活體光學技術手冊

PartI.技術概念說 2D與3D成像比 DLIT與FLIT信號源重 PartII.軟件技術說 自動................................................................................................. 圖像- 3D-影像......................................................................................... PartIII.實驗操作說 熒光素與成 體內外生物發(fā)光試驗熒光素試劑的............................................. RC2+異氟烷麻醉機使 PartIV.光學成像應用匯 腫 ...................................................................................................220 PartI.–起來，并且被用于后面微小漂移的矯正（2count/pixel），這種微小的漂移通常發(fā)生在檢確有暗電荷數值（大的binning值和長時間）。如果不需要暗電荷圖像，軟件將會使用讀出偏離進行去除。暗電荷會隨著時間增加，并且在較高的binning值的情況下會更加明顯。通常用來判斷暗B2<表示時間(s)，B表示binning因我們假設在進行體內成像時，所有被檢測的生物發(fā)光信號都是樣品在過程中發(fā)射出來的。而如果存是磷光源。為維持一個干凈的成像室，請將成像動物放置在黑紙上（如Artagain黑紙，Strathmorecatno.重要提示：請僅使用Perkinelmer認證的清潔劑。許多清潔劑中會含有磷光物！需要已測試認證的清潔物列表，請聯系Perkinelmer技術支持團隊。. 而有時我們沒有辦法去除樣品的自身發(fā)射光。這種自身發(fā)射光一直伴隨著動物（自發(fā)生物發(fā)光），在高靈敏度檢測弱信號的時候會存在問題。Perkinelmer已經針對小鼠的自發(fā)背景光進行了一系列測試處這種自發(fā)生物發(fā)光源目前還沒被完全解釋清楚。還沒有外源物質被證明會激發(fā)自身發(fā)射光，而在圖2中顯示，對照組的白毛小鼠和鼠的圖像有明顯可見的背景發(fā)射光。這些時間為五分鐘，高靈敏度（高Binning值）條件。白毛小鼠和鼠的發(fā)射光平均大約分別為1600photons/s/cm2/sr和1000photons/s/cm2/sr。由于這些數值已經遠超過了IVIS成像系統(tǒng)的最低檢測極圖2 圖像可以通過各種方式被顯示出來，包括偽彩圖像（通過LivingImagesoftware來實現），等高線圖或等（圖1）。最后的圖像結果相當于一張黑白。IVIS成像系統(tǒng)獲得白光成像圖像就是一張灰色的偽彩圖像。1. 和數字一起顯1. 和數字一起顯 描 CCD檢測的自帶數值。圖像獲取的檢測器 CCD檢測器上入射光子數計量的一種設定要進行恰當的調節(jié)。調整合適的圖像 Radiance -Radiant -度 效率（表面熒光）光值（樣品發(fā)射光/照射光強度）NTF字輸出顯示。其測定計數值（也被稱作模擬數字轉換器單元（ADU）或相對生物發(fā)光單元））與每個2ROI（計數模式---圖3量（光子數/秒。當細胞存在于組織度（photons/second/cm2/sdian當圖像數據以發(fā)射光值的形式顯示時，單位會切換至光子數/平方厘米/球面度針對不同范圍從500-700nmCCD響圖圖4不同FOV=樣品發(fā)光量/光照強度10-210-9。當ROI測定完成后，ROI內的總效率是整個ROI區(qū)域內每個像素的效率值總和，所以最后緣的光。LivingImage軟件提供了一種矯正算法，用于補償透鏡收集效率的不同。這種方式使得整1Bialkaliphotocathode(▲)Back-illuminatedCCD(◆)Front-illuminatedCCDIVISCCDsLensApertureFOV=25cm）。您可以使用控制板（ControlPanel）FOV推薦光源為f/2或f/4。2圖像的時間同樣會影響靈敏度。收集到的光子數量直接和成像的時間相關。例如，兩分鐘時間獲得的圖像的光子數是同樣情況下一分鐘時間的兩倍。遇到非常弱的樣品的時候，更長的時間將會更有效。盡管如此，有時候也受限于各種背景噪聲，如特定的暗電荷會隨著時間的增加而增強。關于背景噪聲的的信息請參見ConceptTechNote1-生物發(fā)光背景源及校正。視野范圍（例如，一張圖像的拍照條件為binning=4，FOV=20cmbinning=8，Binning電荷耦合器是由二維的像素陣列組成的光敏感型檢測器。每張獲取之后，每個像素都包含有電荷，而電荷量與像素過程中捕獲的光信號量成正比。軟件會測定每個CCD像素單元中的計數值，詳見IVIS1024×10242048×2048CCD，因此具有高水平的空間分辨率。binning=1時，每個像素都被讀出，而且像素的大?。ㄏ袼氐臄盗浚〤CD像素的物理數量是相同的，如（3）。3CCDbinning24binning4，16Binning=Binning=Binning=當binning=2時，CCD上的四個像素會以2×2進行合并組合，在讀出之前被相加，該種組合的總數量會被則可以使用LivingImage軟件中Tools-Preference-CameraSettings框內的ManualBinning。1Binning是來自Windows7/LivingImage4.22周圍鄰近像素（包括本身像素在內）的平均強度。如圖4顯示，3x3像素鄰近區(qū)域。圖圖 3x3像素鄰近區(qū)圖圖 IVISImagingSystem200圖圖 IVISImagingSystemLumina,Lumina100Series,andLumina50400-850nm波長范圍內具有很高的激發(fā)性能。分光反射鏡為避免光纖組件的過熱，Image軟件可以控制光照強度水平（關、低或高）。光照強度為低設置時，大概是高設置的18%左右。IVIS系統(tǒng)背部的激發(fā)濾光片轉輪（5）。光經過光纖導入一個準直透鏡，透鏡后是25mm直徑的激發(fā)光濾片。IVIS12個位置的激發(fā)濾光片轉輪，可以在上面選擇多達11個的熒光濾光片（原來更老的系統(tǒng)只有五個濾光片）。其中一個濾光片的間隙上裝有一個光擋板，用于在進行生物發(fā)光成像過程中，阻擋外界光進入成像室。LivingImage軟件可以控制激發(fā)濾光片的轉輪。5情況進行處理。當效率模式被選擇的時候，被檢測的熒光圖像會以參考照明圖像進行均一化。關于效率的信息，詳見ConceptTechNote2-圖像數據顯示和測定。制。從下方的透射樣品成像模式具有精確的x-y，以用于對深樣品更高靈敏度的檢測及精確的切換（IVISAcquisitionControlPanel或ImagingWizard）有的IVIS成像系統(tǒng)都需要每個濾光片輪上有一個空的位置，以用于生物發(fā)光成像?？赡軙校ㄒ恍╇s光沒有被濾光片，而被相機檢測到）。濾光片的構成材質可能會影響濾光片 圖圖 光譜距離為帶寬，帶寬值通常為25-50nm。的。特別是在更短的波長（400-500nm）范圍內，斜坡會更陡，這就需要使用帶寬25nm的窄帶濾光10位窄帶激發(fā)濾光片：415nm760nm（30nm帶寬18490-850nm（20nm帶寬IVIS成像系統(tǒng)具有熒光功能，標配8位激發(fā)濾光片和4位發(fā)射濾光片（Table1.1）。同時也有定制的濾光片可選。IVIS成像系統(tǒng)的熒光成像波長范圍為400-950nm，針對相當寬范圍的熒光和熒光蛋白的應對于體內的應用，有一點很重要，波長范圍最好在600nm以上。對于波長范圍低于600nm的光，很容易在進行熒光成像時，激發(fā)光必須到達動物體內的熒光基團，才能開始整個熒光激發(fā)過程。一旦熒光圖圖 在600-900nm范圍內，光對組織的性最高，產生的自發(fā)熒光較低。因此，選擇在600-900nm范圍內的活性熒光基團，是非常重要的。一些熒光基團，例如GFP的活性范圍在450-600nm之內，也可用，但熒光信號通常要比生物發(fā)光信號強，所以時間要更短，一般在1-30秒之間。亮的信號可用較小的于熒光成像。更高的光圈值會改善景深，獲得一個更銳利的圖像。有關光圈設定的細節(jié)，請參考檢測靈敏度（DetectionSensitivity）章節(jié)(選擇菜單欄里的Help→Library)CountsPhotos發(fā)光值（光子數率單位顯示的圖像數據沒有單位，表示激發(fā)光和入射光的比例。有關關于效率的描述，請參考圖像顯示和測定（ImageDisyandMeasurement）章節(jié)(選擇菜單欄里的Help→Library)。表1 描 CCD檢測的自帶數值。圖像獲取的檢測器 CCD檢測器上入射光子數計量的一種設定要進行恰當的調節(jié)。調整合適的圖像 Radiance -Radiant -度 效率（表面熒光）光值（樣品發(fā)射光/照射光強度）NTF圖圖 圖圖 以對的組的熒光信號一化處理。處理后的圖像數據沒有單位，通常范圍在10-2到10-9之間。的參考圖像。在儀器交付以前，參考圖像已經過測定，并存在LivingImage文件夾中。圖12GFP（445-490nm，發(fā)射515-575nm）。圖圖 黑色的聚苯乙烯板具有最小的發(fā)射信號，而白色聚苯乙烯板具有最高的發(fā)射信號。（成像參數：GFP 時間4秒）13在這塊黑色聚苯乙烯孔板上有四個對稱的熱點，表示有照射源的鏡面放射。（成像參數：GFP濾光片、 時間4秒）品臺潔凈。如果您使用的透射光模式，請不要使用黑色的Lexan?薄片，否則信號將會被阻擋。發(fā)熒光、光和來自IVIS系統(tǒng)成像室內部微弱的自發(fā)熒光。一個環(huán)狀的結構是典型的背景自發(fā)熒光/圖圖 像表示來自黑色Lexan薄片光的典型環(huán)狀結構，黑色Lexan薄片是一種具有低自發(fā)熒光的材料， 5秒圖圖 光時間4秒）（ 物飼料改成alfalfa-的嚙齒類食物是減少自發(fā)熒光最好的方法。通常要用對照組小鼠對背景自發(fā)熒光進圖 圖圖18顯示為一組 熒光和生物發(fā)光發(fā)射的對比圖。這個例子里，3×106個PC3M-luc/DsRed雙標記的腫瘤細胞被 射到動物的背部區(qū)域。該細胞株穩(wěn)定轉染了螢火蟲螢光素 和DsRed2- 在這個例子里，熒光成像需要至少需要3.8×105個細胞才能獲得比組織自發(fā)熒光高的信號，而生物發(fā)光 參考LivingImage軟件用戶手冊里面的ImageMath章節(jié)。進行背景去除，將成像室內的樣品清空，測定熒光背景信號（選擇主菜單上的Acquisition→FluorescentBackground→MeasureFluorescentBackground）。在LivingImage軟件中，背景信號被獲取之后，在控制板（controlpanel）上會出現SubFluorBkg的復選框。您可以使用該復選框開關背圖圖19對比暗電荷偏離去除（左）和熒光背景去除（右）。右邊的圖已通過熒光背景去除選項，對鼻錐 與去除儀器熒光背景（SubtractingInstrumentFluorescentBackground）章節(jié)里描述的方法不同，前章節(jié)里高水平的組織自發(fā)熒光會限制對外源熒光基團檢測的靈敏度，特別是在400-700nm的可見光區(qū)域。即使從對原始激發(fā)濾片圖像信息中提取出背景濾片圖像。的信息，請參考LivingImage軟件用戶手冊中同時也顯示了背景濾光片（DsRedBkg）、初始激發(fā)濾光片（DsRed）和激發(fā)濾光片（DsRed）的帶通。圖20表示IVIS使用初始激發(fā)濾光片和背景濾光片獲取的圖像，和自發(fā)熒光校正后的。區(qū)域（ROI）動物背景的發(fā)光峰值。在校正圖像里，使用均誤差（RMSerror）對背景進行定量。原這種提高可以使檢測到的最少細胞量從1.5×105改進到6.7×103。圖圖 圖21通過背景激發(fā)濾片進行自發(fā)熒光去除技術的光譜數據。這顯示PKH細胞的激發(fā)和發(fā)射光譜，及小鼠組織的激發(fā)光譜。同時包括了使用這種時所用的藍偏背景濾片（DsRedBkg）、原始激發(fā)濾SpectralSpectralPre-clinicalinvivoTECHNICA NOT光譜分離技術是小動物熒光成像的一種關鍵技術，是為了將探針信號與背景信號或不同探針信號區(qū)LuminaIII19塊激發(fā)光濾片已充分滿足多光譜掃描的需要。另外，LuminaIII配備的濾光片均為從世界最大的濾光片廠家Semrock定制的硬涂層耐損傷高透光濾光片，SemrockvsCompetitor。綜上所述，LuminaIII基于高數量、高品質濾光片的配置，可實現最優(yōu)質的III具備全球公認的用于光譜拆分的金標準專利分析算法，通過這種分析算法可進行背景光去除及多射波長540nm，接近GFP的波段，為高背景低波段）的熒光FITC。成像后未使用光譜分離技上圖：Rawdata（光譜分離前）,5ngFITC的信號肉眼隱約可見，背景熒光高，信噪比低，3ngFITC的信號難以辨別。FITCdye-PBS0.05μg/mlFITC（lefttube）&0.03 μg/mlFITC（righttube）熒光素酶獨一無二的發(fā)射光譜信號和組織的光學特征使得LivingImage軟件可檢測到小動物體內光或多張波長位于560-660nm之間的single-view。關DLIT分析的詳細內容，請見光源的DLITFLIT重建。LivingImage軟件采用獲取的single-view光譜學信息來估算發(fā)光細胞的深度。LivingImage運用螢火蟲熒光素酶生物發(fā)光波段為500700nm，這一波段與組織發(fā)光波段能夠形成鮮明對比（1?；鹣x熒光素酶發(fā)光光譜采用PC3M細胞在37℃下測量。

（μ's優(yōu)化散射系數（μ's定義為）光子在組織內散射前路徑的反路徑。 （2）,反應光在空氣-1.4。該模型假設組織具有光學均一性，LivingImage軟件提供多種組織光學性能可進行選擇。種細胞系。這一光譜圖用來normalize軟件在不同波段測量得到的光子通量值。:IVIS200成像系統(tǒng)用560600nm6組濾光片獲取小鼠序列圖，每組濾光片間隔20nm。圖2鼠腫瘤轉移部秒，在其余波段時間=60秒。使得每片呈現出~2000的信號。將Normalize后的數據代入解析1中，第2頁S=光源發(fā)射出的絕對光子通量，d=光源深度（4）3 繪制的線性結果于測量的精密度和光學特性測定的精密度。這一方法的準確性多取決腹部朝上時腹部朝上時背部朝上時如果光信號很微弱或者在組織中位置很深，那么它的強度可能幾乎過組織的自發(fā)熒光，光信號更580nm發(fā)生在二維水平，二維光學成像缺陷主要表現于：1、無法獲取真實的3D2、無法進行絕對精確定量；3、無法實現信號的觀測；4、無法與其它分子成像系統(tǒng)（如CT、PET、MRI等）進行聯表光斑信號，因此出體內真實信號的深度信息、3D發(fā)光信息，并且無法進行不同深度信號定量因此，要獲取完整豐富的生物學數據，必須在三維水平進行成像、觀測及分析。IVISSpectrum是目前全球唯一一款同時具備生物發(fā)光及熒光三維成像能力的小動物成像系統(tǒng)，確定量的信息，更為嚴謹、全面地觀察小動物體內生物學反應，完成小動物成像系統(tǒng)從二：從而導致激發(fā)光能量過于分散而無法有效激發(fā)體內部位的信號，同時也造成大范圍自發(fā)熒光的產生。IVISSpectrum在具備反射照明滿足淺層信號成像的同時，還具備有透射成像技術，這種底部透射技術結合了快速掃描（RasterScan）方式，并采取每點兩次誤差影響，最終得到準確的成像結果。透射成像技術的應用，很大程度擴展了光學 DLITDLIT與FLITDLITFLIT生物發(fā)光成像斷層掃描（DiffuseLuminescenceImagingTomography(DLIT)）是一種通過分析表660nm）(熒光圖像需要在IVISSpectrum或IVISSpectrumCT上使用同樣發(fā)射/激發(fā)光濾片在不同的透射光源位置上 備注：如果在ControlPanel上選擇結構Structure選項，會自動獲取結構照明圖像。圖圖 載物臺和結構照明投光器之間的距離（l），計算得到角度（θ）(2)。2Dandl構成給出的三角形的兩個直角邊：tanθ=D/lh=Δx/tanIVISSpectrumCT、IVISSpectrum和IVIS200系列都做過絕對校準，所以每個CCD像素的電子數都可以被回溯到樣品表面，針對每個成像的表面元素產生一其發(fā)光信號的絕對值 dian)（圖3）。成像系統(tǒng)收集來自表面元素的發(fā)射光，從一定角度（θe）（相對于標準面和表面元間進量）到朝向前透光孔的一個固定角度dΩ。表面發(fā)光值L（θe）與表面元素內的光子密度ρ(photons/mm3)直接相軟件會將樣品分解為體積單元（體素/voxels）的實體網格。每素被當做在其中心具有一個點光源。中，當獲得每個陽性體素的信號源強度時（方程2），盡量將χ2值最小化（方程2）。4DLIT3D從Plot下拉列表中的可在光SourceSpectrum。僅在DLIT時需要。

MouseTissueXPM-（MousePhantomSourceSpectrumDescriptionCBCBSeapansy(Renillareniformis TritiumBeadPhosphor-coatedglassbeadcontainingtritiumgas.含有氚氣的磷Spectrumforbead#5.Bead5備注：螢火蟲螢光素酶的光譜與溫度和PH值有關。表中提供的數據僅是在溫度為37°C，PH范圍為7.0您可以在組織特性（TissueProperties）下拉列表中看到組織的光譜特性值。組織的光譜特性值根據波長進行繪制。選擇與成像樣品最具有代表性的光學特性描述。通常選擇―小鼠組織（MouseTissue）‖ PartII.成像向導是獲取序列圖像非常有利的工具。可以在控制面板問成像向導，并引導用戶獲取gd選擇生物發(fā)光或熒光成像中的多種幫助向FilterConfig。出現的表格可提供所有的可色-未被選擇的變成白色。選擇好濾光片對后，點擊Close然后點擊Next。如自動/手動，FOV，樣品高度和透相關設置信息請參考用戶手冊或者相關技術說明。 Auto-exposureAuto-exposure可自動設 時間、f/stop和binning來獲取定量的最佳信號ttoexttoexxpoosuref/stotopbinning可以通過點擊主菜單的Edit>Preference，在Acquisition選項中設置包括自動等參數的排列TargetCountMinimum3000counts左右來顯示低強度信號（例如，研究原位腫瘤的微小轉移灶，高通量同時對多只小鼠成像。另一方面，將TargetCountMinimum設定為高于3000count會提高過曝現象發(fā)生的幾率。FirstPreference調整，軟件會用調整SecondPreference和thirdpreferences來達到在圖像的ToolPaletteCorrections/Filtering選項。選CropArea，可以通過調節(jié)繪制的方形選框對特定區(qū)域進行CropSet鍵后，儀器背景區(qū)域將被自動從結果圖 勾選UseasBKGforfutureROIs，然后選擇EntireSequence。后續(xù)每一個在上測量的ROI將會自動減去BKG1ROI測量得到的平均背景信號值。據表中顯示的特定背景ROI已經被減去了。65,535個光子。60060000的范圍內；最 y下拉 這篇指南給您提供具體操作步驟——從手動獲取圖像序列到光譜分離的過程。LivingImage4.3.1軟件版針對您的樣品使用相應特定熒光基點擊序列eeeetp，在eeceEitr我們建議在獲取序列的時候除了包我們舉一個例子：AlexoFluor680，激發(fā)679nm/702nm備注：在上面的例子中，進行發(fā)射掃描，CCD45-50nm的675nm/發(fā)射700nm的濾光片組選擇在內。參數（時間、Binning、光圈、激發(fā)光濾備注：有關自動的設置請參見Living

導入圖像序列，將單位切換至Radiant在yze框中，選擇要用來分析的圖像。請注意要確認每像保持在有過飽和過低信號的，請去掉這些從下拉單中選擇光譜分離的方法：Library，GuidedAutomatic或者物體（對照作為僅自發(fā)光的有熒光的域通有點。而，自擇對照小鼠同樣的解剖置來作為陽性小鼠的自發(fā)熒光標記物是一個很好的Loitiltesorlal或magigWiard建議在進行光譜分離過程中盡量使用該特Image軟件中的光譜分離具有相似的設置，在這種另外，Manual和Guided模式可以用于創(chuàng)建Spectraltudies有多達4個組分特征可供選擇。如果光譜組分數量未知，PrincipleComponent ysis選擇會被激活，然

一旦熒光基團的準確數量通過green+按鈕被添加在ProbeInformationlist之后，可通過以從AF680+自發(fā)熒光組分中被提取出來，ComputePureSpectrum。在ImageCube中，置。使用PenTool可以標記ImageCube中 putePure putePureSpectrumAF680信號的圖像（在這里以藍色表示。另外，SpectralLibrary的組分可以通過點擊綠色的+UnmixingWizardPenTool下拉菜單里的Import選項，導入Spectral一旦通過ComputePureSpectrum算法將純的AF680Imagecube中將AF680信號完全回溯分離出來。

成以后，分離的組分可以保存在Spectral種背景信號（例如，熒光+自發(fā)熒光。Guided選項通常被應用到含有陽性和對照的已建立的SpectralLibraries，而且也可以被用做區(qū)域型的特GuidedUnmixing。使用鉛筆工具，在Imagecube的光譜列使用已建立的光譜文件進行分離熒光基團信號，原來保存的SpectrumLibrary是對應相同設置的實驗已經導入的圖像序列的光譜分離。如果光譜文庫過Guided或Manual的選項針對合適的對照和

如果光譜文庫中包括序列的設置，可以點擊StartUnmixingSpectralLibrary文件可以被運用到該圖像序列時，導入LoadSpectralLibraryshowqualifiedonly的選項，可以去除在圖像序列獲取中不合適的文件名會以藍色，點擊Apply按鈕。序列會自SpectralLibrary文件中的方法進行分離，并光探針顏色編碼的合成圖像。每一像都可以通每像都有自動標尺，并且在每像的頂部上方ROI工具熒光探針的發(fā)射曲線靠左，在500nm的發(fā)射光以上選擇標準是基于假設用戶使用型號為IVISSpectrum、LuminaIII、XRKinetic有多組IVISLumina、LuminaII、50、100或200，則僅需選擇探針濾光片對應的背對為激發(fā)DsRed/發(fā)射DsRed-自發(fā)背景熒光濾光片則選擇激發(fā)DsRedBKG/發(fā)射DsRed。

3ROI來確定k值。k值可顯示在不同波段的ROI和選擇圈選的ROI非常重要。 -圖像-第一步是選擇作為底層的。請注意，來自于不適于的。這能僅適用于同一動物被多種markers標記時的圖像。選定需進行的層后，可選擇和調節(jié)每一提示：強度單位形式只可顯示為兩像共用的單位，如果存在生物發(fā)光光源，RadiantEfficiency多種格式，如PNG、JPG、BMP。每一片可在獨立窗口中打開。將設置統(tǒng)一為一個標尺。此時調節(jié)標尺會使整個序列圖同時被如果需要對SequenceGroup中的圖方的EditSequence圖標。在Browser中打開的每片都會列在BrowserImages窗口中，并可以直接加到生成如果新生成的序列組被保存，在RetiredImages窗口中會出現刪除選項，同時后SequenceClicks上點擊選中（或者按住Control-點擊多選），您可采用RetireMoveUpMoveDown鍵對圖圈選圈選行選擇。形狀無關緊要，不同形狀可繪制不同的ROI。記住此規(guī)則—ROIs越大越好。背景自發(fā)熒光水請注意紅色方形ROI，較大的圓圈ROIs和輪廓線ROIs總信號通量相似—然而在強度最高紅色區(qū)域圈選的ROI信號通量只有信號14%（其信號通量占其它三個ROI信號通量平均值的百分果用戶決定使用該功能，那么在ToolPalette中ROIToolsThreshold%滑塊會被激活。推薦threshold5-10%之間。使用draw工ROI，點擊鼠標右鍵閉SubjectROIs的形狀只能是方形。用戶只有這一個形狀可以選擇。SubjectROI，使其圈選住整只小鼠。雙擊ROIROIProperties。屬性中可對該SubjectROI的顏色、大小和標注進行更改。備注：SubjectROIsMeasurementROI圈選會自動聯接MeasurementROIs進行手動聯接。MeasurementROI的邊框可進入ROILabel，對您的ROIs通過在ToolPalette中ROITools部分選擇MeasureROIs，生成一個展示所有在序列圖中圈選ROIs的ConfigureConfigureMeasurementsCustomize鍵來調整顯示數據列表。ROIMeasurementsConfigureMeasurements窗口的左側。不僅可顯示ROIEditImageLabels窗口，如獲取日期和時間。在SubjectLabel排序的。另外，可通過左右拖拽整列數據，對數據按照需要進行整理。在窗口右下角點擊SelectAllCopy鍵，數據可直接粘貼于?Excel?或其它電子表格分析程序中。于反射照明成像方法。對于組織的熒光光源，由于激發(fā)光為集中的2mm光束，且激發(fā)光與檢測CCD在動物的兩側，因此該透射成像方式得到的組織自發(fā)光水平會更低。6a14b和熒光透射成像SequenceSetup提示：LI4用戶可以設置時間，相關信息請參考自動技術說明2。 Setup窗口。 在TransilluminationSetup窗口左上端可以勾選快速的對比，可在窗口上端勾選MaskGridPointsToSubject選框會自動去除動物區(qū)域點表示建議避免選中的區(qū)域。按住鍵盤上的Ctrl鍵并按照以下規(guī)則中的情 內—600-60,000counts。

在上方的下拉菜單中將單位更換成NTFEfficiency可對信號進行標準化和校準。有關NTFEfficiency的內容請參見熒光透LivingImage4以上的軟件版本中才能實現。該標準化透射熒光的技術說明是1.通過中性密度濾光片激發(fā)/620

在進行熒光透射成像時，較薄組織所對應的光吸收較少，小鼠身上每個透射成像區(qū)域所對應的組織和光吸收信息可以通過背景透射光圖像來反映。熒光探針特異性的透射光圖像是使用與背景透射光圖像相同的發(fā)射濾光片拍攝的，但利用了一張熒光探針所對應的特異性激發(fā)濾光片，之后通過背景透射光圖像來對特異性透射光圖像進行標準化。該標準化透射熒光技術可以有效地―去除‖由于動物組織的光密度差異導致的全部背景信號，還原出熒光探針真實特異的信號。 Panel中或ImagingWizard窗口中將“標準化”選項框勾選上。

Wizard窗口中是默認被勾選上的像（被成為Fluorescent）。圖4.激發(fā)535nm/發(fā)射620 成NTFEfficiency。6.使用NTFEfficiencyLivingImage4軟件中，我們加入快速掃描功能?？焖賿呙柽^程中，2D熒光透射成像序列圖像下圖所示的一張成像同時能夠節(jié)約用戶時間。使用快速掃描功能掃描一整只小鼠所需時間在2-5分3D成像（FLIT–3D）3D成像所需的空間信建。使用不能進行FLIT成像。因為皮膚中的黑色素會影響重建算法中對被測對象和成像臺的區(qū)分。（NTF - IVIS?Spectrum配備有激光振鏡，用來在儀器表面投射FOV。當打開成像箱門時可以看到其照射在該輪廓被稱為表面拓撲形貌，在DLIT3D信號重建過程中被用來計算熒光信號深度和強度。OrientationDorsal或Ventral，在SubjectNude/Furredmouse或Phantom―ue‖選項，對 鼠選擇―‖選項 到一合適的表面結構。FLIT?杈垤與債像髬?抺槝?核和騾光果壎抒擦-表面挾扨 對于所有的3DFLIT重建，默認建議的圖像單位格式為NTF效率。這種情況下軟件會利用NTF進行背Fluorescence–NormalizedTechnical。備注：如果是通過ImagingWizard獲取的，軟件會自動識別Wizard中輸入的濾光片信息。 在DataPreview下，可以對數據進行調節(jié)，并設定閾值。閾值通常默認5%或以上，因為自發(fā)熒小鼠對象進行蒙板區(qū)域選擇，以排除其他區(qū)域。信息請參照UserGuide中關于該工具的使用。當重建完成以，會在ets下展示計算的數信息?？梢源騊otoneityMa，并通Mae和mle在最底部一行。如果底部一行顯示出ae和mltd圖偏差接近%（以綠色來顯示），則表a一旦重建結果被保存以后，在ToolPalette中的3DOpticalRegistration。默認情況下，SubjectSurface，或Topographicmap會自動打開，以便進行樣品內部信號源的3D定位。也可以通過Surface中的選項，對Subject另外，可以通過點擊DisyPhotonDensityMap按鈕，選擇顯示分析中每個波長的Simulated或Measured的2D光漫射的體素的光強度以TotalFluorescentYieldpmol/Mcm表示，會出現在Source中的MeasuredSources框信號源的深度可以使用VoxelSelectionTool左側的MeasurementCursor來確定。點擊Source右CoronlSagittl nesTools可以滾動選擇動物的axis，有關信號源和相3D信號源可以制作成動畫，以.avi，.mov，.mpg和.mp4的格式輸出。該功能可以在Tools->3D備注：通過FLIT獲得的熒光信號源的光強度值以TotalFluorescentYieldpmol/Mcm表示，信號源可以使IVISSpectrum系統(tǒng)有一個內置激光振鏡，用于在成像平臺的OrientationSubject下點擊GenerateSurface后，拓撲分析工具框波長超過600nm的光吸收現象會顯著下降，所以如果我們使實驗對象表面發(fā)射的光通過560到640nm素酶。當然，LivingImage軟件同樣支持其它生物發(fā)光光源的3D重建。的時間或更大的binning值才能使每片獲的獲取。在這種情況下，您可以將減少為3張-580nm，600nm620nm，此三張在分析過程那么其信號強度足以完成生物發(fā)光3D分析。

表面拓撲結構說明:使用鼠會得到更好的表撲重建，DLIT分析不能進行。因此，有必要DLIT成像。因為皮膚中的黑色素會影響重建算法中對被測對象和成像臺的區(qū)設置提示:在視野DC進行DLIT可得到更的序列圖。LivingImage4軟件版本包括自動在在IVIS系統(tǒng)控制面板中點擊Sequence~62m擇適合于報告熒光的濾光片。覆蓋范圍為確定選中Photograph，對Luminescent參560nm，并勾選Structure獲取體表結構。p果使用自動，需要對參數進行相應的調射濾光片-此處選用580nm為例。確保每片中有600-60,000counts。點開備注:DLIT獲取的穩(wěn)定轉染細胞系的光強物發(fā)光斷層掃描技術說明中的以下操作：SetupandAcquisition和Topography。ToolPalette里面打開DLIT3DReconstruction標 備注：LivingImage軟件會自動去除過飽和備注：如果是通過ImagingWizard獲取的，在DataPreview下，可以對數據進行調口底部的SelectAll和DataAdjustment，將閾值稍微調低，以便將的信號包含到如果需要對單像進行閾值調節(jié)，可以雙擊打開該。在這個窗口中也有Masking排除其坾區(qū)域。信息請參照UserGuide當選好序列，并且DataAdjustment（如果需計算的數值信息?？梢源蜷_PhotonDensity如果底部一行顯示出Measured和Simulated

每像Measured和Simulated漫射形式之間的偏差%。綠色表示―Go。一旦重建結果被保存以后，在ToolPalette中的3DOpticalTool中，SubjectSurface更換不同的顏色、不或幾何形式。有兩種可視化的選擇：DisySourceSurface和DisyVoxel。選擇DisySourceSurface將會顯示出重建信號源體積的等值面。用表3D散射的類型，可以使用VoxelSelectionTool選擇體素，信號源的測量值將會被記錄下來（參見步驟12-14。lrare節(jié)信號源的大小，因為在定量輸出的時候，使腫?盁樨會去掉一些在3DOpticalTools中的Registration表中，可以對表面/信號源重建和通用MouseOrganAtlas進行疊加。 和on-linearAutomatic中選擇擊名邊上的checking/unchecking框，將顯示或移除。的顏色不能改變，但是的可以通過Opacity滑動條工具進會出現在Source中的MeasuredSources信號源的深度可以使用VoxelSelectionTool左側的MeasurementCursor來確定。點擊Source右下角的CenterofMass，選擇信號源。軟件將展示出Coronal（冠狀面）、Sagittal（矢量面）和Transaxial（橫斷面）使用SlicenesTools可以滾動選擇動物的3D信號源可以制作成動畫，功能可以在Tools->3DAnimations里找到。 ficationTechnical。即可推斷出DLIT光信號代表的細胞數目或FLIT光信號代表的分子濃度或細胞數量。數據庫來自于已知濃度檢測對象的成像數據，包括生物發(fā)光或熒光細胞，分子和熒光標記的化合物等。圖 擇Wellte

AF750752nm，發(fā)射峰779nm。我們選擇的激發(fā)濾光片745nm。圖2.Welltefication選項位Tools 定位好ROI并在窗口中相應表格里輸入細胞Set作Set作為背景孔。最后，選擇fy計算光子/秒/細胞。

3.輸入生物發(fā)光細胞數目定量和對

ROIROI并在下窗口外Set鍵，作為樣品孔。然后選擇孔板作為背景對照并按下窗口外的Set作為背景孔。選ApplytoSequence，使序列中所有濾光片加入計算。最后，選擇fy計算每組濾光片成像ficationPlots表中會顯示ROIs計算數

結果表中會列出每片分析值。命名序列圖或使用序列圖默Save

用Well teficationWindow加載數據，并在新的DLITFLITpmol數時，選擇ToolPalette中的DLIT3DReconstruction，選擇Properties鍵下的Luminescent或Fluorescent9.3D定量輸出為細胞或pmol

備注：有關DLIT和FLITpmol數。 DLITFLIT3D圖像加入，如生物發(fā)光（DLIT）或ColorTablesScale的最小值。3DView中，可使用體素選PerkinElmerIVIS自動注射系統(tǒng)的操作說明或哈佛儀器公司的PHD22/2000注射泵系列用戶手冊。上述文件在LivingImage安裝軟件的CDROM中均可以找到。IVIS自動注射系統(tǒng)可以在動態(tài)或靜態(tài)圖像獲取時使用，但動物必須保持不動狀圖1輸液泵控制界面2圖3如需自動停止注射，選擇AutoStopAfterAcquisition。如需手動停止注射，可隨時點擊StopNow。備注：輸液泵控制面板中的信息可以在clickinfofile中進行保存。在數據獲取過程中，如果在開始注射通 um-Time圖中。 um-Time圖會在圖像數據獲取結束的時刻停止記錄（即使輸液泵還沒有停 PartIII.常用的注射方式包括腹膜內注射，皮射和靜脈注射，目前，前兩種方式應用較廣泛。將一定量的底組織內而不在腹腔內，這種情況尤其在患有嚴重疾病以及瘦弱的小鼠身上發(fā)生。這常常會導致得到注射底物的挽回方法是等待2-3小時候熒光素被完全代謝后再次注射。正是由于此原因，許多人采用后頸部皮射，掌握正確的注射方法后能夠顯著降低注射失敗率。有關皮射與腹膜內注射Inoueet.al.,2009,Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging36:771–779.尾靜脈注射底物，al.2003BioTechniques34:1184-1188很好的比較了原位側位腫瘤與腦腫瘤。結果顯示，一旦底物到達靶組織，熒光素酶的量會影響到檢測限并可以使底物濃度曲線改變。對于每個新得到的細胞系，通采用如下操作得到所需代謝曲線：注意—代謝曲線的建立不需要大量的實驗動物，通常3-5只即可滿足。選擇設置合適的靈敏度。Autoexposure能夠給出合適的時間防止過度，同時建議使用默認設置Mediumbinning和F/Stop1為最初的圖像獲取參數。在圖像獲取過程中時間會根據所需的count值進行調節(jié)。SequenceEditorAdd鍵，設置好參數的圖像會被添加SequenceEditorNumberofSegments的勾選框，輸入間鐘，相當于總獲取數據時間為60分鐘。當點擊AcquireSequence后開始獲取第一片。時，可能需要超過1min的時間才能夠得到我們需要的count值。那么我們建議將時間設置縮短5s，這5s留給圖像和電機發(fā)動。設置方法為子中，我們的最大時間設置為175秒。的底物溶液100μL。Burgosetal2003BioTechniques34:1184-118中一個比較好的例子。典型的底物代謝曲線首先會10-20分鐘。為了得到最優(yōu)的定量結果通常會選用曲線的平臺期進行圖像 PerkinElmer可以領先熒光素是在各種不同的可生物發(fā)光微生物細胞中發(fā)現的一種化學物質。當熒光素在熒光素酶和TP的催化氧化作用下可以產生藍綠色的熒光。由于該反應需要TP的存在，這可以讓研究者確定是否有能量或生命的存在。由光可以被光度計或閃爍計數器檢熒光素也可以應用于PerkinElmer胞膜進入細胞內，因此可用于檢測細胞內熒光

成的低分子量有機化合物。熒光素被發(fā)現于螢火蟲和其它熒光生TP小鼠經過lux細菌熒光素酶轉染后不需要底物熒細菌中，整個底物子穩(wěn)定存在于上。PerkinElmer的生物發(fā)光細菌模型不需要注注射PerkinElmer的底物。Visualizinggeneexpressioninlivingm usingabioluminescentreporter.ContagC.H.,SpilmanS.D.,ContagP.R.,OshiroM.,EamesB.,DenneryP.,StevensonD.K.andBenaronD.A.DepartmentofPediatrics,StanfordUniversitySchoolofMedicine,CA94305,USA.PhotochemistryandPhotobiology,October1997,Vol.66,pp.523-531.Evolutionofbeetlebioluminescence:theoriginofbeetleluciferin.DayJ.C.,TisiL.C.andBaileyM.J.CentreforEcologyandHydrology(CEH)-Oxford,MansfieldRoad,OxfordOX13SR,Luminescence,January-February2004,Vol.19,Oxyluciferin,aluminescenceproductoffireflyluciferase,isenzymaticallyregeneratedintoluciferin.GomiK.andKajiyamaN.ResearchandDevelopmentDivision,KikkomanCorporation,Noda-shi,Chiba278-0037,Japan.JBiolChem,September282001,Vol.276,

Bioluminescenceimagingoflymphocytetraffickinginvivo.HardyJ.,EdingerM.,BaannM.H.,NegrinR.S.,FathmanC.G.andContagC.H.DepartmentofPediatrics,StanfordUniversitySchoolofMedicine,Stanford,CA,USA.ExpHematol,December2001,Vol.29,pp.CelluptakeandtissuedistributionofradioiodinelabelledD-luciferin:implicationsforluciferasebasedgeneimaging.LeeK.H.,ByunS.S.,PaikJ.Y.,LeeS.Y.,SongS.H.,ChoeY.S.andKimB.T.DepartmentofNuclearMedicine,SamsungMedicalCenter,SungkyunkwanUniversitySchoolofMedicine,Seoul,Korea.NuclMedCommun.,September2003,Vol.24,pp.1003-1009.Inuterodeliveryofadeno-associatedviralvectors:intraperitonealgenetransferproduceslong-termexpression.LipshutzG.S.,GruberC.A.,CaoY.,HardyJ.,ContagC.H.andGaenslerK.M.DepartmentofSurgery,UniversityofCalifornia,SanFrancisco,SanFrancisco,CA94143,USA.MolecularTherapy,March2001,Vol.3,pp.Rapidandtativeassessmentofcancertreatmentresponseusinginvivobioluminescenceimaging.RehemtullaA.,StegmanL.D.,CardozoS.J.,GuptaS.,HallD.E.,ContagC.H.andRossB.D.TheCenterforMolecularImagingandtheDepartmentofRadiationOncology,UniversityofMichiganMedicalSchool,AnnArbor,MI48109,USA.Neosia,November-December2000,Vol.2,pp.491-495Visualizingthekineticsoftumor-cellclearancelivinganimals.SweeneyT.J.,MailanderV.,TuckerA.A.,OlomuA.B.,ZhangW.,CaoY.,NegrinR.S.andContagC.H.DepartmentofMedicine,StanfordUniversitySchoolofMedicine,Stanford,CA94305, atlAcadSciUSA,October1999,Vol.96,體 體材 材#xr-1001)D-100mM30mg/ml將D-Lucirerin溶解于預熱好的組織培養(yǎng)基中成濃度為150μg/ml的工作配置工作液(終濃度150μg/mL)。

—D-熒光素，鉀鹽，1.0克/瓶(Xenogen xr-1001)(15mg/mL)，0.2um濾膜過濾除菌。10uL/g150mg/kg熒光μl工作液，被給予1.5mg熒光素。）*需要對每個動物模型做熒光素動力注意：小鼠可以耐受1ml無刺激的腹腔注射劑向下移動在下腹四分之一部位形成一個空腔。注射點用75%的乙醇。D-熒光素底物，并在對側一個位點再注入另一半。然而，如果注射位點比較合成1%戊巴比妥鈉溶液。麻醉劑量為0.08-0.1ml戊巴比妥鈉溶液/10g小鼠體重。%,備注T150細胞培養(yǎng)瓶中加入5ml）。公司，產品貨號#E1741）和pCI-neo哺乳動物表達載體，可以對腫瘤細胞系進行轉染。使用不含、蛋白或抗生素的細胞培養(yǎng)基對4.5μg(4.5μl)的pGL3熒光素酶報告載體和0.5μg(0.5μl)的pCI-neo哺乳動物表達載體進行稀釋，稀釋后的總體積為150μl；混合后離心數秒將向上述DNA溶液中加入20μl的Superfect轉染試劑，通過移液器吸吹5次或振蕩器振蕩10秒進行混向轉染混合物中加入1ml含和抗生素的細胞培養(yǎng)基，使用移液器吸吹2次進行混合，之后立即將上述混合液加入60mm的細胞培養(yǎng)皿中。建議做一系列表型測試，以驗證這些細胞的確被穩(wěn)定轉染并且它們在行為表型上仍接近其親本細胞系（有時使用熒光素酶轉染后的腫瘤細胞會變得更具性）。例如：通過皮下快速融化200X的熒光素母液，使用完全細胞培養(yǎng)基按照1:100的比例進行稀釋（配成2X熒光素細胞計數，調整細胞濃度至100,000細胞/ml（10,000細胞/100μl）使用多通道移液器從#1孔吸100μl細胞液至孔#2中并混合均勻，按上述1:2比例的稀釋方法從#2孔吸100μl細胞液至#3孔中；同樣方法進行梯度稀釋至#10#10孔稀釋并且混合后吸棄100μl使用無的細胞培養(yǎng)基或PBS對貼壁細胞進行，去除可能抑制胰蛋白酶消化作用的殘余蛋白（T25細胞培養(yǎng)瓶中加7ml，T75細胞培養(yǎng)瓶中加10ml，T-162/T-225細胞培養(yǎng)瓶中加15ml）。之后使用無菌移液管吸棄培養(yǎng)基（或PBS）。向含貼壁細胞的細胞培養(yǎng)瓶中加入胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%胰蛋白酶*，1mMEDTA胞培養(yǎng)瓶轉移至生物安全柜中，打開培養(yǎng)瓶，加入適當體積的完全細胞培養(yǎng)基（T25細胞培養(yǎng)瓶中加5ml，T75細胞培養(yǎng)瓶中加10ml，T-162/T-225細胞培養(yǎng)瓶中加20ml）。使用移液器反復吹打細胞懸液（移液器用―快速‖檔）以打散細胞聚團（推薦使用10ml的移液管；避免移液繼續(xù)每隔2分鐘拍一片（創(chuàng)建一個成像序列），一直拍攝約60分鐘，從而得到一條針對該實螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin，鉀鹽，1.0g/管PerkinElmer122796)DPBS,不含Mg2+和Ca2+針頭式過濾器0.2熒光素溶液注射劑量為10μl/g動物體重，對應著每千克小鼠體重注射150mg的熒光素（例如：對于10g體重的小鼠，注射100μl熒光素溶液，對應于1.5mg的熒光素）。注射劑量：150毫克熒光素/千克動物體重,通常注射150μl(溶液濃度15注射劑量依舊是150mg/kg，靜脈注射時，注射溶液的體積過動物血容量的10%（如小鼠不超過200μl）。建議：配制熒光素溶液濃度為15mg/ml，注射劑量為150mg/kg（對應于10ml/kg）。靜脈注射時一般使用1ml量程、26號針頭的注射器。使用10mlDPBS細胞兩次（注意貼著管壁緩緩加入DPBS，輕彈管壁讓細胞均勻混合；記住先加入2mlDPBS并混合細胞，之后再加入8mlDPBS）。3x106細胞/100μl;2x106細胞/100μl。細胞重懸后離心管置于冰上以待來，使用DPBS進行細胞重懸，重懸后的細胞濃度為1x105-1x106細胞/50-100μl。/使用鑷子輕輕捏起小鼠皮膚，皮下插入針頭（25x5/8‖號針頭）。松開鑷子，輕輕地注入細胞，圖像獲取時，建議使用counts單位，這樣可以調節(jié)相機設置以優(yōu)化信號。信號強度應高于背景噪聲>100counts）且低于飽和值（65535counts）。在使用ROI進行信號定量和不同圖像間信號比較時，建議使用―photons‖單位。在該單位模式下，定量和圖像展示時都會自動考慮不同時間，binning值，光圈大小和成像視野因素的影響。5-7周的小鼠購自CharlesRiver公司 A.來，使用DPBS進行細胞重懸，重懸后的細胞濃度為1-5x105細胞/100μl。第0天，使用25x5/8‖號針頭向雄性C57BL/6白化小鼠（JacksonLaboratory公司）腹腔注射螢火蟲熒光素（150mg/kg）。小鼠通體麻醉（3%異氟烷）或使用25x5/8‖號針頭肌肉注射（120mg/kg）/甲苯噻圖像獲取時，建議使用count‖單位，這樣可以調節(jié)相機設置以優(yōu)化信號。信號強度應高于背景噪聲>100counts）且低于飽和值（65535counts）。在使用ROI進行信號定量和不同圖像間信號比較時，建議使用―photon‖單位。在該單位模式下，定量和展示時都會自動考慮不同時間，binning值，光圈大小和成像視野因素的影響。 (VetEquip公司,向蒸發(fā)器中灌注異氟烷，灌注時蒸發(fā)器的旋鈕應處于―O‖調節(jié)氧氣流量為1升/鹽酸(Ketaset)(FortDodgeAnimalHealth公司將(100mg/ml)和甲苯噻嗪(20mg/ml)按4:1比例配成混合制劑肌肉注射劑量為(120mg/kg)和甲苯噻嗪(6mg/kg)每20g小鼠體重注射0.03ml（每10g小鼠體重注射15μl）使用IVISLuminaIVISSpectrumIVIS100200系列獲取圖像：確認激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片分別被設置為B‖和Oen備注：在成像前可以先拍一張明場（去掉―unecn或―luoen的勾選框，―Photogaphc‖和―Auto‖勾選框內打勾，點擊―cquie‖進行拍照），用于觀察動物在成像倉內的狀態(tài)。點擊cquie―Acquie‖按鈕變成―SopStop‖按鈕。濾光片鎖定（FilterLock）模式下，從激發(fā)濾光片下拉條中選擇激發(fā)濾光片，軟件會自動選擇適備注：在成像前可以先拍一張明場（去掉―unecn或―luoen的勾選框，―Photogaphc‖和―Auto‖勾選框內打勾，點擊―cquie‖進行拍照），用于觀察動物在成像倉內的狀態(tài)。點擊cquie―Acquie‖按鈕變成―SopStop‖按鈕。在ROI中，從拉條中選擇eauee ROI‖ (同時進行反射成像，可以看出使用PerkinElmer小鼠剃毛器處理后能顯著降低背景熒光。XGI－8的氧氣，可以看到閥門處于打開位置，流量計指示氧氣已隨時觀察ISOFLURANE的水平線，注意不要超過最大允許線。ISOFLURANE達到玻璃指示窗上的最大標線時，表明蒸發(fā)器已灌注滿。此時應停止，不要過分感應箱1.5公升每分鐘，進行小鼠預麻醉。IVIS分支管流量計和感應箱流量計的指示球下降到指示管的底部說明XGI－8減壓完畢。RC2+力應顯示為“6PSI+/-0.5PSI一只為Rhodamine皮射用小鼠，剩下一只小鼠備用，實驗前一天完成小鼠剃毛，小鼠禁食限責任公司，白色粉末，產品純度>99%(高純級)，分子量248.26雙蒸水（Doubledistilled7515ml50ml1.5mlEppendorfIVISSpectrumIVISLuminaRhodamine0.04gRhodamine50ml40solution包好并標記上濃度和配制日期等信息，置于4℃冰箱中；使用1.5mlEppendorf小0.033μg/mlworkingsolutionworkingsolution1%戊巴比妥鈉溶液，但劑量一般不超過0.1ml。0.033μ/ml的RhodaminewrkingsoluioVISLumnaIII0.05μg/ml和0.04μg/ml的RhodamineworingslutioRhodamieorkingsoution1ml02ml的空氣以待用，注射器的針管上用記號筆寫好濃度信息以免；對于小鼠實驗操作新手，注射時建議左手持鑷子，輕輕鑷起小鼠注射處的表皮，右手持針，針頭斜面朝上，順著鑷子表皮提2~3mm0.1抽針時一定要慢；抽針時如果有少量滲出，可用干紗布或棉球輕輕吸去，避免用力檫拭或按壓射倘誤小沾多建只。成像：將IVISSpectrum/IVISLuminaIII開機后，進行初始化；取黑色底不透96孔板，向其中一孔中加入350μl的0.05μg/mlRhodamineworkingsolution；將麻醉后的空白對照小鼠置于成像倉（ImageChamber）內左側，皮射的小鼠置于中間，黑色底不透96孔板置于右側；對于IVISSpectrum，使用FOVC，對于IVISLuminaIII，使用FOVD，調整成像倉中小鼠和板的選擇Fluorescence下面的SpectralUnmixing選項，對于LivingImage4.4軟件版本，直接選擇database中的Rhodamine即可，對于LivingImage4.3軟件版本，其database里無Rhodamine，可以選擇與其接近的tdTomato，調整filterspair，激發(fā)濾光片用 Labels里面對實驗信息進行記錄，之后對成像數據進行保存，必要時可用格式化后的光盤將數據拷FLBackgroundSubtraction”，在“PhotoMaskSetup”中調整Threshold使小鼠體外的紫域的Rhodamine皮射區(qū)域信號肉眼可能可見但較模糊，建議在左側對照小鼠的耳部或口鼻處劃TissueAF，在中間小鼠的0.05μg/mlRhodamine皮射區(qū)或右側0.05μg/mlRhodamine的板中標樣孔區(qū)域內劃取Rhodamine信號（一般選擇中間小鼠的0.05μg/mlRhodamine皮射區(qū)進行光譜分離效果更好，雜信號較少），劃線時建議選用“Pick”中的“Thin”，點擊“ComputerthepurespectrumRhodaminePurespectrumUnmix”；調整“ColorScale”使用“ContourROIAutoROIParametersThresholdROI區(qū)域進行調節(jié)；在Units為“RadiantEfficiency”的情形下，點擊“MeasureROIs”，即可看見全部已圈選ROIs的定量結果。正常情況下，IVISSpectrumIVISLuminaIII0.05μg/mlRhodamine若實驗時由于不確定原因（如皮射操作不熟練，入針太深），導致0.05μg/ml的Rhodamine信號非常微弱，可以考慮使用備用小鼠，皮射0.1μg/ml的Rhodamineworkingsolution進對于有毛小鼠（如ICR鼠、鼠、C57鼠等），我們強烈建議在成像實驗的前一天進行脫毛，ICR（白毛）465nm圖右是胃腸中食物熒光信號的3D透射成像圖。 當濃度的/標準樣品（信號強度與目標信號強度同一級別，不能過高以免干擾目標信號），如下圖。96PartIV.在腫瘤細胞皮射的當天即可靈敏的觀測到由5個被標記腫瘤細胞發(fā)出的光信號。定量分析顯示，利用傳統(tǒng)卡尺皮射7天即可觀測到腫瘤的生長，并對隨后的發(fā)展變化進行長期觀測。瘤的生長情況，在注射后27天觀測到其他部位的轉移信號。B.體外組織成像進一步驗證轉移的發(fā)生。IVIS3D光學成像（橙色），QuantumFXuCT3D解剖學成像（骨架），并將3D光學功能性結果與3D解剖學結果進行影像融合，而確定腫瘤的骨轉移。重要的作用。全球各大制藥企業(yè)均已采用光學成像技術開展抗腫瘤新藥的研發(fā)，其中已有6種藥物獲得FDA認證，另有8種藥物處于臨床測試階段。Docetax（應用IVIS成像系統(tǒng)長期觀測3種藥物對腎包膜移植瘤肺部轉移的抑制效果，并進行定量分析，結果顯示30mg/kgDocetaxel（TXT）對腫瘤轉移的抑制效果最好。Sutent的部分研究結果，研究人員首先利用卡尺測量腫瘤體積的方映藥物治療效果。憑借光學成像的實驗結果，SutentFDA除了應用生物發(fā)光技術研究藥物對于腫瘤的治療效果之外，熒光成像技術同樣可以應用于此類研究，主要方式為通過外源注射功能性熒光試劑觀測藥物對于腫瘤某一方面的治療情況，如利用反映血管生成的熒光試劑觀測藥物對于腫瘤血管新生的抑制情況，又如利用反映細胞凋亡的熒光試劑觀測由于藥物治療而誘發(fā)的腫瘤細胞凋亡情況。FMTAngioSense750CT322藥物在抑制腫瘤血管新生方面的作用效果，結果表明CT322可以通過抑制腫瘤血管新生進而抑制腫瘤的生長。對HER2陽性的人癌SKOV3具有良好靶向性。排斥、藥物毒性問題等。因此，構建新型藥物載體也是目前藥物研究的熱點之一，應用小動物光學成像技術同樣可以在這一領域發(fā)揮作用。如下圖所示為研究人員通過小動物光學成像技術觀測一種放組分、熒光結合位點等。結果表明，通過應用新型納米給藥載體可以有效提升藥物的靶向治療效少。PerkinElmer的FMT小動物熒光斷層成像系統(tǒng)可以很好的滿足此類應用需求。應用FMT成像系不同時間點不同BSA分布的定量結果。應用熒光成像技術進行藥物分布的觀測目前主要局限于對生物大分子藥物的研究，而對天然或分子量的熒光標記小分子藥物，則熒光本身即會對小分子藥物在體內的分布代謝產生影響，因像系統(tǒng)可以觀測到放射性核素在小鼠體內發(fā)出的光學信號，其所依據的是切輻射（CherenkovRadiation）原理，由此拓展了光學成像技術的應用范疇，即利用光學成像系統(tǒng)觀測經放射性核系統(tǒng)進行切輻射成像，觀測不同時間點[18F]FDG在腫瘤部位的代謝；C.應用PET系統(tǒng)成像，觀測不同時間點[18F]FDG在腫瘤部位的代謝，結果與B一致。p53是調節(jié)細胞正常生命活動的一種重要，控制著細胞周期的啟動。p53也同時被認為是一種重要的抑癌，在人類50%以上的腫瘤組織中均發(fā)現了p53的突變，這是腫瘤中最常見的遺傳學改變，說明該的改變很可能是人類腫瘤產生的主要發(fā)病因素。下圖所示是于2007年Nature雜(?tet-off‘)及四環(huán)素依賴性p53shRNA的逆轉錄表達載體與熒光素酶質粒共轉染從小鼠胚胎提取強力霉素（doxycycline）p53p53的表達能夠子機理目前還不完全清楚。LSD1是第一個被發(fā)現的組蛋白去甲基化酶，理論上對轉錄起廣泛調控LSD1只參與一些特異的細胞信號通路的調控而且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展高度移，從而揭示了LSD1這一表觀調控因子在抑制轉移中的重要作用，并為轉移的干預提供了新的分子靶點。上述結果于2009年Cell。細胞肺部轉移的影響。上圖左：應用IVIS系統(tǒng)進行生物發(fā)光成像結果；上圖右：光學定量結果。（CancerTumorStemell,CSCTSC對腫瘤細胞的外界理化因素不敏感，導致腫瘤往往在常規(guī)治療方法消滅大部分普通腫瘤細胞后一段時間復發(fā)。因此，如果能夠尋找到腫瘤干細胞特異性治療靶標，將為腫瘤治療開辟新的路徑。OCT4是參與調控胚胎干細胞自我更新和維持其全能性的最重要的轉錄因子之，因此，OCT4可能是腫瘤干細胞的潛在靶點之一。下述實驗是應用IVIS系統(tǒng)觀測OCT4在細胞成瘤中的作用。研究者將帶有OCT4的載體轉染經熒光素酶標記的鼠源細胞株4T1-luc，并分選出高表達及低表達OCT4的細胞株，分別原位接種于小鼠胸部乳腺脂肪墊，觀測結果顯示OCT4高表達細胞株具有更高的成瘤性。特異性表達、腫瘤周邊血管的新生、腫瘤組織局部缺氧等，通過觀測這些分子能夠判斷