè)定的方法和技術(shù)。

2、了解果蔬中蛋白質(zhì)的含量。第15頁(yè)/共32頁(yè)二、原理

Folin-酚試劑法是雙縮脲法的發(fā)展。其試劑由甲、乙兩部分組成。甲試劑相當(dāng)于雙縮脲試劑，可與肽鍵起呈色反應(yīng)。乙試劑（即Folin-酚試劑）在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢蘭的混合物），其顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此通過(guò)比色可測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。本方法最大的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏100倍，較紫外分光光度法靈敏10～20倍。第16頁(yè)/共32頁(yè)三、實(shí)驗(yàn)器材1、分光光度計(jì)2、電熱恒溫水浴箱3、試管15×150mm4、刻度吸管0.5mL、1mL、5mL5、試管架6、容量瓶500mL7、坐標(biāo)紙第17頁(yè)/共32頁(yè)四、實(shí)驗(yàn)試劑1、甲試劑：①：2g無(wú)水碳酸鈉，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液100mL混勻；②：稱取CuSO4·5H2O0.5g，加入1%（35mmol/L）酒石酸鉀鈉溶液100mL，混勻。使用前將①與②按50:1混合即成堿性硫酸銅溶液。（混合后，試劑只能使用一天，但堿性溶液和0.5%CuSO4·5H2O溶液可分別長(zhǎng)期保存）第18頁(yè)/共32頁(yè)2、乙試劑：在2L磨口回流裝置中加入100g鎢酸鈉，25g鉬酸鈉及700mL蒸餾水，再加入50mL85%磷酸及100mL濃HCl，充分混合后用小火回流10小時(shí)?；亓魍戤吚鋮s后，加入150g鋰，50mL蒸餾水及液體溴數(shù)滴，搖勻后再開(kāi)口沸騰15分鐘，以驅(qū)逐過(guò)量溴。溶液冷卻后稀釋至1000mL，溶液呈透明淡黃色，置于棕色瓶中暗處冰箱內(nèi)可長(zhǎng)期保存。使用前用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液標(biāo)定，以酚酞為指示劑，標(biāo)定其酸度為1mol/L，此為乙試劑應(yīng)用液，置冰箱中可長(zhǎng)期保存。第19頁(yè)/共32頁(yè)3、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（200g/mL）：準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/LNaOH溶液潤(rùn)濕溶解，加蒸餾水到250mL。4、0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）5、各種果蔬第20頁(yè)/共32頁(yè)五、操作1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取7支試管，按下表加入各試劑。試劑0123456牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.0mL0.1mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL蒸餾水1.0mL0.9mL0.8mL0.6mL0.4mL0.2mL0.0mL甲試劑5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL混勻，于20～25℃（或室溫下）放置10min乙試劑0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL第21頁(yè)/共32頁(yè)

迅速混勻，20～25℃（或室溫下）放置30min，用分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)500nm下，以“0”號(hào)管調(diào)零，測(cè)定各管吸光度。以各管吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。第22頁(yè)/共32頁(yè)2、樣品制備：稱取1g待測(cè)植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi)，加入1mLH2O或0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.8）研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2mL水或緩沖液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管，3500rpm離心15～20min，其上清液即為蛋白質(zhì)提取液，供分析用。（注：盤菜，蘿卜稀釋至10mL）第23頁(yè)/共32頁(yè)3、樣品測(cè)定：取2只試管編號(hào)，按下表加入試劑：試劑空白管測(cè)定管蛋白質(zhì)提取液-1.0mL蒸餾水1.0mL-甲試劑5.0mL5.0mL混勻，于20～25℃（或室溫下）放置10min乙試劑0.5mL0.5mL第24頁(yè)/共32頁(yè)

迅速混勻，20～25℃（或室溫下）放置30min，用分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)500nm下，以“0”號(hào)管調(diào)零，測(cè)定各管吸光度六、結(jié)果處理根據(jù)測(cè)定管吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克鮮果蔬中蛋白質(zhì)的微克數(shù)。第25頁(yè)/共32頁(yè)注意事項(xiàng)：1、Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，在加入到堿性的銅離子-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)（pH約10），必須立即混勻，以便在磷鉬酸、磷鎢酸試劑破壞之前，即發(fā)生還原反應(yīng)。2、本法受多種因素干擾，凡對(duì)雙縮脲反應(yīng)起干擾作用的基團(tuán)以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液均可干擾Folin-酚反應(yīng)。第26頁(yè)/共32頁(yè)3、所測(cè)蛋白質(zhì)樣品中若含酚類及檸檬酸也會(huì)干擾Folin-酚反應(yīng)。在測(cè)試時(shí)應(yīng)排除干擾因素或作空白試驗(yàn)。濃度較低的尿素、胍、三氯乙酸、乙醚等（各0.5%左右）、硫酸鈉、硝酸鈉（各1%）、乙醇（5%）