細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室組成及無菌操作技術(shù)

細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室組成及無菌操作技術(shù)第1頁(yè)/共103頁(yè)第一節(jié)、細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室組成一、實(shí)驗(yàn)室組成二、基本設(shè)備及使用三、培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具第2頁(yè)/共103頁(yè)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿足三個(gè)最基本的需要：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備；無菌操作；控制培養(yǎng)。此外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行觀察、分析和操作等其它配套。一、實(shí)驗(yàn)室組成第3頁(yè)/共103頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)室組成1．基本實(shí)驗(yàn)室①準(zhǔn)備室/化學(xué)實(shí)驗(yàn)室②接種室/無菌操作室③培養(yǎng)室2．輔助實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室生化分析室攝影室及暗室3.移栽設(shè)施/溫室第4頁(yè)/共103頁(yè)1．基本實(shí)驗(yàn)室①準(zhǔn)備室/化學(xué)實(shí)驗(yàn)室:

功能：

就是進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的準(zhǔn)備工作。

要求：

寬敞明亮，通風(fēng)條件好，地面便于清潔并應(yīng)防滑處理?；镜脑O(shè)備：工作臺(tái)、藥品柜、冰箱等、培養(yǎng)基分裝器、蒸汽壓力滅菌鍋等。第5頁(yè)/共103頁(yè)②接種室/無菌操作室：功能：是進(jìn)行接種、繼代、細(xì)胞融合等無菌操作的場(chǎng)所。要求：封閉性好，干燥清潔明亮，防止空氣對(duì)流。外應(yīng)設(shè)緩沖室、更衣室?；镜脑O(shè)備：超凈工作臺(tái)（接種箱）、電熱滅菌器、噴霧消毒器、紫外燈、酒精燈等。第6頁(yè)/共103頁(yè)③培養(yǎng)室

功能：是對(duì)接種到培養(yǎng)瓶的離體材料進(jìn)行控制培養(yǎng)的場(chǎng)所。要求：是要能控制光照和溫度，應(yīng)保持干燥和清潔，防止微生物感染。培養(yǎng)室基本設(shè)備：培養(yǎng)架、搖床、光照培養(yǎng)箱、通風(fēng)設(shè)施、時(shí)間過程控制器、空調(diào)機(jī)、加濕器、除濕機(jī)及溫度感應(yīng)器等。第7頁(yè)/共103頁(yè)2．輔助實(shí)驗(yàn)室

根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需求而定。

細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室

生化分析室3.移栽設(shè)施/溫室馴化室、溫室：主要用于試管苗煉苗與移栽，面積大小視生產(chǎn)規(guī)模而定。要求：配置人工光源并且能夠控制室內(nèi)溫度，為試管苗的正常生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。

第8頁(yè)/共103頁(yè)實(shí)驗(yàn)室布局的基本要求是：

便于隔離、便于操作、便于滅菌、便于觀察。

第9頁(yè)/共103頁(yè)二、基本設(shè)備及使用1.無菌操作設(shè)備2.培養(yǎng)儀器設(shè)備3.細(xì)胞學(xué)觀察設(shè)備4.化學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)設(shè)備5.其它儀器設(shè)備第10頁(yè)/共103頁(yè)1.無菌操作設(shè)備

（1）無菌接種設(shè)備：超凈工作臺(tái)、接種箱

水平送風(fēng)垂直送風(fēng)第11頁(yè)/共103頁(yè)（2）滅菌設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋、過濾滅菌裝置、干熱滅菌烘箱/消毒柜、噴霧消毒器、紫外燈等。第12頁(yè)/共103頁(yè)高壓蒸汽滅菌鍋第13頁(yè)/共103頁(yè)過濾滅菌裝置

微孔濾膜濾器

玻璃漏斗式濾器不銹鋼過濾器第14頁(yè)/共103頁(yè)干熱滅菌箱/烘箱電熱滅菌器第15頁(yè)/共103頁(yè)2.培養(yǎng)儀器設(shè)備培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、搖床、生物反應(yīng)器等。第16頁(yè)/共103頁(yè)第17頁(yè)/共103頁(yè)3.細(xì)胞學(xué)觀察設(shè)備

應(yīng)備有普通顯微鏡和倒置顯微鏡。第18頁(yè)/共103頁(yè)4.化學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)設(shè)備

主要用于試劑保存與稱量、培養(yǎng)基配制與分裝和水處理等，根據(jù)實(shí)際需要予以配置。冰箱、天平、酸度計(jì)、離心機(jī)、加熱器、純水器、分裝設(shè)備等。第19頁(yè)/共103頁(yè)5.其它儀器設(shè)備

光溫控制設(shè)備、生化分析設(shè)備、細(xì)胞流失儀、細(xì)胞融合儀、顯微操作儀、攝影器材、溫室設(shè)備等。

第20頁(yè)/共103頁(yè)三、培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具

1、培養(yǎng)器皿：試管—

適合于用少量培養(yǎng)基及試驗(yàn)各種不同配方時(shí)選用。三角瓶—

適用于各種培養(yǎng)。L形管和T形管—

為專用的旋轉(zhuǎn)式液體培養(yǎng)試管。培養(yǎng)皿—

適于固體平板培養(yǎng)、胚和花藥培養(yǎng)和無菌發(fā)芽。角形培養(yǎng)瓶和圓形培養(yǎng)瓶—

適用于單細(xì)胞和原生質(zhì)體的淺層液體培養(yǎng)。果醬瓶—

常用作試管苗大量繁殖。第21頁(yè)/共103頁(yè)2、計(jì)量器皿：吸管、量筒、容量瓶、移液器（刻度移液管、微量移液器）等3、盛裝器皿：燒杯、試劑瓶等4、接種工具：鑷子、剪刀、解剖刀、接種針、酒精燈等。5、新型材料器皿：塑料培養(yǎng)瓶、封口膜等6、分注器第22頁(yè)/共103頁(yè)第二節(jié)、無菌操作技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)器皿及洗滌

二、滅菌和消毒的方法三、植物無菌操作的一般程序第23頁(yè)/共103頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)器皿及洗滌1、玻璃器皿常用的各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管等。

①浸泡：清水、5%稀鹽酸②刷洗：軟毛刷蘸洗滌劑③酸洗：鉻酸洗滌液④沖洗：自來水沖洗、蒸餾水漂洗第24頁(yè)/共103頁(yè)2、塑料器皿

主要有多孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶等。

自來水浸泡沖洗、晾干，再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡過夜，用自來水充分沖洗后用蒸餾水沖洗3次以上，晾干備用。第25頁(yè)/共103頁(yè)3、金屬器材

主要為鑷子、剪刀、解剖刀等解剖、取材、剪切組織及接種材料等的工具。新的金屬器材：先用紙擦去表面的油脂，再用洗衣粉溶液煮沸，或用1%NaHCO3煮沸15min，擦干后再用95%酒精紗布擦干，包裝或置鋁盒內(nèi)于121℃高壓蒸汽滅菌20min。已用過的金屬器材：灼燒消毒或高壓蒸汽滅菌消毒。第26頁(yè)/共103頁(yè)4、濾器玻璃濾器：與玻璃器皿清洗相同。無論是水浸泡還是酸浸泡，都可用抽濾法。不銹鋼濾器：使用后棄去石棉濾膜，金屬部分刷洗干凈，最后用蒸餾水漂洗2～3次，晾干備用。微孔濾膜濾器：使用后棄去微孔濾膜，濾器用清水充分沖洗，最后用蒸餾水漂洗，晾干備用。第27頁(yè)/共103頁(yè)

滅菌和消毒是組織培養(yǎng)重要的工作之一。滅菌(sterilization)：是指用物理或化學(xué)的方法，殺滅或清除傳播媒介上的所有微生物，使之達(dá)到無菌程度。消毒（disinfection）：是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會(huì)完全殺死，即消毒后的環(huán)境里、物品上還有活著的微生物。二、滅菌和消毒方法

第28頁(yè)/共103頁(yè)①干熱滅菌法：②濕熱滅菌法：③過濾除菌法：④紫外射線消毒法：⑤灼燒滅菌：⑥熏蒸消毒法：⑦消毒藥劑消毒法：⑧抗菌素抑菌法：化學(xué)方法物理方法

以上方法要根據(jù)不同材料、不同目的適當(dāng)?shù)倪x用。1、滅菌和消毒方法第29頁(yè)/共103頁(yè)①干熱滅菌法：利用烘箱進(jìn)行烘烤滅菌的方法，適于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。

一般器皿：150℃，40min，或120℃，2h可達(dá)滅菌效果。

細(xì)菌芽孢：160℃

，持續(xù)90～120min。

第30頁(yè)/共103頁(yè)②濕熱滅菌法：利用高壓蒸汽鍋進(jìn)行的滅菌方法。常用于培養(yǎng)基、蒸餾水的滅菌，也適用于各種玻璃器皿、棉塞、濾紙、金屬用具等。可有效縮短滅菌時(shí)間，滅菌效果好。

一般設(shè)定為：

壓力：0.1Mpa

（1.0～1.1kg/cm2

）溫度：121℃

時(shí)間：維持20～30min。

第31頁(yè)/共103頁(yè)培養(yǎng)基一般用濕熱滅菌法：

培養(yǎng)基在制備后的24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。滅菌后的培養(yǎng)基儲(chǔ)藏在4～10℃的條件下，2周內(nèi)可使用。第32頁(yè)/共103頁(yè)

培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必需的最少時(shí)間

容器體積(mL)121℃滅菌所需最少時(shí)間(min)

20-5015

100030

250-50025

75-15020

對(duì)高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種工具，可以延長(zhǎng)滅菌時(shí)間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長(zhǎng)時(shí)間。第33頁(yè)/共103頁(yè)③過濾除菌法：利用微孔濾膜過濾除菌，用于一些遇高溫高壓易分解或失效的物質(zhì)的除菌。

如：經(jīng)高溫滅菌后GA3的活性僅及不經(jīng)高溫滅菌的新鮮溶液的10%。

抗生素、植物組織提取物等要過濾滅菌，不能高溫滅菌，否則會(huì)失去作用。第34頁(yè)/共103頁(yè)

絕大多數(shù)細(xì)菌和真菌的直徑在0.5～20μm，濾膜孔徑應(yīng)在0.45μm以下，一般在0.25～0.45μm之間。第35頁(yè)/共103頁(yè)

培養(yǎng)基中含有需要過濾滅菌的物質(zhì)時(shí)，可將除這種化合物之外的全部培養(yǎng)基裝于一個(gè)三角瓶中進(jìn)行高壓滅菌，然后置于超凈工作臺(tái)上的無菌條件下使之冷卻至40℃左右。然后將這些化合物溶液過濾滅菌，再將之加入經(jīng)高壓滅菌過的培養(yǎng)基中。第36頁(yè)/共103頁(yè)④紫外射線消毒法：用紫外燈照射消毒的方法，細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。適用于實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)面、試管受精時(shí)所用的花粉等，一般照射時(shí)間15～20min。第37頁(yè)/共103頁(yè)⑤灼燒滅菌：用酒精燈灼燒以達(dá)到滅菌目的，常用于接種器械、瓶口等。電熱滅菌器，滅菌爐加溫后最高可達(dá)350℃。金屬用具放在75％的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌，在無菌操作過程中要反復(fù)進(jìn)行。第38頁(yè)/共103頁(yè)⑥熏蒸消毒法：用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。如：向甲醛中加入高錳酸鉀，促進(jìn)甲醛的快速揮發(fā)而起到滅菌；或?yàn)楸苊獠牧现卸舅劳?，培養(yǎng)間可改用乙二醇加熱熏蒸的方法。適用于接種室、培養(yǎng)間的滅菌。

第39頁(yè)/共103頁(yè)⑦消毒藥劑消毒法：化學(xué)消毒劑使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競(jìng)爭(zhēng)其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細(xì)胞漿膜的通透性，使細(xì)胞破裂或溶解，以至細(xì)菌死亡。

常用的有70～75％酒精、升汞、次氯酸鈉、次氯酸鈣、過氧化氫等。利用不同的消毒劑可以對(duì)器皿、操作臺(tái)面、皮膚、實(shí)驗(yàn)材料等進(jìn)行消毒的方法。第40頁(yè)/共103頁(yè)⑧抗菌素抑菌法：利用抗生素對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行抑菌的方法。常用的有：青霉素、鏈霉素、新霉素、利福平、卡拉霉素等。第41頁(yè)/共103頁(yè)三、植物無菌操作的一般程序

1、外植體選擇2、外植體的表面消毒3、材料的接種4、材料培養(yǎng)5、培養(yǎng)物的觀察與分析第42頁(yè)/共103頁(yè)植物基因型外值體來源外值體大小取材季節(jié)外值體的生理狀態(tài)外植體的發(fā)育年齡1、外植體的選擇

依據(jù)培養(yǎng)目的、植物的特性而定。適宜的外植體的選擇要通過實(shí)驗(yàn)確定。第43頁(yè)/共103頁(yè)2.外植體的表面消毒材料預(yù)處理（修剪）流水沖洗70-75％乙醇（5～30s）消毒劑處理（振蕩）無菌水沖洗（1-2次）準(zhǔn)備接種無菌水沖洗（3-5次）第44頁(yè)/共103頁(yè)各種外植體的消毒方法（1）莖尖、莖段及葉片等的消毒

（2）果實(shí)及種子的消毒

（3）花藥的消毒（4）根及地下部器官的消毒

根據(jù)外植體類型，選擇適當(dāng)?shù)南緞褂眠m當(dāng)?shù)臐舛?、適宜的處理時(shí)間和處理方式等。原則上要保證達(dá)到一定的滅菌目的，還要保持植物組織和細(xì)胞的活性。第45頁(yè)/共103頁(yè)接種：是將已消毒好的材料如根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，放入培養(yǎng)基的過程。接種程序：接種工具滅菌--材料切割--轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基--培養(yǎng)瓶封口3、材料的接種第46頁(yè)/共103頁(yè)超凈工作臺(tái)的準(zhǔn)備：a.上超凈工作臺(tái)前先打開送風(fēng)系統(tǒng)，70％酒精清潔內(nèi)部各面；b.放入需要的各種用具、物品及培養(yǎng)基等，以70％酒精噴灑或擦拭表面；c.打開紫外燈，20-30min后關(guān)閉紫外燈，上臺(tái)操作；d.上工作臺(tái)后，用75％酒精棉球認(rèn)真擦拭雙手；e.開始外植體的消毒；f.接種；g.接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺(tái)。

第47頁(yè)/共103頁(yè)第48頁(yè)/共103頁(yè)第49頁(yè)/共103頁(yè)4、材料培養(yǎng)初代培養(yǎng)：誘導(dǎo)外植體生長(zhǎng)、分化，獲得無菌培養(yǎng)物，常為單芽、叢芽、愈傷組織、胚狀體或原球莖。繼代/增殖培養(yǎng)：隔一定時(shí)間，把培養(yǎng)物切割成適宜大小，轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。目的：對(duì)初代培養(yǎng)獲得的無菌培養(yǎng)物進(jìn)行擴(kuò)大繁殖或?yàn)楸４鏌o菌培養(yǎng)物而進(jìn)行的培養(yǎng)。生根培養(yǎng)：誘導(dǎo)無根芽苗形成不定根，形成完整植株。第50頁(yè)/共103頁(yè)5、培養(yǎng)物的觀察、統(tǒng)計(jì)與分析

污染率、死亡率、褐變率、愈傷組織誘導(dǎo)率、分化率、生根率、成苗率外觀形態(tài)的觀察細(xì)胞學(xué)觀察生理生化分析數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析詳細(xì)記錄，根據(jù)生長(zhǎng)情況確定進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)方法。第51頁(yè)/共103頁(yè)培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長(zhǎng)。要根據(jù)植物的營(yíng)養(yǎng)原理和植物離體培養(yǎng)的不同要求而人工配置出培養(yǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。第三節(jié)、培養(yǎng)基的組成及其配制第52頁(yè)/共103頁(yè)1、培養(yǎng)基組成完全培養(yǎng)基基本成分（基本培養(yǎng)基）附加成份植物激素其它天然提取物瓊脂活性炭抗生素硝酸銀抗氧化劑大量元素H2O無機(jī)成分有機(jī)成分微量元素Fe鹽糖類維生素肌醇氨基酸第53頁(yè)/共103頁(yè)MS基本培養(yǎng)基大量元素mg/L硝酸銨NH4NO31650硫酸鎂MgSO4·7H2O370硝酸鉀KNO31900磷酸二氫鉀KH2PO4170氯化鈣CaCl2·2H2O440微量元素mg/L硫酸錳MnSO4·4H2O22.3鉬酸鈉Na2MoO4·2H2O0.25硫酸鋅ZnSO4·7H2O8.6硫酸銅CuSO4·5H2O0.025硼酸H3BO36.2氯化鈷CoCl2·6H2O0.025碘化鉀KI0.83鐵鹽mg/L硫酸亞鐵FeSO4·7H2O27.8乙二胺四乙酸二鈉Na2EDTA37.3有機(jī)化合物mg/L甘氨酸2煙酸0.5鹽酸硫胺素（VB1）0.4肌醇100鹽酸吡哆醇（VB6）0.5蔗糖30000PH5.8第54頁(yè)/共103頁(yè)（1）無機(jī)成分除C、H、O外，無機(jī)物中有12種對(duì)于植物的生長(zhǎng)是必須的，即N、P、S、Ca、K、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo。其中前6種需要的數(shù)量較大，稱之為大量元素，后6種需要的數(shù)量較小為微量元素。碘---I

雖然不是植物必需元素，但幾乎所有的培養(yǎng)基中都添加I，有些培養(yǎng)基中還加入鈷“Co”鎳“Ni”等元素，這些元素加入培養(yǎng)基利于植物組織細(xì)胞的在離體條件下生長(zhǎng)和發(fā)育。第55頁(yè)/共103頁(yè)①大量元素--N、P、K、S、Ca、Mg

它們是以鹽的形式添加到培養(yǎng)基中的，如KNO3、

KH2PO4、

MgSO4·7H2O、CaCl2等。作為無機(jī)N源，添加到培養(yǎng)基中的有硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+）兩種形式，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮配合使用，若單獨(dú)應(yīng)用硝態(tài)氮遠(yuǎn)優(yōu)于銨態(tài)氮，因硝態(tài)氮的培養(yǎng)基易造成堿漂移，加入少量銨鹽會(huì)抑制這種漂移。硝酸鹽：KNO3、NH4NO3、NaNO3、Ca（NO3）2銨鹽：NH4NO3、NH4H2PO4、（NH4）2SO4無機(jī)成分第56頁(yè)/共103頁(yè)②微量元素：

Fe、Mn、Zn、B、Cu、Mo等多種微量元素，以鹽的形式供給。如：MnSO4·4H2O、Na2MoO4·2H2O、CoCl2·6H2O、KI等。③

Fe鹽：

Fe鹽是用量較多的一種微量元素，對(duì)植物組織葉綠體的合成和延長(zhǎng)生長(zhǎng)起重要的作用。因此，單列出來。培養(yǎng)基中的鐵離子，多以螯合鐵的形式存在，即EDTA-Na2與FeSO4·4H2O混合。無機(jī)成分第57頁(yè)/共103頁(yè)主要有兩類：一類是：作為有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為植物細(xì)胞提供碳、氫、氧、氮等必要元素，如糖類、氨基酸及其酰胺類（如甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺）；另一類是：一些生理活性物質(zhì)，在植物代謝中起一定作用，如硫胺素（B1）、吡哆醇（B6）、煙酸、生物素、肌醇、單核甘酸及其堿基（如腺嘌呤等）。（2）有機(jī)化合物第58頁(yè)/共103頁(yè)糖類：

一方面是作為碳源；另一方面，還可以維持培養(yǎng)基中一定的滲透勢(shì)。植物組織培養(yǎng)中常使用蔗糖，，其次為葡萄糖和果糖。蔗糖經(jīng)高溫后部分被降解成葡萄糖和果糖。一般糖的濃度：為2%～5%。第59頁(yè)/共103頁(yè)氨基酸

氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是一種有機(jī)N源。常用的有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及多種氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。一般使用濃度：1-1000mg/L。第60頁(yè)/共103頁(yè)維生素

維生素類直接參加生物催化劑，即酶的形成，以及蛋白質(zhì)、脂肪的代謝等重要的生命活動(dòng)。培養(yǎng)基中的維生素主要是B族維生素，如鹽酸硫胺素（維生素B1）、鹽酸吡哆醇（維生素B6）、煙酸（維生素B3，又稱維生素PP）、泛酸（維生素B5）、生物素（維生素H）、鈷胺素（維生素Bl2）、葉酸（維生素B11）、抗壞血酸（維生素C）等。一般使用濃度：0.1～10mg/L第61頁(yè)/共103頁(yè)肌醇化學(xué)名稱環(huán)己六醇。肌醇本身并沒有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，肌醇參與磷脂合成、細(xì)胞壁果膠的合成，并維持膜系統(tǒng)的活動(dòng)，它在糖類的相互轉(zhuǎn)化、維生素、激素的利用相應(yīng)具有重要的促進(jìn)作用。一般用量：為50－100mg/L。第62頁(yè)/共103頁(yè)

激素在植物體內(nèi)含量微小，但在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和分化中起重要作用。激素在植物體內(nèi)存在活化和鈍化二種形式，二者間的平衡在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和分化中起重要作用。在離體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中附加的外源植物激素類物質(zhì)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)、器官分化及植株再生具有重要的作用，是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)。（3）植物激素(planthormones)第63頁(yè)/共103頁(yè)植物激素或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（growthregulators）包括：生長(zhǎng)素類（auxin）細(xì)胞分裂素類(cytokinin,CTK)

赤霉素類(GA)

乙烯（Eth)脫落酸(ABA)

其中前三者為正向激素，后兩者則為負(fù)向激素。常用的主要有生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類兩大類。第64頁(yè)/共103頁(yè)①生長(zhǎng)素類（auxin）：在作用或結(jié)構(gòu)上類似于吲哚乙酸的一類物質(zhì)的統(tǒng)稱。生長(zhǎng)素是最早發(fā)現(xiàn)的植物激素。

作用：誘導(dǎo)愈傷組織形成，促進(jìn)細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)，誘導(dǎo)根原基的發(fā)生和根系的生成，有調(diào)運(yùn)養(yǎng)分的效應(yīng)。使用濃度0.1～10mg/L。常用的生長(zhǎng)素有:吲哚乙酸(IAA)、奈乙酸(NAA)、

2，4，二氯苯氧乙酸(2,4-D)吲哚丁酸(IBA)

。第65頁(yè)/共103頁(yè)②細(xì)胞分裂素類(cytokinin,CTK)

：是一類促進(jìn)細(xì)胞分裂的植物激素，細(xì)胞分裂素都為腺嘌呤的衍生物。

作用：促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，誘導(dǎo)不定芽的形成，促進(jìn)胚狀體的發(fā)育，延緩組織的衰老，打破頂端優(yōu)勢(shì)，有利于芽的增殖，常用于繼代和增殖培養(yǎng)。使用濃度0.1～10mg/L。常用的細(xì)胞分裂素有：激動(dòng)素(KT)6-芐基腺嘌呤(6-BA/BAP)玉米素（ZT）異戊烯氨基嘌呤(2-ip)噻重氮苯基脲（TDZ）第66頁(yè)/共103頁(yè)（4）其它附加成份①瓊脂：0.5～1％。②天然提取物--椰子汁（CM）、馬鈴薯汁、水解酪蛋白（CH）、香蕉汁、玉米胚乳、水解乳蛋白（LH）、酵母提取物(YE)、西紅柿汁、蘋果汁等。③活性炭：0.5～3%，吸附培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)④抗生素：控制微生物的系統(tǒng)侵染。⑤硝酸銀：抑制乙烯活性。第67頁(yè)/共103頁(yè)（5）培養(yǎng)基pH值

一般培養(yǎng)基pH值在高壓滅菌前調(diào)節(jié)在5.0～6.0之間。

pH在4.0以下或7.0以上培養(yǎng)物就不能正常生長(zhǎng)。

pH值也影響瓊脂凝固。第68頁(yè)/共103頁(yè)2、培養(yǎng)基種類及其特點(diǎn)

按照培養(yǎng)基用途分類基本培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼代增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基壯苗培養(yǎng)基、生長(zhǎng)培養(yǎng)基生產(chǎn)培養(yǎng)基第69頁(yè)/共103頁(yè)據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程分為

初代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基物理狀態(tài)分類固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基固液雙層培養(yǎng)基第70頁(yè)/共103頁(yè)按照培養(yǎng)基的成分：高無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基：MS,LS,BL,BM,ERKNO3含量較高的培養(yǎng)基：B5,N6,SH中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基：Miller,Nitsch,H低無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基：White,WS,HB，HE第71頁(yè)/共103頁(yè)MS培養(yǎng)基1962年由Ｍurashige和Ｓkoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)：無機(jī)鹽（如鉀鹽，銨鹽，硝酸鹽）含量均較高，微量元素種類較全，濃度也高。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，離子平衡性較好，具較強(qiáng)的緩沖能力，培養(yǎng)過程中較穩(wěn)定，可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要。其中它的硝酸鹽含量較其它培養(yǎng)基為高。廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。幾種常用基本培養(yǎng)基的特點(diǎn)第72頁(yè)/共103頁(yè)Ｎ6

培養(yǎng)基1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)：ＫＮＯ3和（ＮＨ4）2ＳＯ4

含量高，VB1含量高，不含鉬。目前在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其它植物的花粉和花藥培養(yǎng)和組織培養(yǎng)。第73頁(yè)/共103頁(yè)Ｂ5培養(yǎng)基1968年由ＧamBorg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)：ＫＮＯ3含量高，有機(jī)物含量較高，但含有較低的銨，這可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。從實(shí)踐得知有些植物在Ｂ5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。第74頁(yè)/共103頁(yè)H培養(yǎng)基1967年由Bourgin和Nitsch為煙草花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)：大量元素約為1/2MS，微量元素減少但含量增加，維生素種類較多。用于多種植物的花藥、胚培養(yǎng)。第75頁(yè)/共103頁(yè)Ｗhite

培養(yǎng)基1943年由Ｗhite為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。1963年又作了改良，稱作Ｗhite改良培養(yǎng)基，提高了ＭgＳＯ4

的濃度和增加了硼素。

特點(diǎn)：是無機(jī)鹽濃度較低，有機(jī)成分含量也相對(duì)較低。適于生根培養(yǎng)。第76頁(yè)/共103頁(yè)ＫＭ-８Ｐ培養(yǎng)基

Kao等1975年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。

特點(diǎn)：有機(jī)成分較復(fù)雜。它包括了所有的單糖和維生素。廣泛用于原生質(zhì)體和融合體的培養(yǎng)。第77頁(yè)/共103頁(yè)3、培養(yǎng)基的配制方法

（1）母液貯備液配制（2）培養(yǎng)基的制備第78頁(yè)/共103頁(yè)（1）母液貯備液配制

在組織培養(yǎng)工作中，配制培養(yǎng)基是日常工作，為了簡(jiǎn)便起見，將培養(yǎng)基配方中的藥品配成一定倍數(shù)的濃縮液，用時(shí)稀釋，這種濃縮液就是母液貯備液。母液儲(chǔ)備液可一次稱量供一段時(shí)間使用，簡(jiǎn)單方便，不僅可以提高培養(yǎng)基中微量成份稱量的準(zhǔn)確性，還可以減少工作量，提高效率。第79頁(yè)/共103頁(yè)（1）母液貯備液的配制要求①大量元素母液配制：10x，20x，50x

②微量元素母液配制：1000x③鐵鹽母液配制：100x或200x,分別溶解EDTA-Na2

與FeSO4·4H2O，再充分混勻，貯存在棕色瓶中④有機(jī)母液配制：可以分別配制100～200X，也可以混在一起配制第80頁(yè)/共103頁(yè)⑤肌醇一般單獨(dú)配置成100x。⑥生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配制：分別單獨(dú)配制成母液，儲(chǔ)存于冰箱。一般濃度為0.1～1

mg／ml。并注意不同激素需加入不同助溶劑。

保存：母液均在4℃下保存，如果發(fā)現(xiàn)被污染或有絮狀沉淀不能再用。第81頁(yè)/共103頁(yè)常用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的配制名稱溶劑消毒滅菌方法貯藏條件2，4－D（2，4－二氯苯氧乙酸）50％酒精加熱助溶，或1NNaOH助溶高壓滅菌常溫IAA（3－吲哚乙酸）少量的1NNaOH或95％酒精溶解后加水定容至一定濃度過濾棕色瓶中4℃貯藏NAA（α－萘乙酸）1NNaOH或95％酒精溶解后加水定容至一定濃度高壓滅菌常溫IBA（吲哚－3－丁酸）1NNaOH或50％酒精溶解并定容高壓滅菌4℃6－BA（6-芐基腺嘌呤）1NHCl或NaOH溶解后加水定容高壓滅菌4℃KT（6－糠基腺嘌呤/激動(dòng)素）能溶于酸或堿性溶液中，1NHCl中高壓滅菌4℃ZT（玉米素）1NNaOH或95％酒精過濾4℃GA/GA3（赤霉素/赤霉酸）50％酒精，易溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯或PH6.2的磷酸緩沖液高壓滅菌4℃第82頁(yè)/共103頁(yè)注意問題：配制母液時(shí)，各種成份應(yīng)單獨(dú)分開稱量并溶解，再混合。配大量元素母液時(shí)Ca離子鹽應(yīng)避免與SO4和PO4根離子鹽同時(shí)加入。配制鐵鹽母液時(shí)，硫酸亞鐵不應(yīng)加熱助溶。置棕色瓶中貯存。注意不同的植物激素選用不同的溶劑助溶后，再用蒸餾水定容。第83頁(yè)/共103頁(yè)（2）培養(yǎng)基配制的一般程序①大量、微量、有機(jī)、鐵鹽母液的量?。簩?shí)際吸取母液的量(mL)＝

配制培養(yǎng)基的體積（mL）/母液中該成分的擴(kuò)大倍數(shù)②蔗糖的稱量：

一般培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30g/L，既3％。實(shí)際稱取量（g）＝配制培養(yǎng)基的體積（L）×濃度30g/L第84頁(yè)/共103頁(yè)③瓊脂的稱量及加熱：一般5g/L，加蒸餾水700～800ml加熱至溶化。實(shí)際稱取量（g）＝配制培養(yǎng)基的體積（L）×濃度5g/L第85頁(yè)/共103頁(yè)④激素類物質(zhì)母液的量取：實(shí)際吸取量(mL)＝培養(yǎng)基中的濃度（mg/L）該激素母液的濃度（mg/ml）×配制培養(yǎng)基的體積（L）⑤混合、定容及調(diào)節(jié)pH值：pH5.6～5.8

1N的鹽酸或NaOH調(diào)節(jié)pH值第86頁(yè)/共103頁(yè)⑥分裝、扎口與滅菌:

要求封口松緊適宜，系活扣，便于接種操作。

培養(yǎng)基應(yīng)及時(shí)滅菌，防止變質(zhì)。第87頁(yè)/共103頁(yè)

為了盡量減少人為的誤差，必須嚴(yán)格按上列各個(gè)步驟進(jìn)行操作。應(yīng)當(dāng)把培養(yǎng)基中的名種成分都寫在紙上，加過去一個(gè)以后即劃掉一個(gè)。所有裝著培養(yǎng)基的試管、玻璃罐、玻璃瓶和培養(yǎng)血等都應(yīng)當(dāng)清楚地做上標(biāo)記，這樣即使經(jīng)過高壓滅菌和長(zhǎng)期貯藏之后也不難識(shí)別它們。第88頁(yè)/共103頁(yè)4、培養(yǎng)基的選擇基本培養(yǎng)基的篩選：在建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛采用的基本培養(yǎng)基開始。激素的篩選：在離體培養(yǎng)中，激素的應(yīng)用要根據(jù)植物種類、培養(yǎng)階段等選擇適宜的激素種類、激素濃度及配比。其它成分的篩選：除激素外，培養(yǎng)基中其它成分對(duì)培養(yǎng)效果也有影響。離體培養(yǎng)的效果，是一個(gè)多因素綜合作用的結(jié)果，必須根據(jù)具體情況合理配比。第89頁(yè)/共103頁(yè)5、培養(yǎng)條件（1）光照（2）溫度（3）濕度（4）pH值（5）滲透壓（6）通氣條件第90頁(yè)/共103頁(yè)（1）光照

多數(shù)培養(yǎng)類型需要光照，一般只需提供弱光或散射光，光照過強(qiáng)抑制培養(yǎng)物的增殖。光照主要是對(duì)植物的形態(tài)建成起作用。一般離體根培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)、形成不需要光照，而芽的分化、生長(zhǎng)需要光照。第91頁(yè)/共103頁(yè)①光照強(qiáng)度：一般1000-4000Lux，多2000lux左右，以熒光白質(zhì)燈管為多。生根培養(yǎng)階段，光照強(qiáng)度適當(dāng)增強(qiáng)。②光質(zhì)：以熒光白質(zhì)燈管為光源，光譜成分主要是藍(lán)紫光，波長(zhǎng)419～467nm。③光照時(shí)間：對(duì)植物的生長(zhǎng)和形態(tài)形成、變化有明顯影響,大多數(shù)情況下為12～16小時(shí)。第92頁(yè)/共103頁(yè)（2）溫度

溫度通常在18～28℃，常保持在25℃，夜溫低1～2℃。低于15℃或高于35℃都會(huì)對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。不同的植物生長(zhǎng)需要的最適溫度不同，馬鈴薯20℃，柑橘27℃，棉花30℃。特殊情況下，還需要一些