HIV抗體檢測(cè)與質(zhì)量控制

HIV抗體檢測(cè)與質(zhì)量控制現(xiàn)在是1頁\一共有58頁\編輯于星期一滋病毒（人類免疫缺陷病毒）艾滋病毒（即人類免疫缺陷病毒）是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，它具有極強(qiáng)的迅速變異能力，這一特征不僅使人體的免疫系統(tǒng)難以抵御其侵害，而且給特效治療藥物和預(yù)防用疫苗的研制帶來困難。艾滋病毒直接侵犯人體的免疫系統(tǒng)，破壞人體的細(xì)胞免疫和體液免疫。它主要存在于感染者和病人的體液（如血液、精液、陰道分泌物、乳汁等）及多種器官中，它可通過含HIV的體液交換或器官移植而傳播?，F(xiàn)在是2頁\一共有58頁\編輯于星期一病毒現(xiàn)狀

在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致了近1200萬人的死亡，超過3000萬人受到感染。在感染后會(huì)整合入宿主細(xì)胞的基因組中，而抗病毒治療并不能把病毒根除。在2004年底，全球有約四千萬被感染并與人類免疫缺陷病毒共同生存的人，流行狀況最為嚴(yán)重的仍是撒哈拉以南非洲。1986年7月25日，世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布公報(bào)，國(guó)際病毒分類委員會(huì)會(huì)議決定，把艾滋病病毒改稱為人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）簡(jiǎn)稱HIV。現(xiàn)在是3頁\一共有58頁\編輯于星期一病毒特點(diǎn)

HIV病毒主要攻擊人體的輔助T淋巴細(xì)胞系統(tǒng)；一旦侵入機(jī)體細(xì)胞，病毒會(huì)和細(xì)胞整合在一起終生難以消除；病毒基因變化多樣；廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經(jīng)癥狀的腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高；對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較弱，對(duì)乙肝病毒有效的消毒方法對(duì)艾滋病病毒消毒也有效；感染者潛伏期長(zhǎng)、死亡率高；艾滋病病毒的基因組比已知任何一種病毒基因都復(fù)雜。

現(xiàn)在是4頁\一共有58頁\編輯于星期一體外生存

人類免疫缺陷病毒在人體外生存能力極差，不耐高溫，抵抗力較低，離開人體不易生存，常溫下只可生存數(shù)小時(shí)至數(shù)天。HIV對(duì)熱敏感。在56℃條件下30分鐘即失去活性，但在室溫保存7天，仍保持活性?，F(xiàn)在是5頁\一共有58頁\編輯于星期一滅活方法

國(guó)際衛(wèi)生組織推薦對(duì)艾滋病病毒滅活加熱100℃持續(xù)20分鐘，效果較理想?，F(xiàn)在是6頁\一共有58頁\編輯于星期一

病毒形態(tài)人類免疫缺陷病毒直徑約120納米，大致呈球形?，F(xiàn)在是7頁\一共有58頁\編輯于星期一

致病機(jī)制HIV選擇性的侵犯帶有CD4分子，主要有T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等?，F(xiàn)在是8頁\一共有58頁\編輯于星期一傳播途徑

HIV感染者是傳染源，曾從血液、精液、唾液、尿液、陰道分泌液、眼淚、乳汁等分離得HIV。性接觸傳播血液傳播

母嬰傳播現(xiàn)在是9頁\一共有58頁\編輯于星期一

疾病診斷HIV抗體篩查試驗(yàn)ELISA試驗(yàn)化學(xué)發(fā)光法快速檢測(cè)補(bǔ)充試驗(yàn)抗體確證試驗(yàn)：免疫印跡試劑（WB）和條帶免疫試驗(yàn)（RIBA）核酸試驗(yàn)：核酸定性和核酸定量試驗(yàn)

現(xiàn)在是10頁\一共有58頁\編輯于星期一HIV抗體檢測(cè)目的HIV抗體檢測(cè)可用于診斷、血液篩查、監(jiān)測(cè)等。以診斷為目的的檢測(cè)是為了確定個(gè)體HIV感染狀況，包括臨床檢測(cè)、自愿咨詢檢測(cè)、根據(jù)特殊需要進(jìn)行的體檢等。以血液篩查為目的的檢測(cè)是為了防止輸血傳播HIV，包括獻(xiàn)血員篩查和原料血漿篩查。以監(jiān)測(cè)為目的的檢測(cè)是為了解不同人群HIV感染率及其變化趨勢(shì)，包括各類高危人群、重點(diǎn)人群和一般人群?，F(xiàn)在是11頁\一共有58頁\編輯于星期一HIV抗體篩查樣品

血清/血漿/全血濾紙干血斑口腔黏膜滲出液尿液現(xiàn)在是12頁\一共有58頁\編輯于星期一篩查試劑

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)有效期內(nèi)酶聯(lián)免疫試劑應(yīng)批批檢合格選擇敏感性和特異性高的試劑現(xiàn)在是13頁\一共有58頁\編輯于星期一篩查方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)（CIA/IFA）：采用發(fā)光或熒光底物，用發(fā)光或熒光儀測(cè)定結(jié)果快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn)

現(xiàn)在是14頁\一共有58頁\編輯于星期一酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）HIV抗體檢測(cè)試劑（第三代）：檢測(cè)HIV-1/2抗體HIV抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑（第四代）：可同時(shí)檢測(cè)血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗體用酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果有效試驗(yàn)的陰性和陽性對(duì)照必須符合試劑盒規(guī)定現(xiàn)在是15頁\一共有58頁\編輯于星期一ELISA試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題和原因分析問題可能的原因（非試劑盒本身的原因）測(cè)定的重復(fù)性差1.加樣本及試劑量不準(zhǔn)2.加樣過快，孔間發(fā)生污染3.加錯(cuò)樣本4.加樣本和試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū)5.溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致6.酶標(biāo)儀濾光片問題現(xiàn)在是16頁\一共有58頁\編輯于星期一ELISA試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題和原因分析問題可能的原因（非試劑盒本身的原因）白板（陽性對(duì)照不顯色）1.漏加酶結(jié)合物2.洗液配制問題，量筒不干凈含酶抑制物3.漏加顯色劑A或B4.終止液當(dāng)顯色劑使用全部板孔都有顯色1.洗板不干凈2.加底物的吸頭被酶污染3.洗板液受酶污染4.由于儀器或加樣頭造成的交叉污染現(xiàn)在是17頁\一共有58頁\編輯于星期一ELISA測(cè)定中的干擾因素內(nèi)源性干擾因素外源性干擾因素現(xiàn)在是18頁\一共有58頁\編輯于星期一內(nèi)源性干擾因素

人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果。常見的有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗體、自身抗體、溶菌酶、磷脂、藥物小分子等現(xiàn)在是19頁\一共有58頁\編輯于星期一外源性干擾因素常常是由于血標(biāo)本的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標(biāo)本溶血、細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過長(zhǎng)、凝集不全、反復(fù)凍融等現(xiàn)在是20頁\一共有58頁\編輯于星期一分析ELISA測(cè)定中出現(xiàn)的假陽性或假陰性結(jié)果時(shí)，需綜合考慮試劑因素、操作因素和標(biāo)本因素等?，F(xiàn)在是21頁\一共有58頁\編輯于星期一ELISA法結(jié)果判斷臨界值概念:將檢測(cè)的陽性和（或）陰性對(duì)照的OD值代入計(jì)算公式計(jì)算出來的判斷陽性和陰性結(jié)果的界值判斷標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)本OD值與臨界值的比值大于等于1(S/CO≥1)為陽性注意:不同廠家、不同方法臨界值計(jì)算公式不同現(xiàn)在是22頁\一共有58頁\編輯于星期一酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性高、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)客觀、結(jié)果便于記錄和保存用途：流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及臨床大量標(biāo)本的檢測(cè)現(xiàn)在是23頁\一共有58頁\編輯于星期一化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)采用發(fā)光或熒光底物既可檢測(cè)抗體，也可聯(lián)合檢測(cè)抗原抗體酶或熒光標(biāo)記的HIV抗原或抗體，加發(fā)光或熒光底物用發(fā)光儀或熒光儀測(cè)定結(jié)果現(xiàn)在是24頁\一共有58頁\編輯于星期一（1）免疫滲濾試驗(yàn)：斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)以硝酸纖維膜為載體HIV抗原點(diǎn)狀固定在膜上加待檢樣品陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)有效試驗(yàn)的質(zhì)控點(diǎn)必須顯色快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn)現(xiàn)在是25頁\一共有58頁\編輯于星期一斑點(diǎn)免疫膠體金快速診斷試驗(yàn)現(xiàn)在是26頁\一共有58頁\編輯于星期一（2）免疫層析試驗(yàn)：以硝酸纖維膜為載體HIV抗原線狀固定在膜上待檢樣品（血液、唾液或尿液）沿著固相載體遷移陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色條帶有效試驗(yàn)的質(zhì)控帶必須顯色第四代快速試劑（SD）：可區(qū)分抗原抗體的檢測(cè)現(xiàn)在是27頁\一共有58頁\編輯于星期一現(xiàn)在是28頁\一共有58頁\編輯于星期一全血樣品加50ul樣品于樣品墊中手指血方法靜脈血方法加一滴緩沖液15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn)現(xiàn)在是29頁\一共有58頁\編輯于星期一病人條質(zhì)控條現(xiàn)在是30頁\一共有58頁\編輯于星期一現(xiàn)在是31頁\一共有58頁\編輯于星期一快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn):快速單份標(biāo)本檢測(cè)不需額外試劑或設(shè)備操作簡(jiǎn)便缺點(diǎn):肉眼判斷較主觀價(jià)格較貴結(jié)果不易保存（建議拍照保存）現(xiàn)在是32頁\一共有58頁\編輯于星期一HIV篩查試劑的選擇檢測(cè)目的實(shí)驗(yàn)設(shè)施條件價(jià)格其他：檢測(cè)數(shù)量、標(biāo)本用量、復(fù)檢問題、習(xí)慣等等現(xiàn)在是33頁\一共有58頁\編輯于星期一試劑-1有反應(yīng)

無反應(yīng)

試劑1雙份或雙孔檢測(cè)或兩種試劑*均有反應(yīng)

一有反應(yīng),一無反應(yīng)

均無反應(yīng)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)報(bào)告HIV抗體陰性

圖2使用抗體檢測(cè)試劑的檢測(cè)流程*兩種試劑可以是原有試劑加另一種試劑，也可以是兩種不同試劑。臨床診斷相關(guān)的檢測(cè)策略使用抗體檢測(cè)試劑的篩查檢測(cè)流程現(xiàn)在是34頁\一共有58頁\編輯于星期一HIV抗體篩查結(jié)果的意義及處理陰性：真陰性未感染HIV病毒假陰性注意窗口期陽性：真陽性感染HIV病毒假陽性非特異性反應(yīng)操作失誤處理：篩查試驗(yàn)無反應(yīng)報(bào)告為“HIV抗體陰性”；有反應(yīng)必須進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢兩次檢測(cè)均無反應(yīng)報(bào)告為“HIV抗體陰性”，復(fù)檢檢測(cè)均有反應(yīng)或一個(gè)有反應(yīng)一個(gè)無反應(yīng)需進(jìn)行“補(bǔ)充試驗(yàn)”；報(bào)告為“HIV感染待確定”，不能出具陽性報(bào)告?，F(xiàn)在是35頁\一共有58頁\編輯于星期一補(bǔ)充試驗(yàn)

是通過檢測(cè)樣本中是否存在艾滋病病毒抗體或者核酸確定艾滋病病毒感染的檢測(cè)方法。

補(bǔ)充試驗(yàn)包括抗體確證試驗(yàn)[免疫印跡試驗(yàn)、條帶/線性免疫試驗(yàn)，特定條件下的替代檢測(cè)（三種酶聯(lián)免疫、三種快速試驗(yàn)或酶聯(lián)加快速試驗(yàn)），免疫層析和核酸檢測(cè)試驗(yàn)（核酸定性檢測(cè)和核酸定量檢測(cè)試驗(yàn)）現(xiàn)在是36頁\一共有58頁\編輯于星期一HIV抗體確證試驗(yàn)確證試驗(yàn)的試劑：必須是經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)、在有效期內(nèi)的試劑。確證樣品：可采用血清、血漿、濾紙干血斑確證試驗(yàn)方法：

免疫印跡試驗(yàn)、條帶/線性免疫試驗(yàn)，特定條件下的替代檢測(cè)（三種酶聯(lián)免疫、三種快速試驗(yàn)或酶聯(lián)加快速試驗(yàn)），免疫層析或免疫滲濾試驗(yàn)現(xiàn)在是37頁\一共有58頁\編輯于星期一條帶免疫試驗(yàn)（RIBA）/重組免疫印跡法（萬泰）現(xiàn)在是38頁\一共有58頁\編輯于星期一陽性免疫印跡試驗(yàn)（WB/RIBA）陰性不確定核酸試驗(yàn)或2-4周后隨訪出現(xiàn)HIV-2指示帶根據(jù)情況進(jìn)一步檢測(cè)HIV-2報(bào)告HIV-1抗體陰性報(bào)告HIV-1抗體陽性圖5免疫印跡試劑（WB/RIBA）試驗(yàn)流程抗體確證試驗(yàn)檢測(cè)流程現(xiàn)在是39頁\一共有58頁\編輯于星期一HIV抗體WB及RIBA/LIA試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告：（1）符合HIV-1抗體陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告“HIV-1抗體陽性”，并按規(guī)定做好檢測(cè)后咨詢和疫情報(bào)告。符合HIV-2抗體陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告“HIV-2抗體陽性”，并按規(guī)定做好檢測(cè)后咨詢和疫情報(bào)告。（2）符合HIV抗體陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告“HIV抗體陰性”。如疑似“窗口期”感染，建議2-4周后隨訪或進(jìn)一步做HIV核酸檢測(cè)，盡早明確診斷。（3）符合HIV抗體不確定判斷標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告“HIV抗體不確定”，在備注中應(yīng)注明“2-4周后復(fù)檢”或盡快做核酸檢測(cè)?？贵w確證試驗(yàn)檢測(cè)報(bào)告現(xiàn)在是40頁\一共有58頁\編輯于星期一WB不確定結(jié)果原因：HIV感染早期HIV感染晚期非特異性反應(yīng)污染處理：核酸檢測(cè)2-4周后隨訪重采血

現(xiàn)在是41頁\一共有58頁\編輯于星期一HIV-1核酸檢測(cè)HIV-1核酸定性檢測(cè)HIV-1核酸定量試驗(yàn)有反應(yīng)報(bào)告HIV-1核酸陽性無反應(yīng)報(bào)告HIV-1核酸陰性報(bào)告低于檢測(cè)限>5000cps/ml,報(bào)告檢測(cè)值≤5000cps/ml重新采樣檢測(cè)高于檢測(cè)限低于檢測(cè)限圖８ＨＩＶ核酸試驗(yàn)流程臨床診斷相關(guān)的檢測(cè)策略現(xiàn)在是42頁\一共有58頁\編輯于星期一核酸補(bǔ)充試驗(yàn)報(bào)告定性檢測(cè)結(jié)果有反應(yīng)，報(bào)告“HIV-1核酸陽性”；無反應(yīng)，報(bào)告“HIV核酸陰性”。定量檢測(cè)結(jié)果低于檢測(cè)限，報(bào)告低于檢測(cè)限；檢測(cè)結(jié)果大于5000CPs/ml，報(bào)告檢測(cè)值；檢測(cè)結(jié)果低于等于5000CPs/ml，盡快再次嚴(yán)格按核酸檢測(cè)的要求采樣檢測(cè)，報(bào)告檢測(cè)值。臨床醫(yī)生可結(jié)合臨床及流行病史、CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)值或者HIV-1抗體隨訪檢測(cè)結(jié)果等進(jìn)行診斷或排除診斷?，F(xiàn)在是43頁\一共有58頁\編輯于星期一HIV抗體母親HIV抗體經(jīng)胎盤進(jìn)入胎兒，出生時(shí)新生兒和嬰兒早期抗體陽性，不一定是感染出生時(shí)母親的抗體，80~90%在生后9~12個(gè)月消失，出生后18個(gè)月基本上全部消失18個(gè)月后兒童HIV抗體仍然陽性，視為自身感染產(chǎn)生的抗體18個(gè)月以下嬰幼兒的HIV診斷現(xiàn)在是44頁\一共有58頁\編輯于星期一嬰幼兒HIV感染的抗體檢測(cè)適用于：HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒；母親HIV感染狀態(tài)不詳，兒童出現(xiàn)HIV相關(guān)臨床表現(xiàn)，臨床懷疑HIV感染的兒童。嬰兒12個(gè)月時(shí)進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)

陰性排除感染，納入正常兒童保?。?/p>

陽性者繼續(xù)追蹤隨訪，至18個(gè)月再次進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)，結(jié)果陰性排除感染。現(xiàn)在是45頁\一共有58頁\編輯于星期一HIV抗體檢測(cè)的要點(diǎn)根據(jù)目的選擇檢測(cè)方法及檢測(cè)策略。嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。結(jié)果判定以試劑盒說明書為標(biāo)準(zhǔn)。篩查試驗(yàn)有反應(yīng)，須作補(bǔ)充試驗(yàn)現(xiàn)在是46頁\一共有58頁\編輯于星期一質(zhì)量控制

質(zhì)量控制是指為確保實(shí)驗(yàn)工作正常進(jìn)行而在每一次實(shí)驗(yàn)過程中必須采取的各種措施。以保證檢驗(yàn)結(jié)果達(dá)到允許的準(zhǔn)確度。現(xiàn)在是47頁\一共有58頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量控制

正確的標(biāo)本采集和處理正確及時(shí)的運(yùn)送樣品實(shí)驗(yàn)前正確地處理和保存樣品實(shí)驗(yàn)中質(zhì)量控制

儀器校準(zhǔn)選擇合格試劑，采用正確的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)程序質(zhì)控品的準(zhǔn)備開展質(zhì)控圖質(zhì)控

實(shí)驗(yàn)后質(zhì)量控制

結(jié)果記錄記錄核對(duì)結(jié)果解釋記錄保存

質(zhì)量控制現(xiàn)在是48頁\一共有58頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量控制樣品的采集：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測(cè)項(xiàng)目選用適當(dāng)?shù)姆椒ú杉瘶悠??？贵w檢測(cè)可采集血清、血漿和全血；CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)可采集K3EDTA或肝素或枸櫞酸鈉抗凝全血，并在24小時(shí)內(nèi)室溫送檢；HIV-1病毒載量測(cè)定可采集EDTA或枸櫞酸鈉(ACD)抗凝全血，最好在6小時(shí)內(nèi)離心分離血漿和血細(xì)胞。將分離的血漿分裝到2-3支，冰凍保存，在凍存管上編號(hào)。做好樣品處理記錄并注明分裝時(shí)間?，F(xiàn)在是49頁\一共有58頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量控制樣品的保存：用于HIV抗體檢測(cè)的血清和血漿樣品,應(yīng)存放于-20℃以下，短期（1周）內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的樣品可存放于2-8℃；用于CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)的樣品應(yīng)在室溫下（1823℃）保存，避免極端溫度（冷凍或過熱）,樣品采集時(shí)間超過72h則不可檢測(cè)；用于病毒載量檢測(cè)的樣品的保存條件應(yīng)根據(jù)血漿檢測(cè)時(shí)間而定，4天內(nèi)可在4℃暫時(shí)保存，3個(gè)月以內(nèi)凍存于-20℃以下，3個(gè)月以上應(yīng)置于-70℃以下保存。血漿樣品凍融次數(shù)不可超過3次。每次凍融在樣品上標(biāo)明?，F(xiàn)在是50頁\一共有58頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量控制樣品的運(yùn)輸：1、樣品送檢時(shí)需與相應(yīng)送樣單同時(shí)送檢。2、血清和血漿樣品在2-8℃條件下由專人低溫運(yùn)輸。3、CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)樣品需在在室溫下（1823℃）運(yùn)送，避免極端溫度（冷凍或過熱）。超過37℃的溫度會(huì)破壞細(xì)胞，對(duì)血液學(xué)和流式細(xì)胞儀的檢測(cè)有影響。4、病毒載量測(cè)定樣品的運(yùn)送：凍存的血漿樣品在運(yùn)輸過程中要保持樣品在冷凍狀態(tài)，防止樣品凍融。在4℃暫時(shí)保存的樣品，在2-8℃條件下低溫運(yùn)輸?？鼓獦悠吩?4小時(shí)內(nèi)2-8℃條件下低溫運(yùn)輸。現(xiàn)在是51頁\一共有58頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量控制運(yùn)輸采用WHO提出的三級(jí)包裝系統(tǒng)

第一層容器：裝樣品，要求防滲漏第二