CHO細胞表達系統(tǒng)常見問題及解析

1、問：請問有人養(yǎng)過CHO細胞嗎？文獻報道說用DMEM培養(yǎng)基來養(yǎng)，但我不太清楚具體是高糖還是低糖？參考見解：CHO細胞用高糖DMEM養(yǎng)就可以了，比較好養(yǎng)，10%血清，小牛和胎牛都可以，長得比較慢，跟你所用的血清有一定的關系，大概需要兩天傳一次代。在塑料板上比玻璃板上好養(yǎng)，感覺如果在玻璃板上養(yǎng)而且不包被的話，好像細胞不易伸展開來。2、問：要轉染鉀通道pcDNA3.1入細胞，是選cho細胞呢還是hek293細胞？cho細胞轉染效率高嗎？參考見解：表達一個蛋白的時候，首先要確認你的蛋白確實表達了，因為有很多原因可以導致蛋白表達出問題（質粒序列有錯誤，質粒純度低，表達的蛋白不穩(wěn)定，轉染效率太低等）。所以在做任何功能性實驗之前，必須要先確認蛋白的表達，通常的實驗有：（1）采用免疫熒光法。由于需要熒光二抗，比較貴。但直觀，可以確定轉染效率，采用好的顯微鏡時，可以大致知道表達蛋白在細胞中的位置。（2）WESTERN-BLOT?？梢源_認表達的蛋白分子量，以及表達的量。但不直觀。（3）構建一個N或C端帶熒光蛋白的質粒。這樣比較費時間，同時攜帶的熒光蛋（通常使用GFP）有可能干擾蛋白的正常功能。但好處是轉染后可以很方便的觀察轉染效率，蛋白在細胞中的位置等。當然以上方法都無法知道質粒有無發(fā)生突變，所以如果你的蛋白有表達但沒有功能，首先要做一個DNA測序確認你的序列沒有問題。事實上質粒發(fā)生突變的機會比大多數人想象的要多得多！3、問：由于我要用CHO細胞生產基因工程抗體，用什么培養(yǎng)基能夠很好的使之良好的生長參考見解：培養(yǎng)CHO細胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素與無機離子，因此可以在血清很少的情況下應用，是無血清培養(yǎng)中常用的基礎培養(yǎng)基，特別適合進行單細胞培養(yǎng)和克隆化培養(yǎng)。我們的前輩曾用F12在無血清的條件下成功的克隆出CHO細胞。無血清培養(yǎng)CHO細胞有兩種方法：一種是直接向試劑公司購買只適用于培養(yǎng)CHO細胞的無血清培養(yǎng)基（好像HyClone就有）；第二種方法實際上是有血清培養(yǎng)，只不過血清濃度很低罷了，可以近似的認為無血清。在第二種方法里，又可以分出兩條途徑：你可以分步進行，也可以一步到位。分步法是，CHO細胞先在含10％血清的常規(guī)培養(yǎng)基里培養(yǎng)，再到含5％血清的培養(yǎng)基里培養(yǎng)，再到含2.5％血清的培養(yǎng)基里培養(yǎng)，依此類推，培養(yǎng)基里的血清不斷下降，直到一個能讓CHO細胞良好生長的最低血清濃度。一步到位法就是省去中間的步驟，直接由起點的血清濃度到終點濃度。4、問：我要做穩(wěn)定轉染，表達融合蛋白并將蛋白質純化來檢測其功能。僅僅把目的基因插入pcDNA3.1，沒有插入其他的基因或者tag。現準備轉染CHO細胞。就相關問題想問問：有的文獻上沒有署名K1或是DHFR,普通所寫的CHO細胞是指那種？野生型CHO細胞又是指的哪種？這三種細胞是不是因為CHO-K1和CHO/DHFR-有擴增基因GS和DHFR,可以更為有效的擴增進而表達，比野生型CHO在轉染中更起作用？如果就我的實驗要求，CHO-K1或者CHO/DHFR-更加適合，那么轉染CHO-K1是不是可以直接轉染？而轉染CHO-DHFR-需要和攜帶DHFR-的標記質粒共轉染？參考見解：做穩(wěn)定表達是需要把目的基因克隆到一定的載體上的，這個載體同時可以過表達一個抗性基因，如果載體整和到基因組上，這個抗性已經能夠克服篩選壓力，而這個時候你的目的蛋白也得到了有效的表達。（1）野生型CHO就是ＣＨＯ－Ｋ１（2）CHO－DHFR-是指ＤＨＦＲ缺陷型細胞，ＤＨＦＲ作為篩選標記．（3）你用pcＤＮＡ3.1的話,可以直接轉染CHO-K1,加G418篩選即可.射消毒或者就是紫外消毒也行，我們實驗室就這樣重復用培養(yǎng)板，沒有什么問題。當然，太舊的還是扔了好了。（2）培養(yǎng)液PH不好也會影響貼壁，配的時候加好緩沖試劑，不嫌麻煩的話調定PH在7.2左右。使用時間較長的培養(yǎng)液由于在空氣中暴露時間長，ph會有變化（3）消化時候處理不合適，比如胰酶消化過久，有EDTA的話，去除不干凈也影響貼壁的。消化完了之后要吸干凈消化液，用培養(yǎng)液漂洗細胞，或者吹下來之后離心，換加新鮮培養(yǎng)液（4）血清也可能影響貼壁，我觀察過，細胞在胎牛血清中貼壁明顯快于新生牛血清，尤其是Hyclone的血清，不過很貴試試吧，有耐心點，等等它總會鋪展開的9、問：最近我養(yǎng)CHO細胞，是從別人那里得來得。給我得時候細胞有一半是圓形一半是梭行的。但是養(yǎng)著養(yǎng)著就大部分成圓形，而且有的像荷包蛋一樣，而那些還是梭形的細胞里面出現了空泡一樣的東西，還有漸漸像融化了一樣。是什么原因，我一直很頭疼，不知道該怎么辦，下面的實驗無法進行，苦惱??！參考見解：聽您的描述估計很可能是支原體污染。建議馬上丟棄該細胞，因為支原體污染很難去除，為避免影響您實驗室其他的細胞操作一定不要猶豫。您可以重新索取或購買狀態(tài)好的CHO細胞。10、問：由于接種密度稍低一些，CHO細胞在2L轉瓶中培養(yǎng)5天左右很難消化下來，即使消化下來也是成團的，請問為什么？加完血清的培養(yǎng)基又重新過濾了，會不會對細胞的生長速度有影響，一般培養(yǎng)三天就能張滿，謝謝參考見解：（1）首先