結核抗酸性染色

結核抗酸性染色第1頁/共21頁抗酸染色第2頁/共21頁一、實驗目的：掌握抗酸染色的原理和方法抗酸染色第3頁/共21頁分枝桿菌的細胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復紅牢固結合成復合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當再加堿性美蘭復染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細菌及背景中的物質(zhì)為蘭色。二、實驗原理：第4頁/共21頁三、實驗材料：細菌：結核桿菌染液：石炭酸復紅液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭溶液其它：接種環(huán)、酒精燈、載玻片等第5頁/共21頁四、實驗方法：1、細菌涂片標本的制備涂片

干燥

固定2、染色3、油鏡觀察1）初染：用玻片夾夾持涂片標本，滴加石炭酸復紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，若染液蒸發(fā)減少，應再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標本冷卻后用水沖洗。2）脫色：3%鹽酸酒精脫色30’’~1’；用水沖洗。3）復染：用堿性美蘭溶液復染1’，用水沖洗后用吸水紙吸干。第6頁/共21頁五、實驗結果：結核桿菌呈紅色，常堆積成團，排列無序，偶呈分枝狀生長。背景及非抗酸性細菌呈蘭色。第7頁/共21頁第8頁/共21頁六、注意事項：1、無菌操作2、涂片厚度要適中3、固定4、沖洗5、染色時間6、初染加熱的溫度，勿沸騰第9頁/共21頁結核桿菌的培養(yǎng)特點培養(yǎng)基：羅-琴氏（LowenateinJensen）培養(yǎng)基

主要成分：蛋黃；甘油；天門冬素；馬鈴薯淀粉；無機鹽；孔雀綠；蛋黃含脂質(zhì)生長因子，能刺激生長，孔雀綠可抑制雜菌生長。第10頁/共21頁生長特點：緩慢；2-4周可見菌落；呈乳白色或米黃色，不透明，粗糙型顆粒狀，結節(jié)狀，菜花狀菌落。

液體培養(yǎng)基中呈膜樣生長。第11頁/共21頁溶菌酶的溶菌作用第12頁/共21頁目的要求了解溶菌酶的溶菌現(xiàn)象了解溶菌酶的殺菌機制第13頁/共21頁原理溶菌酶是正常體液和分泌液中所含的一種低分子量堿性蛋白，能水解G+菌細胞壁中的肽聚糖成分，致使細菌崩解。G-菌細胞壁肽聚糖層外面還有一層外膜，故一般情況下不受溶菌酶的影響。溶菌酶是非特異性免疫中一種重要的體液殺菌成分。第14頁/共21頁材料混有溶壁微球菌的1％瓊脂平板人的唾液（含有溶菌酶）、PBS、溶菌酶標準品打孔器、針頭、吸管、量尺第15頁/共21頁方法菌液的準備：溶壁微球菌在使用前于普通瓊脂斜面?zhèn)鞔淮?，然后接種于普通瓊脂斜面37℃培養(yǎng)24h。加pH6.4的1/15mol/L磷酸緩沖液，將菌苔洗下，用比濁法使每ml菌液含相當于2000億菌體濃度，再以70℃水浴加熱1h殺菌。稱取1g優(yōu)質(zhì)瓊脂加入pH6.4的1/15mol/L磷酸緩沖液100ml，加熱溶解。第16頁/共21頁方法取1ml菌液加到50-60℃已溶化的瓊脂內(nèi)，搖勻，取15ml培養(yǎng)基傾注平板待凝。打孔打孔打5孔，邊緣不能裂開，依次標記“1”-“5”于皿底；封底加樣

1-5號孔分別加溶菌酶標準品、PBS、唾液1、唾液2、唾液3（以加滿孔但又不溢出為宜）置于24-26℃，12-18h后測量加樣孔周圍溶菌環(huán)直徑。第17頁