放射性配體與受體結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)(RBA)方法

內(nèi)容實(shí)驗(yàn)定義與原理實(shí)驗(yàn)材料與儀器實(shí)驗(yàn)方法Scatchard方程與作圖（飽和與競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)）RBA的安全問題實(shí)驗(yàn)舉例目前一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)實(shí)驗(yàn)定義與原理定義放射性配基與受體結(jié)合分析簡(jiǎn)稱為受體放射分析（radioassayofreceptors），它是應(yīng)用放射性核素標(biāo)記配基與特異受體相結(jié)合，研究受體的親和力和受體的數(shù)量，以及研究受體亞型的常用方法。原理放射性標(biāo)記配基（激動(dòng)劑或拮抗劑）和組織、細(xì)胞，或含有受體的制劑一起溫育，使受體和配基充分結(jié)合，形成受體-配基復(fù)合物，終止反應(yīng)后，用過濾或離心的方法除去未被結(jié)合的標(biāo)記物，測(cè)定濾膜或沉淀物中的放射性，即可計(jì)算出和配基結(jié)合的受體的量。目前二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)RBA的分類RBA用放射性核素來標(biāo)記配基，與相應(yīng)的受體進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)，可對(duì)受體的性質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析。1、定性RBA：是通過反應(yīng)的量效關(guān)系的變化來判斷受體的類型，單位點(diǎn)或多位點(diǎn)結(jié)合式，及受體與配體結(jié)合的特點(diǎn)，反應(yīng)的可逆性、協(xié)作性等。2、定量RBA：是在已知配體與受體反應(yīng)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過結(jié)合反應(yīng)，給出一定量的組織或細(xì)胞中能與該放射性配體結(jié)合的受體數(shù)及結(jié)合的平衡解離常數(shù)或結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（最大結(jié)合容量）。

目前三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)實(shí)驗(yàn)材料與儀器目前四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物組織（皮層、海馬、紋狀體等）儀器（組織勻漿機(jī)、旋渦混合器、低溫高速離心機(jī)、電熱恒溫水溫箱、-80℃冰箱、制冰機(jī)、抽慮瓶、液閃儀等）材料（2ml/6ml分離管、10ul/200ul/1ml槍頭、微纖維濾紙等）藥品（放射性配基、各種非標(biāo)計(jì)化合物等）目前五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)實(shí)驗(yàn)儀器組織勻漿機(jī)IKA，T10BS25漩渦混合器WH-2目前六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)低溫高速離心機(jī)凱達(dá)，TGL20M超低溫冰箱海爾目前七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)數(shù)顯恒溫水浴鍋金燕，HH-S26S制冰機(jī)GELIN型號(hào)IMS-50automaticiceflakes目前八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)電熱恒溫水溫箱循環(huán)水式多用真空泵液閃測(cè)定計(jì)數(shù)儀HIDEX，425-034型目前九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)實(shí)驗(yàn)材料2ml離心管6ml一次性軟試管目前十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)槍頭1ml10ul200ul目前十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)TrisPPO與POPOP目前十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)過濾裝置砂芯過濾裝置（抽濾瓶）1000mlWhatmanGF/C玻璃微纖維濾紙40mm目前十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)放射性化合物放射性配體低溫保存目前十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)實(shí)驗(yàn)方法流程目前十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)實(shí)驗(yàn)方法流程1、制備受體樣品；2、加樣、溫育進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)；3、終止反應(yīng)，分離結(jié)合物與游離物4、測(cè)定結(jié)合物的放射性；5、數(shù)據(jù)處理。目前十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)實(shí)驗(yàn)具體操作（D1、D2、5-HT）1、配制各種緩沖液及試劑按處方配比配制各種緩沖液貯備液配制各種非標(biāo)記配體溶液配制各種受試藥物溶液注意：該項(xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：分析天平、移液槍、燒杯、量筒、容量瓶、試管、EP管等試劑：無(wú)水乙醇、超純水、Tris、抗血酸、優(yōu)降寧、HCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、DMSO、甲苯、PPO、POPOP、Methysergide、Butaclamol及5HT等目前十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)2、制備膜受體大鼠斷頭取腦分離出目標(biāo)組織加10倍體積（V/W）冰冷的緩沖液用組織勻漿機(jī)勻漿3次，每次數(shù)秒鐘，制成組織勻漿液組織勻漿液用低溫高超離心機(jī)離心（12000轉(zhuǎn)/分）3次，每次20分鐘棄上清液，沉淀（膜受體）放-80度超低溫冰箱保存?zhèn)溆米⒁猓涸擁?xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：手術(shù)器械、組織勻漿機(jī)、制冰機(jī)、超低溫冰箱、低溫高超離心機(jī)試劑：超純水目前十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)3、加樣

取出膜受體，加入一定體積的冰冷的緩沖液，混勻，使成一定濃度的膜受體溶液。取放射性配體母液，用無(wú)水乙醇稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度

按以下順序及比例加入各種反應(yīng)液。（1）總結(jié)合管：100ul膜受體+200ul緩沖液+10ul放射性配體（2）非特異管：100ul膜受體+100ul緩沖液+100ul非標(biāo)記配體+10ul放射性配體（3）受試物管：100ul膜受體+100ul緩沖液+100ul藥物溶液+10ul放射性配體注意：該項(xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：移液槍、燒杯、量筒、EP管等試劑：超純水、無(wú)水乙醇、放射性配體母液

目前十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)4、受體配體結(jié)合反應(yīng)

以上各管在加完放射性配體后，立即放入37度的水浴鍋中，孵育20分鐘。20分鐘后把各管放入冰中終止反應(yīng)。注意：該項(xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：恒溫水浴鍋，制冰機(jī)試劑：無(wú)目前二十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)5、分離游離及結(jié)合的放射性配體上述各管在反應(yīng)結(jié)束后，分別倒入抽濾裝置進(jìn)行過濾，并用5-10ml冰冷的緩沖液沖洗濾膜2次。濾膜放入85度烘箱中烘干，隨后放入測(cè)試管中，關(guān)加入一定體積的閃爍液，浸泡過夜。注意：該項(xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：抽濾器、烘箱、濾紙、移液槍、液閃杯試劑：甲苯、PPO、POPOP目前二十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)6、測(cè)定結(jié)合型放射配體每分鐘放射計(jì)數(shù)采用放射性計(jì)數(shù)儀，測(cè)定各測(cè)試管中結(jié)合型放射配體每分鐘放射計(jì)數(shù)注意：該項(xiàng)操作所需試劑或儀器儀器：液閃儀試劑：無(wú)目前二十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)7、數(shù)據(jù)處理按以下公式計(jì)算各化合物對(duì)同位素配基結(jié)合的抑制率百分率：抑制率(I%)=（總結(jié)合管cpm—化合物cpm）/（總結(jié)合管cpm—非特異結(jié)合管cpm）×100%化合物每次實(shí)驗(yàn)做兩復(fù)管，進(jìn)行兩次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)。目前二十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)8、各種指標(biāo)IC50：半數(shù)抑制濃度KD：平衡解離常數(shù)（mol/L），物理意義為受體有一半結(jié)合配基時(shí)所需要的配基濃度。Bmax：受體最大結(jié)合容量（fmol/mg蛋白質(zhì)）nH：Hill系數(shù)目前二十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)Scatchard方程與作圖

（飽和實(shí)驗(yàn)）目前二十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)Scatchard方程與作圖簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)受體和配體結(jié)合反應(yīng)（Clark模型）條件：（1）配基與受體結(jié)合反應(yīng)為可逆雙分子反應(yīng)；（2）所有受體都是等效和獨(dú)立的，同一受體的不同分子對(duì)配基的親和力都相等，而且不受鄰近受體分子結(jié)合配基與否的影響；（3）配體本身不代謝，也不與其它位置結(jié)合；（4）生物效應(yīng)的強(qiáng)度與濃度近似于總配基濃度。目前二十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)飽和曲線固定的受體數(shù)量，固定數(shù)量的非標(biāo)和不同濃度體積的放射性配體目前二十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)飽和曲線(saturationcurve)1）飽和曲線

受體數(shù)量一定，當(dāng)配體（一般是不同濃度體積的放射性配體與固定數(shù)量的非標(biāo)）的濃度從零開始上升時(shí)，形成的復(fù)合物也逐漸增多。但由于受體數(shù)量有限，又是可逆反應(yīng)，因此[RL]（受體配體復(fù)合物）的增加不是直線上升，而是一條上升先快后慢的曲線，最后絕大部分受體與配體結(jié)合時(shí)，[RL]的增加就非常緩慢，漸趨水平，即受體已經(jīng)飽和了，此即飽和曲線。#飽和曲線的作用？Scatchard作圖，求得KD與Bmax目前二十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)2）曲線的高度取決于[RT]。在曲線起始段，曲線上升的快慢即曲線的斜率取決于配基與受體的親和力，所以，KD越小(親和力越大)，飽和曲線上升越快，KD越大(親和力越小)，飽和曲線上升越慢。（即：親和力越大，受體與配件結(jié)合速度越快，時(shí)間越短）

k1,v1[R]+[L]－－－－[RL]k2,v2KD＝K2/K1=[R][L]/[RL]目前二十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)

飽和曲線的形狀和KD有關(guān)（如圖1）。圖1KD對(duì)飽和曲線的影響

目前三十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)飽和曲線曲線的高度取決于[RT]（如圖2）。

圖2[RT]對(duì)飽和曲線影響目前三十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)質(zhì)量作用定律(Massactionlaw)：受體和配基的結(jié)合反應(yīng)服從可逆反應(yīng)的質(zhì)量作用定律，可用下式表示:

k1,v1[R]+[L]－－－－[RL]（1）k2,v2

上式中，[R]和[L]為游離受體和游離配基的濃度，[RL]為復(fù)合物濃度，v1和v2為結(jié)合速率和解離速率，k1和k2為結(jié)合速率常數(shù)(associationrateconstant)和解離速率常數(shù)(dissociationrateconstant)。

數(shù)學(xué)表達(dá)目前三十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)根據(jù)質(zhì)量作用定律：v1

=k1[R][L]；v2=k2

[RL]當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡后，v1=v2,即:k1[R][L]=k2[RL],則平衡解離常數(shù)（KD）的數(shù)學(xué)表達(dá)式為：KD＝K2/K1=[R][L]/[RL]（2）

目前三十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)Scatchard作圖

設(shè)[LT]為配體的初始濃度，[RT]為受體的初始濃度（即受體總量），則有：[L]=[LT]–[RL][R]=[RT]–[RL]由式（2）整理可得：KD＝[RT-RL][L][RL]

將上式整理可得：

[RL]=[RT]－1_×[RL]（Scatchard方程）[L]KDKD變形：[RL]為受體與配基特異結(jié)合的量，換成[B]表示，[L]為自由配基的量，換成[F]表示，[RT]為受體總量，也即受體最大結(jié)合量，換成[Bmax]表示，則上式方程變?yōu)?B/F=Bmax/KD-B/KD（[RT]為受體總量，等于[R]和[RL]之和，也是最大結(jié)合量Bmax）以復(fù)合物濃度[RL]為橫坐標(biāo)，以復(fù)合物濃度和游離配體的濃度比值[RL]/[L]為縱坐標(biāo)作圖，即為Scatchard作圖。目前三十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)圖3簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)RBA的Scatchard作圖簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)Scatchard作圖為一條直線，斜率為-（1/KD），橫軸截距為[RT]，縱軸截距為[RT]/KD（見圖3）。由此求得KD與Bmax目前三十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)Hill方程與作圖當(dāng)一個(gè)受體分子可以結(jié)合一個(gè)以上的配基時(shí)，配基受體結(jié)合反應(yīng)不是簡(jiǎn)單的雙分子反應(yīng)，而是

k1,v1[R]+n[L]－－－－n[RL]，根據(jù)質(zhì)量作用定律推導(dǎo)出Hill方程：k2,v2經(jīng)過變形得其中n為hill系數(shù)，以結(jié)合分?jǐn)?shù)B/Bmax對(duì)游離配基[L]作圖，得Hill作圖（如右）。（3）目前三十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)將（3）式兩邊取對(duì)數(shù)

目前三十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)非特異性結(jié)合

(non-specificbinding，NSB)

NSB在RBA系統(tǒng)中，放射性配體除與受體特異性結(jié)合外，還可與其他成分（如非特異蛋白、反應(yīng)容器、分離材料等）結(jié)合。NSB的特點(diǎn)

親和力小而結(jié)合容量大，不易被飽和，隨反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)配體濃度增加而線性增大，而且這種結(jié)合與生物效應(yīng)無(wú)關(guān)（見圖4）。目前三十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)圖4飽和曲線實(shí)驗(yàn)中TB、SB和NSB的關(guān)系在RBA的數(shù)據(jù)處理時(shí)，測(cè)得的總結(jié)合的放射性(totalbinding，TB)，必須減去NSB，才能得到特異性結(jié)合(specificbinding，SB)的數(shù)據(jù)。目前三十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)曲線固定的放射性配基濃度，一定量的受體和不同濃度的未標(biāo)記化合物目前四十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)數(shù)學(xué)表達(dá)此實(shí)驗(yàn)用于測(cè)定非標(biāo)計(jì)藥物與放射性配基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一受體的能力。通常用IC50和Ki來表示。目前四十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)閃爍液包括溶劑、閃爍劑和添加劑溶劑：溶解閃爍劑和放射性樣品，吸收和傳遞射線能量。閃爍劑：第一閃爍劑（吸收受激溶劑能量，退激發(fā)光）、第二閃爍劑（波長(zhǎng)轉(zhuǎn)移，匹配光電倍增管光譜；提高淬滅耐受）添加劑：助溶劑、抗淬滅劑目前四十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)各受體的非標(biāo)與同位素受體非標(biāo)放射性配基受體組織5-HT1A5-HT(serotonin)3H-8-OH-DPAT大鼠紋狀體/皮層5-HT2AMethysergide3H-Ketanserin大鼠紋狀體/皮層D2Butaclamol3H-Spiperone大鼠紋狀體α1Prazosin3H-prazosin大鼠皮層α2Rauwolscine3H-Rauwolscine大鼠皮層M阿托品3H-QNB（畢茲）大鼠腦去小腦/回腸β心得舒3H-DHA鴨紅細(xì)胞/大鼠腦目前四十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)RBA的安全問題目前四十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)β射線目前四十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)放射型物質(zhì)發(fā)出的射線有三種：天然放射現(xiàn)象目前四十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)三種射線α射線β射線γ射線目前四十七頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)α射線根據(jù)射線的偏轉(zhuǎn)方向和磁場(chǎng)方向的關(guān)系可以確定，偏轉(zhuǎn)較小的一束由帶正電荷的粒子組成，我們把它叫做α射線，α射線由帶正電的α粒子組成.科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)每個(gè)α粒子帶的正電荷是電子電荷的2倍，α粒子質(zhì)量大約等于氦原子的質(zhì)量.進(jìn)一步研究表明α粒子就是氦原子核.由于α粒子的質(zhì)量較大，所以α射線的穿透本領(lǐng)最小，我們用一張厚紙就能把它擋住.目前四十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)β射線與α射線偏轉(zhuǎn)方向相反的那束射線帶負(fù)電荷，我們把它叫做β射線.研究發(fā)現(xiàn)β射線由帶負(fù)電的粒子（β粒子）組成.進(jìn)一步研究表明β粒子就是電子.β射線的穿透本領(lǐng)較強(qiáng)，很容易穿透黑紙，還能穿透幾厘米厚的鋁板.目前四十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)γ射線中間不發(fā)生偏轉(zhuǎn)的那束射線叫做γ射線，研究表明，γ射線的實(shí)質(zhì)是一種波長(zhǎng)極短的電磁波，它不帶電，是中性的.γ射線的穿透本領(lǐng)極強(qiáng)，一般薄金屬板都擋不住它，它能穿透幾十厘米厚的水泥墻和幾厘米厚的鉛板.目前五十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)β射線在某種核反應(yīng)中，一個(gè)中子變成一個(gè)電子和一個(gè)質(zhì)子.這就是原子核內(nèi)沒有電子，又會(huì)放出電子，這就是產(chǎn)生β射線的原因.β射線是一種帶負(fù)電荷的、高速運(yùn)行、從核素放射性衰變中釋放出的粒子。人類受到來源于人造或自然界(氚，C－14等)β射線的照射，β射線比α射線更具有穿透力，但在穿過同樣距離，其引起的損傷更小。一些β射線能穿透皮膚，引起放射性傷害。但是它一旦進(jìn)入體內(nèi)引起的危害更大。β粒子能被體外衣服消減、阻擋或一張幾毫米厚的鋁箔完全阻擋。目前五十一頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)放射防護(hù)措施目前五十二頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)外照防護(hù)措施時(shí)間防護(hù)：盡量減少受照射時(shí)間。距離防護(hù)：距離越遠(yuǎn)，輻射能量越低。屏蔽防護(hù)：α射線注意防止內(nèi)照射；β射線可用鋁、有機(jī)玻璃、塑料等原子序數(shù)較低的物質(zhì)；γ射線可用鉛、鐵、混凝土等高原子序數(shù)物質(zhì)。目前五十三頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)內(nèi)照射防護(hù)措施圍封隔離防擴(kuò)散：“三區(qū)配置”法，即清潔區(qū)、中間區(qū)、活性區(qū)；通風(fēng)良好、獨(dú)立的下水處理系統(tǒng)；遵守SOP。除污保潔防污染個(gè)人防護(hù)侵入：穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人保護(hù)衣具，如工作服、口罩、鞋、帽等。不準(zhǔn)在工作場(chǎng)所進(jìn)食、吸煙。工作結(jié)束后進(jìn)行衛(wèi)生清洗，并作污染檢測(cè)。目前五十四頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)放射性“三廢”處理基本方法：放置衰變、濃縮儲(chǔ)存、稀釋排放固體：一般用放置法（半衰期短）、焚化法（廢氣的處理）、埋藏法（不可燃/焚化殘?jiān)┮后w：一般用放置法（半衰期短）、稀釋法（量少濃度低）、濃集法（富集掩埋）氣體：大氣排放（低濃度/氣溶膠）、過濾器或液體吸收（高濃度）目前五十五頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)表面放射性污染的處理皮膚：輕度，大量清水和肥皂清洗；嚴(yán)重，10%EDTA或6.5%高錳酸鉀浸泡清洗工作場(chǎng)所表面：輕度，大量清水或洗滌劑清洗；嚴(yán)重，挖去再填充或覆蓋油漆/塑料板工作服：輕度，肥皂水；嚴(yán)重，0.02mol/L鹽酸、1%草酸洗滌或廢物處理儀器及設(shè)備：玻璃與陶瓷，3%鹽酸/10%枸櫞酸浸泡1h后沖洗再用洗液浸泡15min后再清洗；金屬，用肥皂、枸櫞酸鈉、EDTA或其它有機(jī)溶劑或超聲清洗目前五十六頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)例子：M膽堿受體配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)壳拔迨唔?yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)試劑放射配體：[3H]-QNB（比活度：22ci/mmol）非標(biāo)：阿托品0.32mol/L蔗糖溶液0.05mol/LTrisHCl緩沖液pH7.5。生理鹽水甲苯閃爍液

PPO[2,5-Diphenyloxazole【2,5-二甲基惡唑】]2.5g加POPOP[1,4-Bis(5-phenyloxazol-2-yl)benzene【1,4-雙（5-苯基惡唑基-2）苯】]0.05g，溶于500ml甲苯中。目前五十八頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)受體組織的制備中樞：大鼠斷頭取腦，去小腦；20倍0.32mol/L蔗糖制成勻漿；離心，上清液Tris緩沖液懸?。籐owry法測(cè)蛋白。外周腸平滑?。弘嗍笕』啬c，生理鹽水或Tris緩沖液清洗/保存。目前五十九頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)受體配體結(jié)合一、飽和曲線：每個(gè)反應(yīng)管中加入200ul固定濃度的膜蛋白（0.2mg/ml）和50ul不同濃度的[3H]QNB(0.1、0.25、0.5、1.01、2.15、3.0、4.26、5.48nmol/L),在非特異結(jié)合管中另加入終濃度為10-6mol/L的阿托品，補(bǔ)充Tris緩沖液至總體積1ml，其中之一的操作如下目前六十頁(yè)\總數(shù)六十三頁(yè)\編于九點(diǎn)孵育與測(cè)量水溫37℃孵育30min，5ml冰冷的Tris緩沖液終止反應(yīng)；抽慮沖洗游離的[3H]QNB。濾片80℃、30min烘干后置于甲苯閃爍液中，液閃