植物組織培養(yǎng)設(shè)備及條件

第一節(jié)實驗室設(shè)計及基本技術(shù)一、實驗室組成二、儀器設(shè)備三、培養(yǎng)器皿及實驗用具四、洗滌技術(shù)五、滅菌技術(shù)六、無菌操作

目前一頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點

組織培養(yǎng)實驗室布局的總體要求

便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察一、實驗室組成目前二頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點基本實驗室輔助實驗室實驗室組成準備室緩沖室無菌操作室培養(yǎng)室細胞生物學(xué)實驗室溫室生化分析實驗室目前三頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點水槽實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱架電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室目前四頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點組織培養(yǎng)準備實驗室目前五頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點準備室目前六頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點緩沖室目前七頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點無菌室目前八頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點無菌室目前九頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點培養(yǎng)室目前十頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點培養(yǎng)架目前十一頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點培養(yǎng)間目前十二頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點二、儀器設(shè)備1）、基本儀器設(shè)備

冰箱、電（磁）爐、酸度計、純水器、天平、移液器、解剖鏡、光照培養(yǎng)箱、搖床、生化培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器等。目前十三頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點冰箱酸度計電爐目前十四頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點天平純水器目前十五頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點培養(yǎng)基分裝器攪拌器目前十六頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點搖床體式顯微鏡倒置顯微鏡冷光源電磁攪拌器搖床目前十七頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點2）、滅菌設(shè)備蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。目前十八頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點蒸汽壓力滅菌鍋目前十九頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點目前二十頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點高壓滅菌器目前二十一頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點干熱消毒柜目前二十二頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點75%酒精噴霧器噴霧消毒器目前二十三頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點3）、無菌操作設(shè)備

超凈工作臺目前二十四頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點二、設(shè)備、儀器超凈工作臺（一）設(shè)備目前二十五頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點1.紫外線滅菌燈2.日光燈3.工作臺4.凳子5.擱物架6.窗7.推拉門8.緩沖間目前二十六頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點目前二十七頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點無菌接種箱目前二十八頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點4、細胞培養(yǎng)設(shè)備

搖床目前二十九頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點培養(yǎng)架目前三十頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱150C

250D

光照培養(yǎng)箱

目前三十一頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點

光照培養(yǎng)箱烘箱目前三十二頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點5、細胞學(xué)鑒定設(shè)備光學(xué)顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學(xué)顯微鏡目前三十三頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點電子天平（0.0001g，0.001g）

酸度計目前三十四頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點1、玻璃器皿三、培養(yǎng)器皿及實驗用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶目前三十五頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點2、金屬材質(zhì)用具鑷子解剖刀接種針目前三十六頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點（二）各類器皿

1．器皿的類型（1）培養(yǎng)器皿三角瓶、培養(yǎng)瓶、圓形培養(yǎng)瓶、試管、L形管和T形管（2）分注器（3）刻度移液管（4）微量移液器（5）細菌過濾器（三）器械用具打孔器

鑷子

解剖刀

接種針剪刀電熱滅菌器

目前三十七頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點四、洗滌技術(shù)1、玻璃器皿洗滌已用過的玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用新購置玻璃器皿目前三十八頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點2、塑料用品洗滌新的塑料器皿打開即用已用過的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%—5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用目前三十九頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點3、金屬用品洗滌熱洗衣粉水洗凈沖洗擦干目前四十頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點五、滅菌技術(shù)物理方法：干熱、濕熱、射線處理、過濾除菌等化學(xué)方法：消毒劑、抗菌素滅菌1、滅菌方法目前四十一頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點2、滅菌（1）培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法壓力在0.1M—0.2MPa

溫度在121℃

滅菌10—30min（2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌干熱消毒滅菌目前四十二頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點飽和蒸汽壓力與其對應(yīng)的溫度飽和蒸汽壓力溫度（℃）飽和蒸汽壓力溫度（℃）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6目前四十三頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點（3）塑料器皿滅菌：多采用高壓蒸汽消毒滅菌（4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用目前四十四頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點（5）接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室超凈工作臺紫外燈照射70%—75%的酒精擦洗培養(yǎng)材料的接種紫外燈照射目前四十五頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點（6）外植體滅菌流水沖洗10—20min或更長時間70%—75%酒精中浸泡30s0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗4—5次在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右備用目前四十六頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑使用濃度（%）去除難易消毒時間（min）效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9~102飽和溶液1~210~120.1~170~754~5（mg/L1易易易易最易較難易中較難5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好較好好目前四十七頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點消毒，更換實驗服、帽子與鞋子，進入接種室。打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射40min左右，后關(guān)閉。開啟過濾風(fēng)機，使無菌風(fēng)吹拂工作臺面和四周的臺壁。用70%—75%的酒精擦拭工作臺和雙手。（7）接種準備目前四十八頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點六、無菌操作實驗員消毒實驗室、無菌臺滅菌實驗器材的滅菌無菌接種消毒實驗臺衛(wèi)生培養(yǎng)室培養(yǎng)目前四十九頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的，要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。準備室：器具的洗滌、干燥、保存、滅菌，各種藥品的儲備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等，設(shè)備：藥品柜、防塵廚、冰箱、天平、純水儀、酸度計、操作臺、滅菌鍋、烘箱。

實驗室設(shè)計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染?；瘜W(xué)室/準備室、接種室、培養(yǎng)室。小結(jié)目前五十頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點

接種室：植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移、試管苗繼代、原生質(zhì)體制備及其它需要進行的無菌操作。設(shè)備：紫外光源、超凈工作臺、消毒器、酒精燈、接種器械（鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）。清潔和消毒，減少與外界空氣對流，穿實驗服及換鞋以減少帶入雜菌。

培養(yǎng)室：墻壁要求絕熱防火的性能，培養(yǎng)架由金屬制成，底層離地高約10cm，層間隔40cm，總高1.7m左右，長度根據(jù)日光燈的長度而設(shè)計，寬度為60cm。目前五十一頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點第二節(jié)植物組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件及營養(yǎng)成分一、環(huán)境條件

與自然條件一樣，組織培養(yǎng)中的外植體的生長要受到溫度、光照、濕度等各種物理條件，不同培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學(xué)條件，以及外植體部位、大小、細胞密度等各種生物條件等環(huán)境條件的影響。如何根據(jù)需要來控制培養(yǎng)條件是組織培養(yǎng)中的一個重要問題。目前五十二頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點溫度光照濕度氣體滲透壓pH值一般最適溫度在25±2℃之間環(huán)境條件最常用的是光照16h，黑暗8h一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對濕度應(yīng)達100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對濕度在70%—80%

氧氣是愈傷組織生長所必需的調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖入手

培養(yǎng)基的pH值大多在5.0—6.5，5.8目前五十三頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點溫度在20-27℃左右，空調(diào)控溫，濕度恒定，相對濕度在70-80%，光照由定時開關(guān)控制，每天光照10-16h左右，不同植物決定光照時間，培養(yǎng)室可采用太陽光為能源，易成活，陰雨天用室內(nèi)燈光補光。目前五十四頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點二、營養(yǎng)成分

植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：a、組成各種化合物，參與機體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；b、構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝；c、元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡點等化學(xué)方面的作用；d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、器官建成。目前五十五頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營養(yǎng)元素的3個標(biāo)準:A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史;B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補充該元素來預(yù)防和恢復(fù);C、該元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的變化而產(chǎn)生的間接效果。目前五十六頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點

國內(nèi)外公認的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有16（17）種：

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時期、不同條件下含量也不同。目前五十七頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為※大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種※微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下，有的只含0.1mg/kg，F(xiàn)e、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種按照國際植物生理協(xié)會的建議：

所需濃度>0.5mmol/L的元素為大量元素所需濃度<0.5mmol/L的元素為微量元素目前五十八頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點1、大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。

P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4

、NaH2PO4等。

K對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。目前五十九頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。Ca是構(gòu)成細胞壁的成分，對細胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。目前六十頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點2、微量元素

在微量元素中，鐵的使用最大：◆一些氧化酶的組成成分◆葉綠素形成的必要條件◆使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀目前六十一頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點

硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運輸有著密切的關(guān)系

銅是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生長

錳參與植物的光合、呼吸代謝

鉬參與氮素的代謝

氯是光合作用水光解的活化劑微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。目前六十二頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點

組織培養(yǎng)的條件營養(yǎng)條件（培養(yǎng)基），組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)，不同植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，合適培養(yǎng)基才能成功。MS培養(yǎng)基：1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞設(shè)計，無機鹽濃度較高，硝酸鹽含量高，用于植物器官、花藥、細胞的組培，有些培養(yǎng)基是由它演變而來。B5培養(yǎng)基：1968年由Galmborg為培養(yǎng)大豆根細胞設(shè)計，含有較低的銨鹽，適合雙子葉植物、木本植物目前六十三頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點White培養(yǎng)基：1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖設(shè)計，MgSO4、硼鹽濃度高，無機鹽濃度低，適于生根培養(yǎng)。N6培養(yǎng)基：1974年由朱至清為禾谷類花藥培養(yǎng)而設(shè)計，KNO3和（NH4）2SO4濃度高，適于花藥培養(yǎng)。KM-8P培養(yǎng)基：1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計，有機成分復(fù)雜，包括了所有的單糖及維生素，適于原生質(zhì)體融合培養(yǎng)。目前六十四頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點培養(yǎng)基成分主要是水、無機鹽、有機物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)基中的凝膠無機鹽：大量元素（大于0.5mmol/L的元素）、微量元素。N：是蛋白、維生素、核酸、磷脂等的組成成分，培養(yǎng)基中有NO3--、NH4+供應(yīng)形式，如KNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4等。P：磷脂、ATP等的組成成分，常用的有KH2PO4、NaH2PO4等K：與糖類合成、蛋白代謝有關(guān)，常以KCL、KNO3在培養(yǎng)基中提供Mg、S、Ca：是葉綠素、酶、細胞壁的組成成分，MgSO4·7H2O、CaCL2·7H2O目前六十五頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點微量元素：小于0.5mmol/L，F(xiàn)e、Zn、B、Mn、Cu、Mo、Co等；FeSO4·7H2O與Na2-EDTA配成鐵鹽溶液。碳水化合物：常用的是蔗糖、葡萄糖，常用濃度為3%。維生素：以輔酶的形式參與多種代謝，對生長、分化有促進作用，VB1（鹽酸硫胺素）、VB6（鹽酸吡哆醇）、VB12、VPP（煙酸）、VC（抗壞血酸）、生物素、葉酸。肌醇：環(huán)己六醇，參與細胞壁、細胞膜構(gòu)建，100mg/L目前六十六頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點氨基酸---有機氮源，細胞直接吸收，甘氨酸、天冬氨酸、谷酰胺、水解乳蛋白（氨基酸混合物）等，10-1000mg/L天然復(fù)合物---椰子乳、香蕉、馬鈴薯濾液、酵母提取液、麥芽提取液、番茄汁等，不易培養(yǎng)時使用。植物激素---培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，生長素類（IAA、NAA、IBA、2,4-D；細胞分裂素（6-BA、KT、ZT）；赤霉素（GA3）生長素/細胞分裂素：高—利于根、愈傷組織形成；適中—利于根、芽分化；低—利于芽的形成目前六十七頁\總數(shù)八十七頁\編于二十一點培養(yǎng)基的支持物—瓊脂（固體培養(yǎng)時的固化劑，低于40度為凝膠，6-10g/L），玻璃纖維、濾紙橋、海綿、脫脂棉、卡拉膠等，總的要求是降低培養(yǎng)材料產(chǎn)生的有害物影響抗生素----卡那霉素、頭孢、青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，