細胞化學染色檢驗

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細胞化學染色檢驗

一、過氧化物酶染色（POX)目的:了解過氧化物酶染色的原理、方法、注意事項和臨床意義。原理(四甲基聯(lián)苯胺法）:粒細胞和部分單核細胞的溶酶體顆粒中含有過氧化物酶(peroxidase,POX)，POX能將底物四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)氫離子傳遞給H2O2，使之氧化為四甲基聯(lián)苯胺藍。四甲基聯(lián)苯胺藍又可與亞硝基鐵氰化鈉結合，再進一步氧化形成穩(wěn)定的藍色顆粒，定位于細胞質酶所在部位。若無亞硝基鐵氰化鈉，四甲基聯(lián)苯胺藍則自我脫氫氧化成棕色的四甲基苯醌二胺沉著于酶所在部位。第2頁/共11頁

取0.1％TMB乙醇溶液1ml，加亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液10μl，溶液呈淡棕黃色。染色液應在臨用前配制。在新鮮干燥的涂片上，加0.1％TMB-亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液的混合試劑0.5ml，放置1min后，再加稀過氧化氫溶液0.7ml，吹勻，染色6min。直接用流水沖洗，待干，再用瑞氏染液復染15～20min。流水沖洗后，待干，用油鏡鏡檢。結果判斷在細胞質中出現(xiàn)藍色或藍黑色顆粒為陽性反應。陰性：無顆粒。弱陽性：顆粒小，分布稀疏。陽性：顆粒略粗，分布較密集。強陽性：顆粒粗大，密布于整個胞質中。

方法步驟第3頁/共11頁

注意事項

涂片應新鮮制作、厚薄適宜。TMB配制在85％～88％的乙醇溶液中染色效果較好，勿用90％～95％乙醇，否則細胞表面蛋白質很快凝固，妨礙試劑向胞內(nèi)滲入而使顯色反應減弱或消失。過氧化氫溶液需新鮮配制，其濃度與加入量不能隨意更改。涂片中粒細胞看不見陽性顆粒，紅細胞呈棕色或綠色，即表示過氧化氫過濃。若過氧化氫加于血片上不產(chǎn)生氣泡，則示無效。染色液適宜pH值應為5.5，若pH值<5.0會出現(xiàn)假陽性結果。試劑應置于低溫暗處，防止光線照射失效。染色時加稀過氧化氫溶液之后必須與染色液充分混勻，否則同一片子上細胞染色情況不一致。第4頁/共11頁

臨床意義

POX染色是鑒別急性粒細胞白血病(acutemyeloblasticleukemia,AML)、急性單核細胞白血病(acutemonocyticleukemia,AMOL)、急性淋巴細胞白血病(acutelymphocyticleukemia,ALL)的重要細胞化學染色方法。AML時白血病細胞可呈陽性反應,陽性顆粒一般較多，較粗大，常呈局限性分布；ALL時白血病細胞呈陰性反應；AMOL時白血病細胞呈陰性或弱陽性反應，陽性時顆粒稀少、細小，呈彌散分布。第5頁/共11頁過碘酸-雪夫反應(PAS)

目的:

了解過碘酸-雪夫反應的原理、方法、注意事項和臨床意義。原理:

過碘酸-雪夫反應(PeriodicacidSchiffreaction,PAS)又稱糖原染色，其原理為過碘酸可將細胞內(nèi)含有1,2-乙二醇基的糖類氧化而產(chǎn)生雙醛基，后者與雪夫(Schiff)染料作用，使無色品紅變?yōu)樽霞t色的化合物，定位于含有多糖類的胞質中。根據(jù)胞質中糖原種類及含量多少，可呈現(xiàn)粗細不等紅色顆粒、塊狀物或均勻紅色。第6頁/共11頁

方法步驟

新鮮干燥的涂片用95％乙醇固定10min，流水沖洗，待干。加入10g/L過碘酸氧化15～20min，蒸餾水沖洗，待干。置雪夫染液中37℃(或室溫)染色30～60min。用亞硫酸溶液沖洗3次后，再用流水沖洗2～3min，待干。20g/L甲綠復染10～20min。水洗，待干，鏡檢。結果判斷：如在胞質中出現(xiàn)彌散狀、顆粒狀或塊狀紅色為陽性。胞質無色或無顆粒為糖原陰性。反應強度判斷標準如下：

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（1）中性粒細胞的分級標準：

0分胞質無色。

1分胞質內(nèi)呈淡紅色，有極少顆粒。

2分胞質呈紅色，厚而不透明，或有少量顆粒。

3分胞質呈深紅色，顆粒較緊密，但尚有空隙。

4分胞質呈深紫紅色，顆粒緊密，無空隙。（2）淋巴細胞分級標準：

0分胞質內(nèi)無色。

1分胞質內(nèi)呈彌散淡紅或有少數(shù)細顆粒(<10個)。

2分胞質內(nèi)呈彌散較深的紅色或有多數(shù)細顆粒(≥10個)。

3分胞質內(nèi)有較粗顆?；蛏贁?shù)小塊狀紅色物質。

4分胞質內(nèi)呈多數(shù)粗顆粒并有大塊紅色物質。第8頁/共11頁

（3）幼紅細胞的分級標準：

0分胞質內(nèi)無色。

1分胞質內(nèi)有少數(shù)分散細小顆?；驕\紅色彌漫物質。

2分胞質中有1～2個濃的顆?；虬|呈彌散紅色。

3分胞質中有較粗紅色顆粒直至小塊紅色物質。

4分胞質中有粗大紅色塊或有粗大致密的紫紅色顆粒。（4）巨核細胞的分級標準：

0分胞質內(nèi)無紅色顆粒，但仍呈彌散性著色，此系其它多糖類物質。

1分少量糖原包涵體，常定位于核膜附近。

2分中等量糖原包涵體，定位于核膜處或分散在胞質中，約占胞質的1/3。

3分大量糖原包涵體分散于胞質中，占胞質1/2。

4分糖原包涵體充滿整個胞質。第9頁/共11頁

所用染色缸及器具應十分清潔、干燥。雪夫(Schiff)染液應避光密封冰箱保存，一般4℃下可保存6個月，試劑應為無色，變紅則失效。10g/L過碘酸溶液質量要保證，變黃則不能用。氧化時間要準確，以20min為宜。染色時間和溫