重組DNA技術交課件

第十四章

重組DNA技術

重組DNA技術的發(fā)展簡史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗1973年美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉第一節(jié)重組DNA技術的相關概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體宿主細胞DNA克隆

應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。重組DNA技術實現(xiàn)DNA克隆所采用的方法及相關的工作統(tǒng)稱為重組DNA技術或重組DNA工藝學(recombinantDNAbiotechnology)，又稱為基因工程（遺傳工程）。二、工具酶限制性核酸內切酶DNA連接酶堿性磷酸酶DNA聚合酶Ⅰ末端轉移酶TaqDNA聚合酶反轉錄酶重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接堿性磷酸酶切除末端磷酸基合成雙鏈DNA聚合酶ⅠcDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析限制性核酸內切酶定義限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。GCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGG第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GCATGCCGTACG同功異源酶來源不同，但能識別和切割同一位點的限制酶，稱為同功異源酶

。（來源不同的同一種限制性內切酶）GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ

有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同裂酶（isoschizomer）

識別同一序列，但切割位置不同，這類酶互稱為同裂酶（isoschizomer）。XmaⅠSmaⅠ

CCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCGGGCCCCGGGC++CCCGGG

GGGCCC以質粒為載體的DNA克隆過程二、重組DNA技術步驟1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)（一）目的基因的獲取化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列mRNA

cDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫

反轉錄酶載體受體菌復制從cDNA文庫獲取目的基因逆轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構建BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接2.平端連接適用于：限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶15oC載體自連目的基因自連重組體4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。

人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導入受體菌（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學方法如免疫化學方法及酶聯(lián)免疫檢測分析等(插入失活法)抗藥性標記選擇組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救α互補α互補的檢測原位雜交Southern印跡雞的β肌球蛋白的克隆和檢出重組DNA技術操作過程可形象歸納為：小結分分離目的基因

切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉轉入受體菌

篩篩選重組體

重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交表達體系的建立表達載體的構建受體細胞的建立表達產物的分離純化（六）克隆基因的表達1.原核表達體系

（E.coli表達體系最為常用）標準：選擇標志 強啟動子翻譯調控序列 多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足

不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質表達的蛋白質常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

很難表達大量可溶性蛋白大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌 優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質表達產物分區(qū)域積累缺點：操作技術難、費時、經濟轉染

——將表達載體導入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉染DEAE葡聚糖介導轉染電穿孔脂質體轉染顯微注射

2.真核表達體系

（

酵母、昆蟲、乳類動物細胞）表達載體pFASTBACI的物理圖譜一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質，而認識疾病的分子機制。二、生物制藥第三節(jié)重組DNA技術與醫(yī)學的關系重組DNA醫(yī)藥產品產品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物學及分子遺傳的技術和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。三、基因診斷基本過程區(qū)分或鑒定DNA的異常分離、擴增待測的DNA片斷標準.能正確擴增靶基因；.能準確區(qū)分單個堿基的差別；.本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定;.便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。四、基因治療定義

基因治療(genetherapy)是向有功能缺陷的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的。方式體細胞基因治療(somaticcellgenetherapy)性細胞基因治療(germlinegenetherapy)1.產前診斷2.攜帶者測試3.癥候前診斷4.遺傳病易感性五、遺傳疾病的預防1.什么是DNA克??？什么是限制性核酸內切酶？應用酶學的方法，在體外將各種來源的DNA與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，就稱為DNA克隆也稱為基因克隆

。限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶?！舅伎碱}】2.什么是基因組文庫？什么是cDNA文庫？采用物理方法或限制性核酸內切酶將染色體DNA切割，繼而將所獲得的片段與適當克隆載體連接，將重組DNA轉入受體菌中擴增，每個細菌內都攜帶一種重組DNA分子的多個拷貝。全部細菌所攜帶的各種染色體DNA片段就涵蓋了基因組全部信息，這個攜帶所有基因組DNA的集合即稱為基因組文庫。以細胞mRNA為模板，利用反轉錄酶合成與mRNA互補的DNA，再復制成雙鏈cDNA片段，與適當載體連接后轉入受體菌，擴增后可獲得含有相應