溶血性鏈球菌的檢驗

溶血性鏈球菌的檢驗溶血性鏈球菌在自然界分布較廣，可存在于水、空氣、塵埃、牛奶、糞便及人的咽喉和病灶中，按其在血平板上溶血能力分類，可分為甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、丙型溶血性鏈球菌和亞甲型溶血性鏈球菌。與人類疾病有關(guān)的大多屬于乙型溶血性鏈球菌，其血清型90%屬于A族鏈球菌，?？梢鹌つw和皮下組織的化膿性炎癥及呼吸道感染，還可通過食品引起猩紅熱、流行性咽炎的爆發(fā)性流行。因此，檢查食品是否有溶血性鏈球菌具有現(xiàn)實意義。（一）形態(tài)與染色：

1、呈球形或卵圓形，直徑0.5μm-1μm鏈狀排列（長短不一）2、革蘭氏染色陽性，衰老培養(yǎng)物常成陰性3、無芽孢、無鞭毛、多數(shù)無莢膜。1、多數(shù)為需氧或兼性厭氧，少數(shù)為微需氧或?qū)Ｐ詤捬?、對營養(yǎng)要求高，普通培養(yǎng)基不能良好生長，（需加血清液、腹水等）3、最適溫度37℃，pH7.4-7.64、幼齡菌大多可見到透明質(zhì)酸形成的莢膜，如延長培養(yǎng)時間，莢膜可被細菌自身產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶分解而消失。5、無芽胞，無鞭毛，有菌毛樣結(jié)構(gòu)，含M蛋白，革蘭氏染色陽性。（二）培養(yǎng)特性6、在液體培養(yǎng)基中，溶血菌株，呈絮狀或顆粒狀沉淀生長（上清下濁）；不溶血菌球，均勻渾濁生長，如糞鏈菌。7、在血平板上，形成灰白色，半透明、表面光滑、有乳光圓形突起的細小菌落，直徑0.5-0.75mm，針尖大小，菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)。8、鏈激酶：αβγδ四種溶血。(三)生化特性1、均分解葡萄糖產(chǎn)酸，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。2、對乳糖、甘露醇、水楊苷等的分解因菌株而異。3、能使牛奶產(chǎn)酸而不凝固，不液化明膠4、A群菌對桿菌肽敏感5、一般不分解菊糖，不被膽汁或1%去氧膽酸鈉所溶解。這兩種特性用來鑒定甲型溶血型鏈球菌和肺炎球菌。6、鏈球菌與葡萄球菌不同，不產(chǎn)生過氧化氫酶。（四）致病性鏈球菌可產(chǎn)生的毒素和酶1、溶血素2、致熱外毒素3、透明質(zhì)酸酶4、鏈激酶5、脂磷壁酸6、鏈道酶7、殺白細胞素1、鏈球菌溶血素：有溶解紅細胞，殺死白細胞及毒害心臟的作用，主要有“O”和“S”兩種。對氧敏感鏈球菌溶血素O，為含-SH基的蛋白質(zhì)，對氧敏感，遇氧時一SH基即被氧化為-SS-基，暫時失去溶血能力。若加入0.5%亞硫酶鈉和半胱氨酸等還原劑，又可恢復溶血能力。溶血素O能破壞白細胞和血小板。動物試驗又證實對心臟有急性毒害作用，使心臟驟停?？乖詮姡腥竞?～3周，85%以上病上產(chǎn)生抗“O”抗體，病愈后可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，可作為新近鏈球菌感染，或可能風濕活動的輔助診斷。對氧穩(wěn)定鏈球菌溶血素“S”，是一種小分子的糖肽，無抗原性。對氧穩(wěn)定，對熱和酸敏感。血平板所見透明溶血是由“S”所引起，能破壞白細胞和血小板，給動物靜注可迅速致死。注射小鼠腹腔，引起腎小管壞死。2、致熱外毒素曾稱紅疹毒素或猩紅熱毒素，是人類猩紅熱的主要毒性物質(zhì)，會引起局部或全身紅疹、發(fā)熱、疼痛、惡心、嘔吐、周身不適。該毒素是蛋白質(zhì)，對熱穩(wěn)定，具有抗原性，則產(chǎn)生的毒素能中和該毒素的活性。但可分為A、B、C三種不同抗原性的毒素。無交叉保護作用。該毒素還有內(nèi)毒素樣的致熱作用，對細胞或組織有損害作用。3、透明質(zhì)酸酶：又稱擴散因子，能分解細胞間質(zhì)的透明質(zhì)酸，故能增加細菌的侵襲力，使病菌易在組織中擴散。4、鏈激酶：又稱鏈球菌纖維蛋白溶酶，能使血液中纖維蛋白酶原變成纖維蛋白酶，具有增強細菌在組織中的擴散作用，該酶耐熱，100℃50分鐘仍可保持活性。5、脂磷壁酸（LTA）：與細菌粘附于宿主細胞表面有關(guān)，大多數(shù)LAT位于細胞膜和肽聚糖之間，通過肽聚糖孔伸展至細菌細胞表面，人類口腔粘膜和皮膚上皮細胞、血細胞等細胞膜上均有LAT的結(jié)合位點。6、鏈道酶：又稱鏈球菌DNA酶，能使膿液稀薄，促進病菌擴散。主要由A、C、G族鏈球菌產(chǎn)生。此酶能分解粘稠膿液中具有高度粘性的DNA，使膿汁稀薄易于擴散。產(chǎn)生的相應抗體有中和該酶的活性。用鏈激酶、鏈道酶制劑進行皮膚試驗作為測定機體細胞免疫的一種方法。7、殺白細胞素（M蛋白）是鏈球菌細胞壁中的蛋白質(zhì)組份，具有抗吞噬和抗吞噬細胞內(nèi)的殺菌作用。純化的M蛋白能使纖維蛋白原沉淀，凝集血小板，白細胞，溶解多形核細胞，并抑制毛細血管中的細胞的移動。M蛋白有抗原性，刺激機體產(chǎn)生型特異性抗體，并與變態(tài)反應疾病有關(guān)。（五）抗原結(jié)構(gòu)鏈球菌的抗原構(gòu)造較復雜，主要有三種：（1）核蛋白抗原或稱P抗原，無特異性，各種鏈球菌均相同，與葡萄球菌有交叉。（2）多糖抗原或稱C抗原，系群特異性抗原，是細胞壁的多糖組分，可用稀鹽酸等提取。（3）蛋白質(zhì)抗原或稱表面抗原，具有型特異性，位于C抗原外層，其中可分為M、T、R、S四種不同性質(zhì)的抗原成分，與致病性有關(guān)的是M抗原。（六）鏈球菌分類1、按溶血能力分類：（1）甲型（α）溶血性鏈球菌菌落周圍有1～2mm寬的草綠溶血環(huán)；此類鏈球菌為條件致病菌。（2）乙型（β）溶血性鏈球菌菌落周圍形成一個2～4mm寬，界限分明、完全透明的溶血環(huán)，完全溶血；這類細菌又稱溶血性鏈球菌(Streptoccushemolyticus)，致病力強，引起多種疾病。（3）丙型（γ）鏈球菌不產(chǎn)生溶血素，菌落周圍無溶血環(huán)；一般不致病。2．根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)分類

C抗原不同可分類A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V等20個群。對人致病的大多屬于A群。A群又稱為化膿性鏈球菌（Pyogenicstreptococcus）。3.對氧的需要分類按照是否需要氧，可分為需氧鏈球菌、厭氧鏈球菌、微嗜氧鏈球菌。其中厭氧鏈球菌常寄生于口腔、腸道和陰道中，可致病的有消化鏈球菌屬。（七）抵抗力抵抗力不強，60℃3分鐘可殺死大部分鏈球菌，對一般消毒劑敏感，在干燥塵埃中可存活數(shù)日；乙型鏈球菌對青霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、磺胺均敏感。(八)流行病學與致病性溶血性鏈球菌在自然界中分布較廣，存在于水、空氣、塵埃、糞便及健康人和動物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通過直接接觸、空氣飛沫傳播或通過皮膚、粘膜傷口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也會對人類進行感染。上呼吸道感染患者、人畜化膿性感染部位常成為食品污染的污染源。化膿性鏈球菌一般來說，溶血性鏈球菌常通過以下途徑污染食品：

1、食品加工或銷售人員口腔、鼻腔、手、面部有化膿性炎癥時造成食品的污染；

2、食品在加工前就已帶菌、奶牛患化膿性乳腺炎或畜禽局部化膿時，其奶和肉尸某些部位污染；

3、熟食制品因包裝不善而使食品受到污染。溶血性鏈球菌?？梢鹌つw、皮下組織的化膿性炎癥、呼吸道感染、流行性咽炎的爆發(fā)性流行以及新生兒敗血癥、細菌性心內(nèi)膜炎、猩紅熱和風濕熱、腎小球腎炎等變態(tài)反應。(九)檢驗原理1、增菌溶血性鏈球菌對營養(yǎng)要求比較高，增菌一般用匹克氏肉湯或葡萄糖肉浸液肉湯。匹克氏肉湯含有胰蛋白胨的心肌浸液和脫纖維血，營養(yǎng)豐富，而且含有三氮化鈉抑制革蘭氏陰性菌生長，一般用于污染嚴重的標本，37℃培養(yǎng)24小時。2、分離培養(yǎng)利用溶血性鏈球菌在血平板上所形成的特殊菌落分離、純化?；野咨?、半透明、表面光滑，直徑為0.5-0.75mm的圓形突起細小菌落；具有溶血環(huán)。3、驗證試驗分類：鏈激酶實驗短桿菌肽敏感實驗觀察血平板溶血情況革蘭氏染色（十）檢驗程序GB/T4789.11-2003操作步驟1.樣品處理按無菌操作稱取食品檢樣25g（ml），加入225ml滅菌生理鹽水，研成勻漿制成混懸液。2.培養(yǎng)將上述混懸液吸取5ml，接種于50ml葡萄糖肉浸液肉湯，或直接劃線接種于血平板。如檢樣污染嚴重，可同時按上述量接種匹克肉湯，經(jīng)36度培養(yǎng)24h，接種血平板，置36度培養(yǎng)24h，挑起乙型溶血圓形突起的細小菌落，在血平板上分純，然后觀察溶血情況及革蘭氏染色，并進行鏈激酶試驗及桿菌肽敏感試驗。3.培養(yǎng)特性該菌營養(yǎng)要求高，在普通培養(yǎng)基上生長不良，在加有血液、血清培養(yǎng)基上生長較好。溶血性鏈球菌在血清肉湯中生長時，管底呈絮狀或顆粒狀沉淀。血平板上菌落為灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直徑約0.5mm-0.75mm，為圓形突起的細小菌落，乙型溶血鏈球菌周圍有2mm-4mm界限分明、物色透明的溶血圈。4.鏈激酶試驗致病性乙型溶血性鏈球菌能產(chǎn)生激酶素（即溶纖維蛋白酶），此酶能激活正常人體血液中的血漿蛋白酶原，使成血漿蛋白酶，而后溶解纖維蛋白。吸取草酸鉀血漿0.2ml，加0.8ml滅菌生理鹽水，混勻，再加入18h-24h，36度培養(yǎng)的鏈球菌培養(yǎng)物0.5m