內質網(wǎng)應激與細胞凋亡

內質網(wǎng)應激與細胞凋亡【摘要】死亡受體活化和線粒體損傷是兩條經(jīng)典的介導細胞凋亡信號傳導通路，近來研究發(fā)現(xiàn)過度內質網(wǎng)應激可啟動細胞凋亡，是一條新的細胞凋亡信號傳導通路，這一信號傳導通路包括非折疊蛋白反應和鈣離子起始信號等機制，內質網(wǎng)應激可特異性激活Caspase一12，Caspase一12裂解CaSpase一3等下游效應蛋白酶，最終導致細胞凋亡。【關鍵詞】內質網(wǎng)；細胞凋亡；Caspase—12內質網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)是真核細胞中蛋白質翻譯合成和細胞內鈣離子的儲存場所，對細胞應激反應起調節(jié)作用。內質網(wǎng)應激可由多種原因引起，如缺氧、饑餓、鈣離子平衡失調、自由基侵襲及藥物。這些刺激引起從內質網(wǎng)到胞漿和胞核的信號傳導，最終導致對存活的適應或凋亡。許多疾病的發(fā)病機制都與內質網(wǎng)應激引起的凋亡有關，如阿爾茨海默病、帕金森氏病等神經(jīng)變性性疾病，糖尿病，外傷性腦損傷，撲熱息痛引起的腎小管損傷。在肝臟疾病方面，非酒精性脂肪肝、膽汁淤積和酒精性肝病，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染等的發(fā)病機制均與內質網(wǎng)應激引起的損傷有關。1.內質網(wǎng)應激啟動細胞凋亡的機制內質網(wǎng)介導細胞凋亡至少包括兩種機制，分為非折疊蛋白反應(unfoldedproteinreaction，UPR)和鈣離子起始信號(calciumsignaling)。非折疊蛋白反應蛋白在內質網(wǎng)腔形成空間結構由許多分子伴侶蛋白協(xié)助，包括Bip/Grp78和Grp94及折疊酶類，如蛋白二硫異構酶和肽基脯氨酰逆轉錄異構酶。非折疊蛋白在內質網(wǎng)沉積，信號通過內質網(wǎng)膜傳到人細胞核和胞漿，效應蛋白上調編碼Bip/Grp78和Grp94等內質網(wǎng)伴侶蛋白基因轉錄，并廣泛減少蛋白翻譯，以利于內質網(wǎng)蛋白折疊形成，減少非折疊蛋白在內質網(wǎng)沉積和聚集，使細胞能夠耐受及生存，這一針對內質網(wǎng)應激的反應稱為非折疊蛋白反應真核細胞有三種不同的機制處理內質網(wǎng)非折疊蛋白沉積：內質網(wǎng)伴侶蛋白基因轉錄的上調；蛋白質翻譯減少;非折疊蛋白由內質網(wǎng)移入胞漿并被降解。非折疊蛋白反應是細胞對抗內質網(wǎng)應激的自身保護機制，即使在正常生長狀況下，新合成蛋白的非折疊和錯誤折疊也可發(fā)生，在真核細胞，它可發(fā)生于不同的亞細胞結構，如胞漿、線粒體和過氧化物酶體，發(fā)生于內質網(wǎng)可引起機體的病理狀態(tài)。非折疊蛋白反應導致非折疊蛋白與內質網(wǎng)伴侶蛋白Bip/Grp78結合，競爭性干擾Bip/Grp78與跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶一Irel—a的相互作用。Irels可傳導不同類型的信號：一個是細胞存活信號，另一個是死亡受體相關因子2(TRAf2)介導的死亡信號。被激活后，lrel—a可招募胞漿調節(jié)蛋白TRAV2，它依次招募、激活鄰近的c—JunN端激酶(JNK又稱應激活化蛋白激酶SAPK，能通過磷酸化使凋亡抑制蛋白Bcl—xL失活)途徑的成分，現(xiàn)已證實JNK與細胞凋亡有關。c—JunN端的抑制激酶(JIK)是Irel—a的結合伴侶，哺乳動物細胞JIK有結合lrel和TRAF2的能力。JIK通過對Irels—TRAF2復合物形成的修飾，來調節(jié)由內質網(wǎng)蛋白折疊擾亂引起的信號傳導。Irel—a同源物IreI一8具有核糖核酸酶活性，能切割28SrRNA，抑制蛋白翻譯。Irel—a/Irel—8基因雙敲除的細胞仍可發(fā)生穿過內質網(wǎng)膜的信號傳導，表明在哺乳動物細胞內質網(wǎng)伴侶蛋白轉錄的調節(jié)涉及多條信號途徑。除了對l—a和Irel一8的影響，內質網(wǎng)應激也激活另外兩個內質網(wǎng)穿膜蛋白：PERK(RNA激活蛋白激酶的內質網(wǎng)類似激酶)和ATF6(激活作用轉錄因子)。與Irel相似，PERK在非折疊蛋白反應期間也發(fā)生低聚化和反向自身磷酸化?；罨腜ERK磷酸化共同的翻譯起始因子eIF2.a，結果使所有蛋白的合成下調。內質網(wǎng)應激使ATF6裂解，ATF6是II型穿膜蛋白，在非內質網(wǎng)應激狀態(tài)下ATF6主要以酶原形式(P9o)存在于內質網(wǎng)?；罨笃浒麧{區(qū)域可移位到細胞核，起亮氨酸拉鏈轉錄因子的作用。ATF6引起內質網(wǎng)應激元件基因啟動子區(qū)域激活，這些基因包括提高蛋白在內質網(wǎng)腔折疊的蛋白，如Bip/Grp78和鈣網(wǎng)膜蛋白等伴侶蛋白及CHOP/GADD153(生長停滯及DNA損傷基因，geneforgro~harrestandDNAdamage)。CHOP由內質網(wǎng)應激誘導并在生長停止和細胞死亡中起作用，Ire1.a和Ire1.8，ATF6及PERK的活化均可對CHOP產(chǎn)生誘導，CHOP的激活是內質網(wǎng)應激反應的直接結果。CHOP/GADD153可降低Bc1.2表達，使細胞谷胱甘肽耗竭引起細胞凋亡，但CHOP下游的級聯(lián)尚未證實。哺乳動物細胞針對內質網(wǎng)應激還可激活內質網(wǎng)超負荷反應(EROverloadResponse，EOR)，當大量膜蛋白在內質網(wǎng)沉積，核因子NFkB被活化，最終產(chǎn)生對前炎性蛋白及干擾素、白介素等細胞因子的誘導。這一反應可能與細胞抗病毒感染的保護有關。許多破壞蛋白折疊的刺激，如衣霉素、鈣離子載體等對UPR和EOR都可激活，這兩條途徑的內質網(wǎng)應激反應有不同也有重疊。EOR因膜蛋白在內質網(wǎng)沉積引起，其通過NFkB的信號傳導與UPR通過Grp的信號傳導不同。鈣離子信號鈣離子可作為促有絲分裂或促凋亡信使發(fā)揮作用，取決于它的位置、胞漿濃度等，所有非肌肉細胞鈣離子的儲存、釋放和攝取都受內質網(wǎng)調節(jié)。細胞內鈣離子濃度通過鈣離子通道，鈣離子結合蛋白及與內質網(wǎng)和其它胞內區(qū)的結合等復合作用來調節(jié)。鈣離子在內質網(wǎng)游離存在或以結合于鈣網(wǎng)膜蛋白、鈣聯(lián)蛋白等腔內蛋白的形式存在。鈣離子通過肌漿/內質網(wǎng)鈣離子ATP酶(SERCA)從胞漿中攝入，通過肌醇.1,4,5.三磷酸受體(InsP3R)/鈣離子通道或ryanodinerecepter/鈣離子通道釋放。內質網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)的破壞可引起細胞凋亡，毒胡蘿b素通過抑制SERCA而引起細胞凋亡。內質網(wǎng)的UPR和鈣離子信號之間存在串擾(crosstalk)，如鈣網(wǎng)膜蛋白(calreticulin)是內質網(wǎng)腔的主要鈣離子結合伴侶蛋白，可通過控制SERCA和InsP3R的活性而調節(jié)鈣離子水平，它同時也是UPR誘導的糖蛋白結合伴侶蛋白，其過表達可導致對凋亡的敏感性增JJ1][6J。內質網(wǎng)與線粒體介導凋亡信號通路之間的串擾過度內質網(wǎng)應激也可能涉及線粒體及細胞色素c的協(xié)同作用而使Caspase激活和細胞凋亡。內質網(wǎng)?e3/Ca2通道的開放影響線粒體鈣離子的平衡，?P3/Ca2通道又是Caspase.3的作用靶標之一。對HeLa細胞的研究發(fā)現(xiàn)內質網(wǎng)腔鈣網(wǎng)膜蛋白水平在調節(jié)細胞對藥物誘導凋亡的敏感性上起重要作用，其過多表達導致細胞對毒胡蘿b素和星形孢菌素的敏感性增加，并與細胞色素C(Cyt.C)從線粒體釋放增加有關。鈣網(wǎng)膜蛋白缺乏的細胞可明顯抗凋亡，這與Cyt.C從線粒體釋放減少和Caspase.3的低水平活化有關，但不能除外鈣網(wǎng)膜蛋白作用于其特異的底物，而底物也在調節(jié)細胞凋亡敏感性上起作用。Cyt.C釋放和效應Caspase的活化可被Bc1.2家族抗凋亡成員如Bc1.2或Bc1.XI.所阻斷。用內質網(wǎng)應激誘導劑布雷菲爾德菌素A(BFA)或衣霉素處理Rat6胚胎成纖維細胞，均在效應Caspase.3活化之前或同時引起Cyt.C釋放，其Cyt.C的釋放，不僅可被野生型Bc1.2阻斷，而且針對內質網(wǎng)的突變型Bc1.2(Bc1.2/cb5)也可對其阻斷，并不需要與線粒體結合來發(fā)揮Cyt.C釋放的抑制作用，這種串擾是?Caspase依賴性的，機制有待闡明。Caspase-12與內質網(wǎng)應激介導的細胞凋亡內質網(wǎng)應激介導細胞凋亡調節(jié)的一個主要因素是Caspase.12。它在小鼠組織中廣泛存在，肌肉、肝臟和腎臟中高表達，但也有報道其在小鼠腦及肝組織中表達極低，而在肺、脾中高表達。它位于內質網(wǎng)的胞漿面，被過度內質網(wǎng)應激活化，這些應激包括內質網(wǎng)鈣離子平衡的破壞，內質網(wǎng)過多的蛋白沉積，非內質網(wǎng)應激介導的凋亡無Caspase.12活化。Caspase.12缺陷細胞，較有Caspase.12表達的細胞對內質網(wǎng)應激介導的凋亡有更強抵抗，而對非內質網(wǎng)應激介導的凋亡，二者敏感性相似。表明Caspase—12與內質網(wǎng)應激介導凋亡的機制有關，而與非內質網(wǎng)應激介導的凋亡無關。應用BFA或衣霉素可觸發(fā)Caspase—12活化，但最強的活化刺激是應用毒胡蘿卜素或鈣離子載體°Caspase-12酶原激活為Caspase一12特異地由內質網(wǎng)損傷引起，重組Caspase一12切割并激活Caspase一9酶原，活性Caspase一12需與另外內質網(wǎng)應激分子協(xié)同使Caspase一9激活，活化的Caspase一9裂解Caspase一3酶原等效應Caspase，效應Caspase切割多ADP聚合酶(PAfuP)和多種其它細胞內的底物，最終導致細胞凋亡。Caspase一12對Caspase—9的激活不依賴線粒體凋亡途徑成分Apaf-1和細胞色素C。Caspase：12和Caspase一9的突變及Caspase一9的肽抑制劑(LEHD.)均可阻斷這一凋亡反應。內質網(wǎng)應激觸發(fā)了一個包括Caspase一12,9，3而非Cyt—C依賴的特異級聯(lián)反應。Cxtspase一12的活化機制內質網(wǎng)應激可能通過需鈣蛋白酶對原Caspase—12裂解或通過Grp78/C￡Lsp￡Lse一7復合物介導的機制而使C￡Lsp￡Lse—12激活。需鈣蛋白酶(calpain)與Caspase是調節(jié)細胞病理性死亡兩個重要半胱氨酸蛋白酶家族，cMpMn是一個胞漿鈣離子激活的中性半胱氨酸內肽酶，在動物細胞廣泛分布。最具特征的是兩個廣泛分布的calpain同功酶，u—r和m—calpainom—calpain可能與Cas—pase一12酶原活化有關，Caspase—12上兩個主要的cal—pain切割位點T132/A133和K158/T159均位于原域和大亞基之間。在培養(yǎng)的神經(jīng)膠質細胞，氧和糖缺乏(OCD)類似于體內的缺血環(huán)境，可引發(fā)內質網(wǎng)應激反應，Caspase一12被裂解成許多?35kDa的片段。應用calpain抑制劑(E64或MDL28170)可抑制OGD引起的Caspase.12裂解，表明OGD引起的Caspase—12活化是由cMpmn介導。也有研究提示需鈣蛋白酶可通過滅活Caspase—9,3而作為Caspase活化過程的負性調節(jié)因素。內質網(wǎng)應激不僅誘導Caspase12的表達，也引起胞質Caspase一7移位于內質網(wǎng)表面。Caspase一7可能是Caspase一12的上游調節(jié)物。Rao等116]報道內質網(wǎng)應激導致Grp78一前Caspase—12一前Caspase—7復合物的形成，過度應激最終使這一多聚復合物分裂，釋放活性Caspase一12。Caspase一7對Caspase一12活化可能也需要其它內質網(wǎng)應激成分來調節(jié)?；罨疌aspase一7在94位Asp和341位Asp處切割Caspase一12酶原，產(chǎn)生活性Caspase一12。這兩位點與需鈣蛋白酶切割位點不同。Calpain或Caspase一7對Caspase一12原域的切割可能以某種方式破壞了膜與Caspase—12的聯(lián)系，導致Caspase—12活化。Caspase-12激活物還有IrelTR.~2復合物，在UPR過程，Irel一a招募TRAF-2，其復合物促使Caspase—12酶原聚集和活化。Caspase.12研究的意義凋亡對機體正常發(fā)育和組織平衡很重要，但凋亡過多或過少都會引起疾病。Caspase是正常細胞程序化死亡和損傷依賴性凋亡的關鍵介質，在正常細胞作為一種基本成分表達，并與其抑制劑共存，以防意外激活而引起細胞損傷。作為治療的靶標