細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)培訓(xùn)班-講-義

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)培訓(xùn)班-講-義目錄一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的基礎(chǔ)理論-------------3二、BET試驗(yàn)前的準(zhǔn)備------------------------24三、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的實(shí)驗(yàn)技術(shù)-------------281，鱟試劑靈敏度復(fù)核-------------------------332，干擾初篩試驗(yàn)------------------------------403，干擾試驗(yàn)------------------------------------494，檢查法---------------------------------------62四、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測技術(shù)的發(fā)展2007-9-102一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的基礎(chǔ)理論1，細(xì)菌內(nèi)毒素2，鱟試劑3，BET用水4，BET程序5，2005年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法6，相關(guān)參數(shù)的計(jì)算7，試驗(yàn)的相關(guān)知識(shí)2007-9-1031、細(xì)菌內(nèi)毒素

1）化學(xué)成分及特性--革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物--是高分子量脂多糖復(fù)合物（LPS）

除上述性質(zhì)外，LPS還有許多其他的生物活性致熱性耐熱性酸堿性與鱟試劑反應(yīng)分子極性需要在250攝氏度干熱至少30~60分鐘才能徹底滅活多糖鏈有親水性，脂肪鏈具有疏水性，在水中呈不均勻分布內(nèi)毒素作用于人體細(xì)胞，使之釋放內(nèi)原性熱原，

再刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱反應(yīng)與鱟試劑發(fā)生多級(jí)酶促反應(yīng)，形成凝膠與強(qiáng)酸強(qiáng)堿水解反應(yīng)（1）特性2007-9-104內(nèi)毒素的分子結(jié)構(gòu)（2）化學(xué)結(jié)構(gòu)--含有3個(gè)截然不同的區(qū)域◆O-特異側(cè)鏈◆核心多糖◆類脂A2007-9-1052）內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系

--內(nèi)毒素是熱原之一種

--醫(yī)藥工業(yè)接受的觀點(diǎn)是，內(nèi)毒素是目前醫(yī)藥工業(yè)中最普遍和最主要的外源性熱原，控制內(nèi)毒素污染就等于控制熱原污染。3）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素和環(huán)境內(nèi)毒素

1）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素

經(jīng)人工提取精制并經(jīng)生物效價(jià)測定的細(xì)菌內(nèi)毒素，作為BET檢查的參考品或?qū)φ掌贰Ｖ饕謪⒖紭?biāo)準(zhǔn)品（RSE）及工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）。CSE的效價(jià)必須用RSE來標(biāo)化。目前CSE的效價(jià)有兩種標(biāo)示方法：固定效價(jià)法（中國）及浮動(dòng)效價(jià)法（國際）。

2）環(huán)境內(nèi)毒素

天然產(chǎn)生的內(nèi)毒素，普遍存在于水、空氣及各種原料中，成分除了脂多糖外還含有較多的蛋白質(zhì)、多糖和其他雜質(zhì)，其極性不明顯，致熱性較標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素弱。BET的對象是環(huán)境內(nèi)毒素。2007-9-1064）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液（C溶液）的制備

1）中國藥典2005年版的BET法規(guī)定，將細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解后，需在旋渦混合器上混勻15分鐘，以后每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘，其他國家藥典都有類似要求 --具有極性的內(nèi)毒素分子在水中呈現(xiàn)不均勻分布

2007-9-1072、鱟試劑1）鱟試劑的分類--根據(jù)鱟的種類分類美洲鱟試劑(LAL)中國鱟試劑或東方鱟試劑（TAL）--根據(jù)檢查方法分類凝膠法鱟試劑光度法鱟試劑--根據(jù)鱟試劑的反應(yīng)特異性分類普通鱟試劑特異型鱟試劑2007-9-1082）鱟試劑的規(guī)格--一般分單次試驗(yàn)試劑和多次試驗(yàn)試劑（也稱大裝量試劑）--把自身的包裝容器作為反應(yīng)管的試劑稱為單次試驗(yàn)試劑，在國內(nèi)使用的0.1ml/支的鱟試劑就屬于單次試驗(yàn)試劑--多次試驗(yàn)試劑有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用時(shí)應(yīng)先用相應(yīng)量的溶解液復(fù)溶鱟試劑。2007-9-1093）鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

--靈敏度定義：再細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定的條件下，能使鱟試劑產(chǎn)生凝集的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的最低濃度，單位EU/ml。常用鱟試劑的靈敏度：0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml--自身凝集部頒標(biāo)準(zhǔn)，鱟試劑的陰性對照在37度4小時(shí)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)--緩沖能力--干燥失重--無菌：中國標(biāo)準(zhǔn)無此項(xiàng)要求2007-9-10104）鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理

C因子活化的C因子內(nèi)毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白原β葡聚糖或LAL-RM活化的G因子G因子二價(jià)陽離子AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物）AC-lle-Glu-Ala-Arg-OHpNA405nm測吸光度值（對硝基苯胺黃色）2007-9-10113、BET用水2000年版藥典要求，BET用水應(yīng)為與0.03EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時(shí)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。2005年版藥典要求，凝膠法BET用水應(yīng)為內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水；光度測定法用的BET用水內(nèi)毒素含量應(yīng)少于0.005EU/ml。美國藥典要求的BET用水是指與所使用的鱟試劑不發(fā)生反應(yīng)的滅菌注射用水或其他水。2007-9-10124、BET程序1）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)z法光度測定法2）檢查法凝膠法光度測定法

動(dòng)態(tài)法

終點(diǎn)法：終點(diǎn)比色法試驗(yàn)靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)干擾試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)干擾試驗(yàn)?zāi)z限量試驗(yàn)?zāi)z半定量試驗(yàn)動(dòng)態(tài)比濁法試驗(yàn)動(dòng)態(tài)比色法試驗(yàn)動(dòng)態(tài)終點(diǎn)法2007-9-10135、《中國藥典》2005年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法1）綜述部分細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的定義及BET方法學(xué)分類內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品及檢查用水BET器具的要求供試品溶液的要求內(nèi)毒素限值的確定最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算2007-9-1014

2）試驗(yàn)部分（1）凝膠法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)干擾試驗(yàn)檢查法（2）光度測定法標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)干擾試驗(yàn)檢查法3）2005年版藥典BET法際驗(yàn)部分主要內(nèi)容凝膠限量試驗(yàn)?zāi)z半定量試驗(yàn)2007-9-1015鱟試驗(yàn)方法凝膠法光度測定法限量法半定量法動(dòng)態(tài)法終點(diǎn)法動(dòng)態(tài)

濁度法動(dòng)態(tài)顯色法終點(diǎn)濁度法終點(diǎn)

顯色法靈敏度以標(biāo)示靈敏度表示以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度表示預(yù)試驗(yàn)1靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

各濃度平行4管,NC2管標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證試驗(yàn)

各濃度平行3管，NC2管有效條件①D陰性

②0.5≤c≤2①|(zhì)|≥0.980

②TD＞TC（對動(dòng)態(tài)法而言）預(yù)試驗(yàn)2干擾試驗(yàn)干擾試驗(yàn)無干擾條件①A、D陰性

②0.5≤Es≤2

0.5Es≤Et≤2Es①|(zhì)|≥0.980

②50%≤R≤200%

③TD＞TC檢查法A、B、C、D各平行2管(共8管)A、B、C、D各平行2管(共12管)有效條件①B、C陽性

②D陰性①|(zhì)|≥0.980

②50%≤R≤200%

③TD＞TC2007-9-10161）內(nèi)毒素限值

（1）藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：L=K/ML為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg(活性單位)表示；K為人每公斤體重每小時(shí)科接受的最大內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5EU/(kg·h),放射性藥品注射劑K=2EU/(kg·h),鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kg·h),M為人每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)、U/(kg·h)表示，人均體重按60Kg計(jì)算，注射試劑若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。6、相關(guān)參數(shù)的計(jì)算2007-9-1017（2）內(nèi)毒素限值計(jì)算舉例--注射用的頭孢曲松鈉舒巴坦鈉，成人最大劑量為1500mg/次L==0.20EU/mg--注射用人頭孢孟多酯鈉，成人每日劑量為2.0至8.0g，分3至4次給藥，一日最高劑量不超過12gL==0.075EU/mg--對于大輸液（LVP）,美國藥典（USP）通常都取L值為0.5EU/ml

5EU/(kg·h)1500mg/(60kg·h)5EU/(kg·h)(12000mg/3)/(60kg·h)2007-9-10182）最大有效稀釋倍數(shù)--供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）按以下公式計(jì)算MVD=CL/λC為供試品溶液的濃度，其中當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C為1.0ml/ml;當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí),C的單位為mg/ml或U/ml。凝膠發(fā)中，λ為鱟試劑的靈敏度光度測定法中，λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度--如使用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，注射用頭孢曲松鈉舒巴鈉（濃度為10mg/ml,L=0.2EU/mg）的最大有效稀釋倍數(shù)為MVD==8(倍)10mg/mlx0.2EU/mg0.25EU/ml2007-9-10193）最低有效稀釋濃度(MVC)--MVC=λ/L--如使用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，注射用頭孢曲松鈉舒巴鈉的最低有效濃度為MVC==1.25mg/ml4)樣品稀釋過程中加液量的計(jì)算--稀釋過程中，假設(shè)從溶液S1取（x）ml溶液稀釋（n）倍至S2，加液量為（y）,則滿足：y=(n-1)Xx--如從溶液S1取0.5ml稀釋3.8倍至S2,則加液量為：y=(3.8-1)X0.5=1.4ml即0.5ml的S1加1.4ml稀釋液即得S1的3.8倍稀釋液S20.20EU/mg0.25EU/ml2007-9-10207、試驗(yàn)相關(guān)知識(shí)1)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的使用（1）復(fù)溶--復(fù)溶2ml安瓿裝的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，為了避免溶液再混合時(shí)溢出安瓿，我們建議在安瓿頸部上方開口加液。復(fù)溶液的體積一般為1ml,或根據(jù)使用說明書加液。（2）效價(jià)--廠家必須向用戶提供一份效價(jià)分析證書（CertificateofAnalysis,CoA）效價(jià)分析證書應(yīng)注明：RSE/CSE____EU/mg;_____ng/瓶2007-9-10212)鱟試劑的使用--使用前，應(yīng)將鱟試劑置于室溫環(huán)境下使其大道室溫溫度鱟再復(fù)溶使用--復(fù)溶鱟試劑鱟，應(yīng)避免強(qiáng)烈振動(dòng)產(chǎn)生泡沫--由于鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的不可逆性，反應(yīng)過程中必須避免反應(yīng)試管的振動(dòng)造成假陽性3）內(nèi)毒素的清除（1）沖洗適用于器械組件、塞子等可用于加熱等方法提高清除效率（2）蒸餾，折流系統(tǒng)和地心引力阻止大分子量的LPS轉(zhuǎn)變?yōu)檎羝麪顟B(tài)逸出（3）反滲透（4）超濾（5）活性炭吸附2007-9-10224）內(nèi)毒素的滅活（1）酸/堿水解（2）氧化--H2O2（3）干熱

--250℃，>30分鐘的干烤2007-9-1023二、BET試驗(yàn)前的準(zhǔn)備1.在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)中，凡是與試驗(yàn)樣品或試劑接觸的器具必須經(jīng)過除熱原處理。玻璃器皿一般用洗液浸泡4小時(shí)后，用自來水沖洗，再用真餾水沖洗、晾干。最后在280℃干烤至少120分鐘。2007-9-10242.試驗(yàn)所試用的器具主要包括有：無熱原稀釋管無熱原玻璃移液管無熱原玻璃毛細(xì)管稀釋試管架安瓿試管架反應(yīng)試管架可調(diào)移液器連接膠粒無熱原吸頭安瓿開啟器70%的異丙醇浸泡的無紡布拭布2007-9-10253.實(shí)驗(yàn)中也可用一次性的無熱原塑料器械。如用可調(diào)移液器和無熱原吸頭代替無熱院玻璃移液管取液等。在使用可調(diào)移液器連接無熱原毛細(xì)管吸取微量溶液時(shí)，采用多吸少打方式。避免由于毛細(xì)管的虹吸作用帶來的加樣誤差；也可避免微量加樣時(shí)產(chǎn)生氣泡。2007-9-10264.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)的恒溫反應(yīng)在37℃的恒溫器中進(jìn)行。TAL-40型試管恒溫儀（安度斯設(shè)計(jì)生產(chǎn)），專門用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的恒溫儀器。具有A,溫度穩(wěn)定；B,加熱均勻；C,定時(shí)報(bào)警等特點(diǎn)2007-9-1027三、凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)1，凝膠法BET試驗(yàn)程序2，試驗(yàn)器具3，鱟試劑靈敏度復(fù)核4，干擾初篩試驗(yàn)5，干擾試驗(yàn)6，檢查法2007-9-10281、凝膠法BET的實(shí)驗(yàn)程序1）試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及實(shí)驗(yàn)用具等2）確定供試品的內(nèi)毒素限值（L）3）選擇鱟試劑（λ）4）計(jì)算供試品的最大有效稀釋（MVD）或最低有效濃度（MVC）5）鱟試劑靈敏度復(fù)核6）供試品干擾初篩試驗(yàn)（建議試驗(yàn)）7）供試品干擾驗(yàn)證試驗(yàn)8）供試品日常檢查2007-9-10292、試驗(yàn)器具1）器具的要求及處理

--玻璃器皿需除熱原處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用方法是玻璃器皿經(jīng)清洗后>250℃至少干烤1小時(shí)--塑料器械應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗(yàn)無干擾的器械--首選硼硅酸鹽玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具2）孵育反應(yīng)儀器溫度精確：37±0.2℃發(fā)熱均勻：<0.1℃可定時(shí)提示：0至90分鐘可設(shè)定定時(shí)蜂鳴提示試管免封口2007-9-10303、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)1）鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室的條件是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求

2）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)人員的操作技能是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求3）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用試劑（包括鱟試劑、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、BET用水等）是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求2）鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)的步驟

1）恒溫儀器預(yù)熱

2）C溶液（標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液）的制備

3）鱟試劑制備

4）加樣及恒溫反應(yīng)

5）結(jié)果判斷

6）數(shù)據(jù)處理2007-9-1031稀釋為2λ、λ、0.5λ、0.25λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液C溶液反應(yīng)：0.1mlTAL＋0.1mlCSE(RSE)，平行4管D溶液反應(yīng)：0.1mlTAL＋0.1mlBET水，平行2管單次管：原安瓿多次管：反應(yīng)試管輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁搖勻每步稀釋于旋渦混合器混合30s旋渦混合器混合15min混勻混合BET水復(fù)溶BET水復(fù)溶RSE或CSE鱟試劑TAL37℃±1℃，60min±2min混勻（水浴恒溫需封口）3）操作步驟示意圖2007-9-10324）靈敏度復(fù)核試驗(yàn)舉例(1)試劑試劑名稱廠家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支

0.25EU/ml18內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE安度斯10ng/瓶10EU/ng1BET水

安度斯50ml/瓶

＜0.003EU/ml12007-9-1033（2）實(shí)驗(yàn)前，將恒溫儀器預(yù)熱至37℃（3）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液（C溶液）的制備0.25EU/ml30s30s1EU/ml30s5min2.0ml100EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml2.0ml3.6ml2.0ml2.0ml0.125EU/ml30s2.0ml2.0ml0.06EU/ml30s2.0ml2.0ml2007-9-1034（4）鱟試劑的準(zhǔn)備

取0.1ml裝量，靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑18支，在安瓿頸部折斷，按照陰性對照溶液D兩支，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液每濃度平行4管排列：

用精確移液器準(zhǔn)確吸取0.1mlBET水分別加入每支鱟試劑中，使鱟試劑全部溶解0.5U/ml陰性對照溶液D0.25EU/ml0.125EU/ml2007-9-1035CSETAL0.1ml0.5EU/ml0.1ml0.1ml0.25EU/ml0.1ml0.1ml0.125EU/ml0.1ml0.1ml0.06EU/ml0.1ml0.1mlNC0.1ml（5）加樣用精確移液器分別吸取0.1ml的0.06EU/ml、0.125EU/ml、0.25EU/ml、0.5EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，加入已復(fù)溶的鱟試劑中，每平行4管，吸取0.1mlBET用水（D溶液）加入另外兩支鱟試劑內(nèi)，作為陰性對照。加樣順序一般從低濃度到高濃度2007-9-1036（6）恒溫反應(yīng)

---將加樣完的混合液輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡），放入37±1℃的恒溫器中孵育60±2分鐘（孵育過程中避免振動(dòng)影響凝膠形成）

---若保溫裝置是水浴恒溫箱，那么在加樣后需將反應(yīng)管封口，避免水蒸氣進(jìn)入反應(yīng)管內(nèi)造成污染。的混合液需封口后再將其放入水浴中恒溫反應(yīng)2007-9-1037（6）結(jié)果判斷

將反應(yīng)試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180℃，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性，記錄為“＋”；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為“-”。＋＋＋＋－－－－陽性陰性結(jié)果判斷：反應(yīng)管緩緩倒轉(zhuǎn)180o陽性(+)：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性(-)：凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者實(shí)驗(yàn)符合要求的基本條件：

NC管全部陰性（－－） 2λ管全部陽性（＋＋＋＋）0.25λ管全部陰性（－－－－）2007-9-1038（7）數(shù)據(jù)處理λc =lg-1（ΣX/4） =lg-1{[(－0.903)＋(－0.602)＋(－0.602)＋(－0.602)]/4} =0.210EU/ml即在本批號(hào)鱟試劑的復(fù)核靈敏度（λc）為0.21EU/ml藥典要求：λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2λ）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度值。結(jié)論：本批TAL的靈敏度標(biāo)示值符合規(guī)定，按標(biāo)示值使用!

平行管C溶液(EU/ml)D溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度X（lg反應(yīng)終點(diǎn)濃度）0.50.250.1250.061＋＋＋－－0.125－0.9032＋＋－－－0.25－0.6023＋＋－－－0.25－0.6024＋＋－－－0.25－0.6022007-9-10394、干擾初篩試驗(yàn)1）目的及原理：--本試驗(yàn)是藥品與鱟試劑相容性的篩選試驗(yàn)，通過對一系列含2λ內(nèi)毒素濃度的樣品溶液與鱟試劑的反應(yīng)，初步篩選出對鱟試驗(yàn)無干擾的濃度。

--本試驗(yàn)可減少干擾試驗(yàn)的盲目性2）試驗(yàn)步驟①供試品限值的確定②供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定③試劑的選擇④反應(yīng)溶液的制備⑤加樣及反應(yīng)⑥結(jié)果判斷2007-9-1040

（1）供試品限值---硫酸慶大霉素，100ml/瓶，20000U/ml；---藥典要求，硫酸慶大霉素限值L=0.5EU/1000U（2）最大有效稀釋倍數(shù)的確定---最大有效稀釋倍數(shù)MVD=cL/λ；---使用λ=0.5EU/ml靈敏度的鱟試劑時(shí)，MVD0.5=———————————=20倍

---由此可計(jì)算出使用不同λ時(shí)所對應(yīng)的MVD:3)干擾初篩試驗(yàn)舉例20000U/mlx0.5EU/1000U0.5EU/ml2007-9-1041

靈敏度（EU/ml）0.50.250.1250.060.03對應(yīng)的MVD(倍)204080160320

---由此可計(jì)算出使用不同λ時(shí)所對應(yīng)的MVD:（3）試劑試劑名稱廠家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支

0.25EU/ml24內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE安度斯10ng/瓶10EU/ng1BET水

安度斯50ml/瓶

＜0.003EU/ml12007-9-1042

（4）各反應(yīng)溶液的制備

溶液編號(hào)AD溶液內(nèi)容S20S40S80S160S320W平行管溶液編號(hào)BC溶液內(nèi)容S20E2S40E2S80E2S160E2S320E2E2平行管2007-9-1043溶液C的制備E100E10E1E0.5溶液A的制備S原液S10S20S40S80

S160S3203.6mlW3.6mlW0.5ml0.4ml0.5mlW3.6mlW0.4ml1.4ml0.4ml1.4ml1.4ml1ml1.4ml1.4mlW1mlW1.4mlW1.4mlW1.4mlW溶液C:E2溶液A2007-9-1044溶液B的制備E1E1E1S20E0.5S40E0.5S80E0.5

S10S20S40

E1E1S160E0.5S320E0.5S80S160注意事項(xiàng)：制備溶液C和B時(shí)，每一步的混合液需在旋渦混合器上混合至少30秒

0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml2007-9-1045

（5）加樣及反應(yīng)

用移液器準(zhǔn)確吸取0.1mlBET水將鱟試劑復(fù)溶

取0.1ml相應(yīng)溶液C、B、A加入鱟試劑反應(yīng)管，每濃度平行2管

另外取0.1mlBET水作為陰性對照溶液D加入鱟試劑反應(yīng)管2007-9-1046

（4）結(jié)果判斷

溶液編號(hào)AD溶液內(nèi)容S20S40S80S160S320W平行管溶液編號(hào)BC溶液內(nèi)容S20E2S40E2S80E2S160E2S320E2E2平行管--++--------++++++--++--2007-9-1047--當(dāng)溶液A、D均為陰性；溶液C均為陽性時(shí)，試驗(yàn)有效。--溶液B系列中，第一個(gè)出現(xiàn)陽性結(jié)果的濃度即初步將其判斷為樣品的無干擾濃度。本試驗(yàn)中的樣品無干擾濃度為≤S402007-9-1048

5、干擾試驗(yàn)--通過比較鱟試劑與內(nèi)毒素在水溶液和供試品溶液中反應(yīng)的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對BET檢查有干擾。--至少對3批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

1）試驗(yàn)步驟：

--供試品限值的確定。--鱟試劑的選擇--最大有效稀釋倍數(shù)的確定--反應(yīng)溶液的制備--加樣及反應(yīng)--結(jié)果判斷2007-9-1049何種情況下要做干擾試驗(yàn)？

——干擾試驗(yàn)是一個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)新品種建立BET方法鱟試劑的來源改變鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變供試品的來源改變供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了其它任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化2007-9-1050

（1）供試品限值

--硫酸慶大霉素，20000U/ml；藥典要求內(nèi)毒素限值L=0.5EU/1000U（2）試劑選擇試劑名稱廠家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支

0.125EU/ml36內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE安度斯10ng/瓶10EU/ng（CoA）1BET水

安度斯25ml/瓶

＜0.003EU/ml12007-9-1051

--根據(jù)干擾初篩試驗(yàn)的結(jié)果，供試品在40倍稀釋（對應(yīng)鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml）時(shí)無干擾。--一般不選擇第一個(gè)出現(xiàn)陽性結(jié)果的供試品濃度作干擾試驗(yàn)。本試驗(yàn)我們選擇靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進(jìn)行干擾驗(yàn)證試驗(yàn)。（3）最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算MVD=cL/λ=80（倍）MVD＝----------------------------------=80(倍)

20000U/mlX0.5EU/1000U0.125EU/ml2007-9-1052

（4）各反應(yīng)溶液的制備

溶液編號(hào)BA溶液內(nèi)容S80E0.25S80E0.125S80E0.06S80E0.03S80平行管溶液編號(hào)CD溶液內(nèi)容E0.25E0.125E0.06E0.03

w平行管2007-9-1053溶液C的制備0.25EU/ml30s30s1EU/ml30s5min1.8ml100EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml1.8ml3.6ml1.8ml1.8ml0.125EU/ml30s1.8ml1.8ml0.06EU/ml30s1.8ml1.8ml2007-9-1054溶液A的制備（供試品的稀釋）硫酸慶大霉素注射液0.3ml20000U/ml0.6ml1.0mlBET水3.0ml2.7ml1:101:400.6ml1:80S10S40S802007-9-1055溶液B的制備E0.5E0.25S80E0.25S80E0.125S40S40

E0.125E0.0625S80E0.0625S80E0.03125S40S40

0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml2007-9-1056

（5）加樣及反應(yīng)

S80E0.25（S80E2λ）0.25EU/ml（2λ）0.125EU/ml（λ）0.06EU/ml（1/2λ）BET水0.03EU/ml（1/4λ）S80E0.125（S80Eλ）S80E0.06（S80E1/2λ）S80E0.03（S80E1/4λ）S802007-9-1057

--36支鱟試劑，先用0.1mlBET復(fù)溶，再加相應(yīng)的溶液0.1ml

--37±1℃反應(yīng)60±2分鐘（6）結(jié)果判斷2007-9-1058反應(yīng)結(jié)果

溶液編號(hào)BA溶液內(nèi)容S80E0.25S80E0.125S80E0.06S80E0.03S80平行管溶液編號(hào)CD溶液內(nèi)容E0.25E0.125E0.06E0.03

w平行管+++++-+--+-+++----+++++++-----------2007-9-1059結(jié)果計(jì)算及判斷Es=lg-1（∑Xs/4）=lg-1——————=0.125EU/mlEt=lg-1（∑Xt/4）=lg-1————————=0.104EU/mlEs、Et分別為系列C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值。Xs、Xt分別為系列C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg）。(lg0.125)x44(lg0.06)+(lg0.125)x442007-9-1060結(jié)論：使用靈敏度λ=0.125EU/ml的鱟試劑對樣品（S）的80倍稀釋液（S80）作BET，無干擾。當(dāng)溶液A和溶液D（陰性對照）的所有平行管都為陰性，且0.5λ≤Es≤2λ時(shí)，試驗(yàn)有效。當(dāng)0.5Es≤Et≤2.0Es時(shí)，供試品在該濃度下對檢查無干擾。本試驗(yàn)：①0.5λ=0.06，2λ=0.25

Es=0.125，0.5λ≤Es≤2λ，有效②0.5Es=0.06，2Es=0.25Et=0.104，0.5Es≤Et≤2.0Es，無干擾藥典規(guī)定：2007-9-10616、檢查法

1）凝膠法限量試驗(yàn)（1）反應(yīng)設(shè)置：

溶液編號(hào)ABCD溶液內(nèi)容SSE2λE2λW平行管2007-9-1062

（2）試劑選擇試劑名稱廠家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支

0.125EU/ml8內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE安度斯10ng/瓶10EU/ng1BET水

安度斯25ml/瓶

＜0.003EU/ml1硫酸慶大霉素(S)---------100ml/支

20000U/ml1--根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，供試品在80倍稀釋，使用鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml條件下，對BET無干擾--本試驗(yàn)選擇TAL靈敏度為0.125EU/ml,供試品稀釋80倍檢查2007-9-1063溶液C的制備E100E10E1E0.5E0.25溶液A的制備S原液S10S40S80溶液B的制備

2.7mlW3.6mlW1.6ml0.4ml1.6mlW3.6mlW0.4ml0.6ml0.3ml0.6ml1.8mlW0.6mlW溶液C溶液A0.6ml0.6mlwE0.5S40S80E0.250.6ml0.6ml溶液B(3)各反應(yīng)溶液制備2007-9-1064反應(yīng)項(xiàng)目每管加樣內(nèi)容管數(shù)A0.1mlTAL+0.1mlA溶液B0.1mlTAL+0.1mlB溶液C0.1mlTAL+0.1mlC溶液D0.1mlTAL+0.1mlBET水（4）加樣及反應(yīng)試管封口混合孵育（37℃/60±2分鐘）8支鱟試劑，先加0.1mlBET水復(fù)溶，再加入相應(yīng)溶液（如圖）2007-9-1065溶液編號(hào)內(nèi)容A（S80）B（S80E0.25）C（E0.25）DW合格－－＋＋＋＋－－不合格＋＋＋＋＋＋－－需復(fù)檢＋－＋＋＋＋－－復(fù)檢合格－－－－＋＋＋＋－－復(fù)檢不合格＋－－－＋＋＋＋－－試驗(yàn)無效＋＋試驗(yàn)無效－－試驗(yàn)無效－－(5)結(jié)果判斷2007-9-1066舉例：注射用頭孢拉定的內(nèi)毒素日常檢查試劑名稱廠家劑型復(fù)溶體積或裝量標(biāo)示靈敏度()或效價(jià)數(shù)量

（支）TAL安度斯凍干品0.5ml/支0.125EU/ml3CSE中檢所凍干品1.0ml/支20EU/支1BET水安度斯5ml/支注射用頭孢拉定注射用無菌粉末0.5g/支12007-9-10671）參數(shù)確定:

①供試品的內(nèi)毒素限值L：《中國藥典》上規(guī)定注射用頭孢拉定的內(nèi)毒素限值L為0.2EU/mg。②鱟試劑靈敏度的選擇根據(jù)干擾試驗(yàn)的結(jié)果，可選擇靈敏度為0.125EU/ml的TAL對注射用頭孢拉定按最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)進(jìn)行日常檢查。

③MVD計(jì)算:加5mlBET水溶解一支供試品,得濃度C=100mg/ml的供試液。2007-9-10682）制備供試液:①供試品溶液（A）的制備0.4ml100mg/ml頭孢拉定5.0mlBET水1:801:100.5ml3.6ml3.5ml1.0ml1.0ml1:1602007-9-1069②內(nèi)毒素溶液（C）的制備0.25EU/ml30s30s15min20EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml2.0EU/ml0.5EU/ml1.0ml1.0ml3.0ml1.0ml3.6mlE0.5E0.252007-9-1070③含2λ內(nèi)毒素的供試液（B）的制備1:160（0.625mg/ml）2λCSE（0.25EU/ml）E0.51.0ml注射用頭孢拉定稀釋液1.0ml1:802007-9-1071④加樣反應(yīng)反應(yīng)項(xiàng)目每管加樣內(nèi)容管數(shù)A0.1mlTAL+0.1mlA溶液B0.1mlTAL+0.1mlB溶液C0.1mlTAL+0.1mlC溶液D0.1mlTAL+0.1mlBET水試管封口混合孵育（37℃/60±2分鐘）2007-9-10722.凝膠法半定量試驗(yàn)

——應(yīng)用舉例2007-9-10731.供試品及試劑1.1供試品(S):葡萄糖氯化鈉注射液，

內(nèi)毒素限值L=0.5EU/mL1.2TAL：λ=0.06EU/mL1.3CSE1.4檢查用水（W）2007-9-10742.凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備

編號(hào)內(nèi)毒素濃度/加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水1

2

4

8——

——

——

——2

2

2

2B2λ/供試品