生物技術(shù)制藥基因治療專家講座

1人基因組計(jì)劃和基因治療生物技術(shù)制藥基因治療第1頁2人類歷史上三大工程◆阿波羅登月計(jì)劃（1961～1972）◆曼哈頓原子彈計(jì)劃（1942～1945）◆人類基因組計(jì)劃（1990～）也反應(yīng)了生命科學(xué)以后居上。生物技術(shù)制藥基因治療第2頁曼哈頓原子彈計(jì)劃（1942－1945）

美國(guó)陸軍部于1942年6月開始實(shí)施利用核裂變反應(yīng)來研制原子彈計(jì)劃。為了先于納粹德國(guó)制造出原子彈，該工程集中了當(dāng)初西方國(guó)家(除納粹德國(guó)外)最優(yōu)異核科學(xué)家，動(dòng)員了10萬多人參加這一工程，歷時(shí)3年，耗資20億美元，于1945年7月16日成功地進(jìn)行了世界上第一次核爆炸，并按計(jì)劃制造出兩顆實(shí)用原子彈。生物技術(shù)制藥基因治療第3頁阿波羅登月計(jì)劃（1961－1972）

美國(guó)于20世紀(jì)60、70年代組織實(shí)施載人登月工程，它是世界航天史上含有劃時(shí)代意義一項(xiàng)成就。工程開始于1961年5月，至1972年12月第6次登月成功結(jié)束，歷時(shí)約11年，耗資255億美元。在工程高峰時(shí)期，參加工程有2萬家企業(yè)、200多所大學(xué)和80多個(gè)科研機(jī)構(gòu)，總?cè)藬?shù)超出30萬人。

生物技術(shù)制藥基因治療第4頁人類基因組計(jì)劃（1990－）

1986年，著名生物學(xué)家、諾貝爾獎(jiǎng)取得者雷納托.杜爾貝科（RenatoDulbecco）在Science雜志上率先提出“人類基因組計(jì)劃”。1990年10月，美國(guó)政府正式啟感人類基因組計(jì)劃，后有德、日、英、法、中等6個(gè)國(guó)家科學(xué)家先后正式加入，有16個(gè)試驗(yàn)室及1100名生物科學(xué)家、計(jì)算機(jī)教授和技術(shù)人員參加。

年4月14日，六國(guó)科學(xué)家宣告人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計(jì)劃全部目標(biāo)全部實(shí)現(xiàn)。已完成序列圖覆蓋人類基因組所含基因區(qū)域９９％，準(zhǔn)確率到達(dá)99.9％，這一進(jìn)度比原計(jì)劃提前兩年多。至此，人類基因組計(jì)劃共耗資27億美元，比原先預(yù)計(jì)30億美元顯著節(jié)約。生物技術(shù)制藥基因治療第5頁人類基因組計(jì)劃開啟1985年，美國(guó)能源部（DepartmentofEnergy,DOE）提出，要將共包含約3×109堿基正確人類基因組全部堿基序列分析清楚；1986年，美國(guó)宣告開啟“人類基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject,HGP）”。生物技術(shù)制藥基因治療第6頁人類基因組包含分布于人46條染色體30億核苷酸30,000-35,000個(gè)基因。人類基因組計(jì)劃最終目標(biāo)是測(cè)定基因組全部序列，搞清整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)、功效及其表示產(chǎn)物，徹底了解人類生命活動(dòng)本質(zhì)。生物技術(shù)制藥基因治療第7頁人類基因組計(jì)劃要測(cè)定是人體23對(duì)染色體中全部DNA序列，它由31.647億個(gè)堿基對(duì)組成，共有3萬至3.5萬個(gè)基因。換句話說，生命天書是由30多億個(gè)字寫成，假如將這30多億字排版到一張報(bào)紙上，那么大約需要20萬頁紙才能排完這部巨著。由此能夠想見，讀取這部巨著所要花費(fèi)時(shí)間將是怎樣驚人。解讀生命“天書”---人類基因組計(jì)劃

生物技術(shù)制藥基因治療第8頁6國(guó)科學(xué)家組成國(guó)家人類基因組中心主要研究百分比美國(guó)：WASH＆MIT等7家研究中心，貢獻(xiàn)率為54％。英國(guó)：SANGER一家研究中心，貢獻(xiàn)率為33％。日本：RIKEN等兩家研究中心，貢獻(xiàn)率為7％。法國(guó)：GENOSCOPE研究中心，貢獻(xiàn)率為2.8％。德國(guó)：IMB等3家研究中心，貢獻(xiàn)率為2.2％。中國(guó)：北京華大研究中心、國(guó)家南北方基因研究中心等三家，貢獻(xiàn)率為1％。

生物技術(shù)制藥基因治療第9頁中國(guó)人類基因組計(jì)劃1993年，中國(guó)人類基因組計(jì)劃（CHGP）開啟，首先開展了“中華民族基因組中若干位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)研究”。1997年，我國(guó)開啟了“重大疾病相關(guān)基因定位、克隆、結(jié)構(gòu)與功效研究”項(xiàng)目。之后，在上海和北京相繼成立了國(guó)家人類基因組南、北兩個(gè)中心。生物技術(shù)制藥基因治療第10頁生物技術(shù)制藥基因治療第11頁中國(guó)人類基因組計(jì)劃研究結(jié)果1.1%測(cè)序任務(wù)，第三條染色體3000萬bp準(zhǔn)確度99.99%發(fā)覺142個(gè)基因，其中80個(gè)為預(yù)測(cè)基因生物技術(shù)制藥基因治療第12頁人類基因組計(jì)劃1%測(cè)序中國(guó)試驗(yàn)室生物技術(shù)制藥基因治療第13頁人類基因組計(jì)劃發(fā)展1999年12月1日，首條人類染色體完成測(cè)序，人類第22號(hào)染色體DNA全序列測(cè)定宣告完成。4月6日，美國(guó)Celera遺傳信息企業(yè)宣告，該企業(yè)已破譯出一名試驗(yàn)者完整遺傳密碼。5月，科學(xué)家聚集美國(guó)冷泉港，宣告人類基因組草圖完成。生物技術(shù)制藥基因治療第14頁六月二十六日克林頓宣告人類基因組草圖繪制完成生物技術(shù)制藥基因治療第15頁人類基因組計(jì)劃首席科學(xué)家、美國(guó)國(guó)家人類基因組研究所所長(zhǎng)弗朗西斯·柯林斯在介紹情況。生物技術(shù)制藥基因治療第16頁人類基因組草圖基本信息由31.65億bp組成含3~3.5萬基因與蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因占2%人類基因組人類蛋白質(zhì)61%與果蠅同源43%與線蟲同源46%與酵母同源生物技術(shù)制藥基因治療第17頁人類基因研究最新發(fā)覺人類基因總數(shù)在3～3.5萬個(gè)之間，低于原來預(yù)計(jì)數(shù)目標(biāo)二分之一。這說明人類在使用基因上比其它物種更為高效?；蚪M中存在著基因密度較高“熱點(diǎn)”區(qū)域和大片不攜帶人類基因“荒漠”區(qū)域。大約1/3以上基因組包含重復(fù)序列，這些重復(fù)序列作用有待深入研究。全部些人都含有99.99%相同基因，而且不一樣人種人比同一人種人在基因上更為相同，任何兩個(gè)不一樣個(gè)體之間大約每1000個(gè)核苷酸序列中會(huì)有一個(gè)不一樣，這稱為單核苷酸多態(tài)性(SNP)，每個(gè)人都有自己一套SNP，它對(duì)“個(gè)性”起著決定作用。生物技術(shù)制藥基因治療第18頁人類基因組研究能明白什么？搞清楚人類基因組序列后，能夠經(jīng)過各種分析伎倆將所編碼基因進(jìn)行定位，就好象將一架鋼琴88個(gè)鍵音頻搞清楚（或者說要將基因元素周期表定出來）。但對(duì)這架鋼琴是怎樣演奏出動(dòng)聽樂曲,不能提供什么信息。生物技術(shù)制藥基因治療第19頁同一個(gè)基因組能夠有

不一樣演奏法生物技術(shù)制藥基因治療第20頁21生物技術(shù)與人基因組計(jì)劃研究策略生物技術(shù)制藥基因治療第21頁22測(cè)序策略：鳥槍法生物技術(shù)制藥基因治療第22頁23測(cè)序組裝過程8個(gè)隨機(jī)測(cè)讀片段（10-20bp）計(jì)算機(jī)進(jìn)行組裝最終得到長(zhǎng)72bp長(zhǎng)片段生物技術(shù)制藥基因治療第23頁24Sequencingagenomicbyusinganoverlappingclonemap測(cè)序構(gòu)建重合群與組裝生物技術(shù)制藥基因治療第24頁25構(gòu)建亞克隆庫生物技術(shù)制藥基因治療第25頁26末端配對(duì)測(cè)序生物技術(shù)制藥基因治療第26頁27

ideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應(yīng)終止劑能夠看成正常堿基參加復(fù)制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應(yīng)體系中dNTPs濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs(普通1：3~4)測(cè)序方法：雙脫氧法生物技術(shù)制藥基因治療第27頁28基因組學(xué)家們巧妙地將在制造業(yè)中使用機(jī)器人擴(kuò)大化利用以增加測(cè)序通量，提升可靠性和準(zhǔn)確性

生物技術(shù)制藥基因治療第28頁29亞克隆測(cè)序創(chuàng)新放射性標(biāo)識(shí)平板凝膠電泳

兩大革新：

熒光標(biāo)識(shí)毛細(xì)管電泳大大提升了測(cè)序效率1.4個(gè)鏈終止反應(yīng)能夠在同一個(gè)體系中進(jìn)行也能夠在同一個(gè)泳道中進(jìn)行電泳2.實(shí)時(shí)地自動(dòng)檢測(cè)1.無需費(fèi)時(shí)灌膠點(diǎn)樣工序2.同一個(gè)毛細(xì)管能夠被屢次使用3.整個(gè)測(cè)序反應(yīng)都是機(jī)器人操作進(jìn)行革新點(diǎn)生物技術(shù)制藥基因治療第29頁30早期DNA測(cè)序分成4個(gè)獨(dú)立反應(yīng)進(jìn)行延長(zhǎng)后DNA片段被放射性同位素標(biāo)識(shí)（主要是32P和35S）曝于X射線下進(jìn)行DNA檢測(cè)不一樣顏色熒光標(biāo)識(shí)ddNTPs半自動(dòng)化測(cè)序機(jī)器進(jìn)行DNA測(cè)序

生物技術(shù)制藥基因治療第30頁31

人基因組測(cè)序完成生物技術(shù)制藥基因治療第31頁32生物技術(shù)制藥基因治療第32頁33人類基因體計(jì)畫生物技術(shù)制藥基因治療第33頁34

人類基因組計(jì)劃意義及影響生物技術(shù)制藥基因治療第34頁人類基因組計(jì)劃意義

一、取得人類全部基因序列將有利于人類認(rèn)識(shí)許多遺傳疾病以及癌癥等疾病致病機(jī)理，為分子診療、基因治療等新方法提供理論依據(jù)。二、破譯生命密碼人類基因組計(jì)劃有利于人們對(duì)基因表示調(diào)控有更深入了解。三、人類基因組圖譜對(duì)揭示人類發(fā)展、進(jìn)化歷史含有主要意義。

生物技術(shù)制藥基因治療第35頁人類基因組研究與未來藥學(xué)基因組藥品學(xué)經(jīng)過研究個(gè)體對(duì)包含藥品在內(nèi)外界化學(xué)物質(zhì)（有毒外源物)反應(yīng)遺傳多樣性和差異性，到達(dá)科學(xué)合理用藥目標(biāo)。

發(fā)覺和開發(fā)新蛋白質(zhì)和多肽類藥品。提供大量藥品作用新靶點(diǎn)，供新藥篩選、研究用。生物技術(shù)制藥基因治療第36頁人類基因組研究應(yīng)用

人類基因組計(jì)劃不但能夠揭示生命活動(dòng)奧秘，而且人類6千各種單基因遺傳性疾病和多基因易感性疾病致病機(jī)理有望得到說明。尋找與特定遺傳疾病相關(guān)基因工作變得輕易。１、

在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用

（1）對(duì)特殊疾病基因確實(shí)定經(jīng)過認(rèn)識(shí)特殊疾病基因序列，為疾病診療和治療提供了可能。如家族性早老年癡呆癥、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、亨廷頓舞蹈癥?？商峁┎∪薉NA樣品序列數(shù)據(jù)庫。經(jīng)過正常和患者DNA有效分析比較，到達(dá)對(duì)疾病基因定位目標(biāo)。（2）有利于優(yōu)生和產(chǎn)前診療經(jīng)過基因檢測(cè)，識(shí)別出帶有遺傳疾病胚胎細(xì)胞。在很快未來，胎兒期檢測(cè)可能能夠預(yù)測(cè)普通常見病，比如：肥胖癥、抑郁癥和心臟病等。（3）加強(qiáng)對(duì)癌癥認(rèn)識(shí)和治療

癌癥是因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)失控造成。而失控是因特定基因異常造成。遺傳缺點(diǎn)會(huì)使人體對(duì)特定癌癥含有高易感性。一旦確定了易感基因，就能夠進(jìn)行癌前或早期癌癥特殊監(jiān)護(hù)和治療。

生物技術(shù)制藥基因治療第37頁

２、在基礎(chǔ)理論研究方面應(yīng)用（1）確定人類基因組中基因序列、組織和物理位置，有利于研究基因功效以及基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。（2）從整體上了解染色體結(jié)構(gòu)，包含各種重復(fù)序列以及非轉(zhuǎn)錄序列在染色體結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄和表示調(diào)控中影響和作用。（3）研究正?；蚺c突變基因差異，盡快地確定出疾病基因，對(duì)該基因蛋白產(chǎn)物及其細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行深入研究。（4）發(fā)覺新基因和蛋白質(zhì)。迄今僅有少數(shù)參加正常和疾病人類基因被確定。對(duì)人類基因組作圖和測(cè)序?qū)?huì)確定出大量新人類基因及其編碼蛋白質(zhì)。另外，物理圖譜將有利于對(duì)那些已大致定位在染色體上，但還未分離出基因進(jìn)行準(zhǔn)確定位。生物技術(shù)制藥基因治療第38頁３、在生物學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用

生物進(jìn)化研究

假如知道了人和其它生物基因組全序列，就有可能追溯出人類基因起源。人胚胎有序發(fā)育需要特定場(chǎng)所和時(shí)間活化，使多潛能細(xì)胞成為新類型細(xì)胞，這一過程最少部分地受控于位于基因附近調(diào)整次序。對(duì)人類基因組進(jìn)行次序分析，并將與其它哺乳動(dòng)物進(jìn)行比較，將使我們能確定出大量調(diào)整次序。另外，我們將了解基因調(diào)控規(guī)律，及其在人從其它哺乳動(dòng)物分化出來過程中在分子水平上所發(fā)生改變。人類基因組計(jì)劃相關(guān)倫理學(xué)問題。一是人類基因組數(shù)據(jù)共享，二是人類基因組信息應(yīng)用于醫(yī)學(xué)保健方面所產(chǎn)生問題。人類基因組所包含遺傳信息是人類共同遺產(chǎn)，應(yīng)該為全人類全部。

生物技術(shù)制藥基因治療第39頁國(guó)際人類基因組科學(xué)主流組織曾發(fā)表過屢次申明，壟斷數(shù)據(jù)做法違反公眾利益，若獨(dú)占或延誤公布將妨礙科學(xué)發(fā)展，也不應(yīng)申請(qǐng)專利。但不反對(duì)對(duì)中、下游結(jié)果，如功效明確又有工業(yè)用途基因工程產(chǎn)品等申請(qǐng)專利。這一立場(chǎng)得到各國(guó)政府響應(yīng)。1996年由國(guó)際各大測(cè)序中心聯(lián)合作出百慕大協(xié)議：基因組序列應(yīng)在二十四小時(shí)之內(nèi)公布。3月14日，美國(guó)總統(tǒng)克林頓和英國(guó)首相布萊爾聯(lián)合申明支持基因組數(shù)據(jù)公開政策。6月28日，江澤民主席就人類基因組研究發(fā)表主要講話中也指出“人類基因組序列是全人類共同財(cái)富，應(yīng)該用來為全人類造福”。人類基因組計(jì)劃為推進(jìn)醫(yī)學(xué)進(jìn)步帶未了空前機(jī)遇。但同時(shí)也可能帶來一系列倫理、法律和社會(huì)學(xué)問題。比如：病人隱私權(quán)怎樣得到保護(hù)？他們就業(yè)和保險(xiǎn)是否會(huì)受到影響？是否會(huì)在社會(huì)上受到“遺傳歧視”？社會(huì)和法律能夠?yàn)樗麄兲峁┖畏N幫助和保護(hù)？生物技術(shù)制藥基因治療第40頁41

搶基因世紀(jì)之戰(zhàn)

當(dāng)前世界上正在進(jìn)行一場(chǎng)“搶基因”“世紀(jì)之戰(zhàn)”

,其根本動(dòng)力是基因能夠淘金，從一個(gè)肥胖基因能價(jià)值9000萬美元中，人們更悟清了這個(gè)道理。2.基因淘金與基因經(jīng)濟(jì)生物技術(shù)制藥基因治療第41頁42DNA雙螺旋與淘金車生物技術(shù)制藥基因治療第42頁43基因版圖生物技術(shù)制藥基因治療第43頁44哮喘病相關(guān)基因研究材料◆取自僅有301個(gè)居民南大西洋一個(gè)小島(全部是近親婚配，1／3人患有嚴(yán)重哮喘)；◆我國(guó)浙江象山一個(gè)大家系在內(nèi)幾個(gè)大家系；◆經(jīng)過對(duì)芬蘭發(fā)覺很多大家系研究，已成功地克隆了最少12個(gè)基因?！舢?dāng)前，實(shí)際上已形成了一個(gè)被普遍接收簡(jiǎn)單關(guān)系式，即:

遺傳病家系＝基因＝money（錢）生物技術(shù)制藥基因治療第44頁45人類基因組計(jì)劃與倫理生物技術(shù)制藥基因治療第45頁46基因有沒有好壞之分?◆當(dāng)我們說某個(gè)基因引發(fā)疾病時(shí)，稱它為“致病基因”或“有害基因”。但有時(shí)被認(rèn)為致病基因也能夠在一定情況下對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用?！舯热缭诜侵?，許多人患有鐮形細(xì)胞癥，這是基因引發(fā)。但非洲又有致命惡性瘧疾，帶有可引發(fā)鐮形細(xì)胞癥基因攜帶者卻比不帶有該基因健康人更能抵抗惡性瘧疾?！暨@么，“致病基因”在此時(shí)變成了“御病基因”。生物技術(shù)制藥基因治療第46頁47◆人們?cè)谡務(wù)摗白运交颉?、“侵略基因”，“利他主義基因”、“精神分裂基因”、“嗜賭基因”、“嗜酒基因”、“同性戀基因”時(shí)◆美國(guó)哲學(xué)家NozickR(1990)想象未來基因超級(jí)市場(chǎng)可提供未來父母購置他們想要孩子所含有性狀(如性別和眼睛顏色)編碼基因。生物技術(shù)制藥基因治療第47頁48◆對(duì)于可能攜帶不利基因任何人，都應(yīng)公正對(duì)待，不得歧視；對(duì)于基于基因組特征歧視，應(yīng)采取一切適當(dāng)辦法禁止和結(jié)束，必要時(shí)立法?！舯Ｗo(hù)個(gè)人和家庭基因隱私

HGP一個(gè)獨(dú)特問題是，誰能得知DNA?親人、工作單位或雇主、保險(xiǎn)企業(yè)?應(yīng)該保護(hù)個(gè)人及其家庭基因隱私。生物技術(shù)制藥基因治療第48頁HGP將給人類帶來好處

1、將帶動(dòng)一場(chǎng)醫(yī)學(xué)革命用基因圖譜看病基因藥品治病基因檢測(cè)預(yù)防隱患基因治療疾病2、獲取了操縱生命工具控制生命孕育—優(yōu)生優(yōu)育延長(zhǎng)人壽命選擇最正確生活環(huán)境3、得以進(jìn)行準(zhǔn)確個(gè)體判定基因身份證生物考古4、將帶來巨大商機(jī)生物制藥器官培植生物技術(shù)制藥基因治療第49頁HGP可能給人類帶來隱患

社會(huì)平等與基因歧視科技進(jìn)步與基因技術(shù)濫用社會(huì)公正與基因結(jié)果利益均等分配技術(shù)不確定性和基因安全生物技術(shù)制藥基因治療第50頁后基因組時(shí)代

人類基因組計(jì)劃基本目標(biāo)與任務(wù)只是一個(gè)以測(cè)序?yàn)橹鹘Y(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究，伴隨該目標(biāo)實(shí)現(xiàn)，“功效基因組學(xué)”、“蛋白質(zhì)組學(xué)”興起，HGP研究重心逐步由結(jié)構(gòu)向功效轉(zhuǎn)移，即基因組功效信息提取、判定和開發(fā)利用。生物技術(shù)制藥基因治療第51頁52Thesequenceofthehumangenome人類基因體計(jì)畫生物技術(shù)制藥基因治療第52頁基因變異致病類型內(nèi)源基因變異：基因結(jié)構(gòu)突變基因表示異常外源基因入侵：基因診療和基因治療遺傳性疾病腫瘤、心腦血管病等（生殖細(xì)胞）（體細(xì)胞）病毒感染性疾?。篐IV、SARS、HCV、HPV生物技術(shù)制藥基因治療第53頁第一節(jié)

基因診斷

GeneticDiagnosis生物技術(shù)制藥基因治療第54頁

特點(diǎn)：針對(duì)性強(qiáng)：病因?qū)W檢測(cè)

特異性強(qiáng)：分子雜交技術(shù)靈敏度高：PCR、分子雜交放大效應(yīng)，樣品量少適應(yīng)性強(qiáng)：內(nèi)源、外源基因早期快速診療：一、基因診療概念和特點(diǎn)定義：是用放射性同位素、熒光分子等標(biāo)識(shí)DNA分子做探針，利用DNA分子雜交原理，判定被檢測(cè)標(biāo)本上遺傳信息，到達(dá)檢測(cè)疾病目標(biāo)。生物技術(shù)制藥基因治療第55頁二、基因診療慣用技術(shù)方法（一）核酸分子雜交技術(shù)（二）聚合酶鏈反應(yīng)

(PCR)（三）基因測(cè)序（四）基因芯片不一樣DNA探針含有不一樣核苷酸序列，用其與被測(cè)樣品雜交，依據(jù)雜交后分子雙鏈程度確定被測(cè)樣品與探針堿基序列相同程度生物技術(shù)制藥基因治療第56頁二、基因診療慣用技術(shù)方法限制性內(nèi)切酶譜分析法DNA限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)間接分析（一）核酸分子雜交技術(shù)生物技術(shù)制藥基因治療第57頁核酸分子雜交技術(shù)原理：生物技術(shù)制藥基因治療第58頁核酸分子雜交流程示意圖待測(cè)核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未參加雜交探針檢測(cè)雜交信號(hào)制備探針核酸片段探針標(biāo)記加入標(biāo)識(shí)核酸探針生物技術(shù)制藥基因治療第59頁×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正常基因5′3′突變基因1.15kb1.35kb1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組限制性酶切分析0.2kb正常珠蛋白基因：5’－CCTGAGG－3’鐮刀型貧血：5’－CCTGTGG－3’生物技術(shù)制藥基因治療第60頁+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組限制性酶切分析生物技術(shù)制藥基因治療第61頁DNA多態(tài)性：中性突變?cè)斐蓚€(gè)體間核苷酸序列差異限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析：突變發(fā)生在酶切位點(diǎn)上，酶切DNA片段不一樣長(zhǎng)度RFLP：孟德爾方式遺傳，家族中，與某一疾病緊密連鎖，作為遺傳標(biāo)志，判定家族組員是否攜帶致病基因應(yīng)用：甲型血友病、囊性纖維病變、苯丙酮尿癥2.DNA限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析

生物技術(shù)制藥基因治療第62頁RLFP分析法生物技術(shù)制藥基因治療第63頁單基因病---苯丙酮尿癥I型病因：肝臟合成苯丙氨酸羥化酶（PhenylalaninaHydrozylase,PAH）缺乏。主征：智力低下，尿有霉味治療：新生兒診療明確后，即用低苯丙氨酸飲食控制血中苯丙氨酸濃度，改進(jìn)腦子發(fā)育，而“危險(xiǎn)期”一過，病嬰以后就基本正常。PAH僅存在于肝臟細(xì)胞中，在絨毛、羊水細(xì)胞和胎兒血中均不表示，故不能經(jīng)過測(cè)定酶活力及代謝產(chǎn)物來進(jìn)行PKU產(chǎn)前診療只能依賴于家系分析，找出與PKU致病基因相連鎖RFLP，進(jìn)行基因分析做出產(chǎn)前診療生物技術(shù)制藥基因治療第64頁（二）聚合酶鏈反應(yīng)

（polymerasechainreactionPCR）PCR定義：指由一對(duì)引物介導(dǎo)基因或克隆特定DNA序列酶促擴(kuò)增反應(yīng)過程，是DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，本質(zhì)是DNA體外復(fù)制?！獞?yīng)用PCR技術(shù)能夠使特定基因或DNA片段在短短2－3小時(shí)擴(kuò)增至百萬倍。

生物技術(shù)制藥基因治療第65頁（二）聚合酶鏈反應(yīng)KaryMullisresearchscientistinthe1980sataCaliforniabiotechnologycompanycalledCetusco-winnerof1993NobelPrize生物技術(shù)制藥基因治療第66頁P(yáng)CR技術(shù)基本原理

①模板DNA變性：94℃熱變性，使DNA雙鏈解離成為單鏈，方便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物退火(復(fù)性)：55℃左右，引物與模板DNA單鏈互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為反應(yīng)原

料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新與模板DNA鏈互補(bǔ)半保留復(fù)制鏈生物技術(shù)制藥基因治療第67頁P(yáng)CR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，即Y=2n

(n為循環(huán)次數(shù))生物技術(shù)制藥基因治療第68頁以愛滋病臨床檢測(cè)為例，簡(jiǎn)明說明一下PCR在病毒感染基因診療中應(yīng)用。組織中總RNA提取↓利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA↓PCR反應(yīng)：反應(yīng)緩沖液模板（上述合成cDNA）底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）引物（愛滋病病毒特異性引物）TaqDNA聚合酶50μl循環(huán)：95℃，30sec（變性）↓55℃，1min（退火）30循環(huán)↓

72℃，1min（延伸）

生物技術(shù)制藥基因治療第69頁（三）基因測(cè)序技術(shù)他們給DNA測(cè)序帶來了一場(chǎng)革命，分享了1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。以后Sanger法發(fā)展為自動(dòng)化測(cè)序法，并為人類基因組測(cè)序做出了卓越貢獻(xiàn)。FredSanger

創(chuàng)造末端合成終止法(sanger法)WalterGilbert創(chuàng)造化學(xué)裂解法

Maxam-Gillbert法生物技術(shù)制藥基因治療第70頁末端合成終止法(sanger法)原理2‘,3’-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）與普通dNTP不一樣之處于于其脫氧核糖3‘位置少一個(gè)羥基，可在DNA聚合酶作用下經(jīng)過其5'三磷酸基團(tuán)摻入到正在增加DNA鏈中，但ddNTP因缺乏3‘羥基而不能同后續(xù)dNTP形成磷酸二酯鍵，所以，當(dāng)正在增加DNA鏈末端堿基為ddNTP時(shí)，則鏈延伸反應(yīng)終止，不可能繼續(xù)延伸。這么，在DNA合成反應(yīng)混合物4種普通dNTP中加入少許一種ddNTP后，鏈延伸將與偶然發(fā)生卻十分特異鏈終止展開競(jìng)爭(zhēng)，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于從用以起始DNA合成引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止位置之間距離，結(jié)果將產(chǎn)生4類寡核苷酸，它們分別終止于模板鏈每一個(gè)A、C、G或T位置上。生物技術(shù)制藥基因治療第71頁雙脫氧鏈終止法測(cè)序基礎(chǔ)是以雙脫氧核苷三磷酸為循環(huán)測(cè)序反應(yīng)鏈終止劑。生物技術(shù)制藥基因治療第72頁P(yáng)OHdNTPddNTPPOHOHPPPPOH末端合成終止法(sanger法)原理生物技術(shù)制藥基因治療第73頁5’3’5’3’引物模板DNAdNTPDNA聚合酶ddATPddTTPddGTPddCTP末端合成終止法(sanger法)原理生物技術(shù)制藥基因治療第74頁末端合成終止法(sanger法)原理生物技術(shù)制藥基因治療第75頁生物技術(shù)制藥基因治療第76頁DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果生物技術(shù)制藥基因治療第77頁（四）基因芯片技術(shù)快速、高通量、平行化、自動(dòng)化

指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量基因探針以顯微打印方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)識(shí)樣品雜交，經(jīng)過對(duì)雜交信號(hào)檢測(cè)分析，得出樣品遺傳信息（基因序列及表示信息）生物技術(shù)制藥基因治療第78頁（四）基因芯片技術(shù)生物技術(shù)制藥基因治療第79頁1..芯片制備

Geneprobes（cDNA、DNA）substrate

Ready-to-usemicroarrayOligoprobesAGCTorarrayer生物技術(shù)制藥基因治療第80頁SamplecellsExtractRNAorDNA2)RTorPCRamplification3)FluorescentlabelingReferencecellsSamplereadycombineLabeledRNAorDNA(Sample)LabeledRNAorDNA(Reference)

2)1)3)1)2)3)2.基因表示譜雙色標(biāo)識(shí)生物技術(shù)制藥基因治療第81頁3.分子雜交1)hybridizeApplysample2)rinse生物技術(shù)制藥基因治療第82頁4.檢測(cè)分析Laser1Laser2Detector1Detector2Scanner芯片掃描生物技術(shù)制藥基因治療第83頁5.圖像處理Detector1Detector2False-colordifferentialimage生物技術(shù)制藥基因治療第84頁圖像分析生物技術(shù)制藥基因治療第85頁基因診療方法經(jīng)典基因診療.限制性內(nèi)切酶法.RFLP分析法.寡核苷酸分析法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn).特異基因診療.未知基因診療.直接，過程簡(jiǎn)單.過程繁雜.準(zhǔn)確性低，過程繁.條件嚴(yán)格基因診療進(jìn)展.PCR方法.PCR-序列分析法.DNA芯片技術(shù).簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、敏感.操作直接、準(zhǔn)確.集成度高、快速、并行.假陽性高.價(jià)格高.尚無成熟產(chǎn)品問世生物技術(shù)制藥基因治療第86頁三、基因診療應(yīng)用遺傳疾病腫瘤感染性疾病，傳染性流行病判斷個(gè)體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子判定生物技術(shù)制藥基因治療第87頁定義早期是指用正?；蛘先爰?xì)胞基因組，以校正和置換致病基因一個(gè)治療方法。當(dāng)前廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以到達(dá)治療疾病目標(biāo)方法。一、基因治療概念生物技術(shù)制藥基因治療第88頁基因治療基因病可分為三大類：第一類為單基因?。坏诙悶槎嗷虿?，包括兩個(gè)以上基因結(jié)構(gòu)或表示調(diào)控改變；第三類為取得性基因病，由病原微生物經(jīng)過感染將其基因入侵到宿主基因引發(fā)。

人體中某種基因發(fā)生突變、不能表示和產(chǎn)生正常產(chǎn)物，就會(huì)造成一個(gè)基因病?；虿∽罱K處理路徑有賴于基因修復(fù)（“基因治療”，genetherapy）。

1987年諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主、日本分子生物學(xué)家利根川進(jìn)（SusumuTonegawa）認(rèn)為，人類全部疾病都與基因受損相關(guān)，并第一次提出人體疾病新概念──“基因病”。生物技術(shù)制藥基因治療第89頁

多基因病多基因病也與外界環(huán)境和心理原因相關(guān)，遺傳原因所占程度稱之為遺傳度如：哮喘病遺傳度為80％、精神分裂癥為80％、高血壓遺傳度為62％、冠心病遺傳度為65％、糖尿病遺傳度（幼年型）為75％、糖尿病遺傳度（老年型）為35％、唇裂＋腭裂遺傳度為76％生物技術(shù)制藥基因治療第90頁OneGene,OneProtein

OneGene,OnePolypeptideChain鐮刀形細(xì)胞貧血癥。正常HbA四條多肽鏈（2條鏈，兩條鏈）VernonM.Ingram證實(shí)鏈第六位氨基酸HbA是谷氨酸，HbS是纈氨酸。證實(shí)基因與氨基酸之間存在直接對(duì)應(yīng)關(guān)系第一個(gè)直接證據(jù)生物技術(shù)制藥基因治療第91頁兩個(gè)緊密連鎖基因幾乎總是一起傳給下一代圖3-9連鎖和非連鎖基因遺傳形式ABABABabababABabABAbabab重組產(chǎn)物ABababABAbaB（a）連鎖基因（c）在不一樣染色體上基因（b）在同一染色體上相距很遠(yuǎn)基因在同一條染色體上，相距很遠(yuǎn)兩基因經(jīng)常同時(shí)遺傳，但重組會(huì)使它們分開在不一樣染色體上兩個(gè)基因隨機(jī)分離如圖所表示為3個(gè)家族代表男性代表女性生物技術(shù)制藥基因治療第92頁圖3-10乳腺癌基因圖譜分析D17S7417號(hào)染色體（80Mb）D17S1325D17S1321BRCA1生物技術(shù)制藥基因治療第93頁甲型血友病基因診療（連鎖分析1）5’3’引物1引物299bp43bpBclI因子VIII基因142bp片段生物技術(shù)制藥基因治療第94頁甲型血友病基因診療（連鎖分析2）142bp99bp43bp異常帶先癥者胎兒BACK生物技術(shù)制藥基因治療第95頁圖3-11轉(zhuǎn)染干細(xì)胞分化，使全部成熟血細(xì)胞都含有新基因分離干細(xì)胞新基因感染重新植入分化T細(xì)胞B細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞中性性粒細(xì)胞單核細(xì)胞生物技術(shù)制藥基因治療第96頁Φ基因識(shí)別為治療遺傳性疾病提供生物化學(xué)基礎(chǔ)，并為深入設(shè)計(jì)藥品提供依據(jù)Φ識(shí)別缺點(diǎn)基因中發(fā)生突變，用來設(shè)計(jì)篩選程序，檢測(cè)缺點(diǎn)基因攜帶者突變基因Φ遺傳疾病相關(guān)基因識(shí)別是進(jìn)行基因治療先決條件生物技術(shù)制藥基因治療第97頁基因治療基本方法基因矯正(genecorrection)基因置換(genereplacement)基因增補(bǔ)(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)生物技術(shù)制藥基因治療第98頁幾個(gè)常見基因失活技術(shù)反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)三鏈技術(shù)干擾RNA技術(shù)基因治療其它方法：如“自殺基因”應(yīng)用，基因疫苗等生物技術(shù)制藥基因治療第99頁如：自殺基因+病毒載體

轉(zhuǎn)染重組載體

藥品前體無毒Gene→酶→↓藥品復(fù)合物有毒

細(xì)胞死亡生物技術(shù)制藥基因治療第100頁多抗藥基因療法

因?yàn)槎嗫顾幮裕∕DR）基因已被克隆，所以人們構(gòu)想分離患者造血干細(xì)胞，將MDR基因從體外轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)去，使這種干細(xì)胞取得多藥耐藥性，再回輸給患者，使得由這類被修飾干細(xì)胞繁衍白細(xì)胞含有多藥耐藥性，而腫瘤細(xì)胞未取得MDR基因，不具備耐藥性或耐藥性較差，這么在加大化療劑量或在連續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間化療情況下，可大量殺死腫瘤細(xì)胞而白細(xì)胞較少受損，以此到達(dá)治療腫瘤目標(biāo)。生物技術(shù)制藥基因治療第101頁抑癌基因療法

野生型抑癌基因失活和腫瘤發(fā)生親密相關(guān)，所以人們構(gòu)想將正常野生型抑癌基因?qū)肽[瘤細(xì)胞以代替和賠償有缺點(diǎn)抑癌基因，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。生物技術(shù)制藥基因治療第102頁二、基因治療基本程序治療性基因選擇基因載體選擇靶細(xì)胞選擇基因轉(zhuǎn)移外源基因表示篩選

利用在體中標(biāo)識(shí)基因回輸體內(nèi)病毒載體非病毒載體體細(xì)胞生殖細(xì)胞間接體內(nèi)療法直接體內(nèi)療法生物技術(shù)制藥基因治療第103頁生物技術(shù)制藥基因治療第104頁基因治療發(fā)展過程1980-1989年準(zhǔn)備期，基因治療能否進(jìn)入臨床存在很大爭(zhēng)議。臨床前研究1990-1995年狂潮期，基因治療進(jìn)入臨床試驗(yàn)，從專業(yè)刊物到大眾媒體，都給人留下了基因治療即將成為臨床治療一個(gè)成熟方法。1996年后理性期，NIH1995年重新評(píng)定已經(jīng)進(jìn)入臨床方案，發(fā)覺100多個(gè)方案中確證有療效僅有幾個(gè)。生物技術(shù)制藥基因治療第105頁基因治療存在問題及處理方法㈠導(dǎo)入基因連續(xù)表示問題

因?yàn)橥庵苎馨图?xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞都有一定壽命限制，所以需不停給患者回輸含目標(biāo)基因細(xì)胞?，F(xiàn)已經(jīng)有許多試驗(yàn)室正在研究壽命較長(zhǎng)靶細(xì)胞，如造血干細(xì)胞和骨髓前體細(xì)胞。生物技術(shù)制藥基因治療第106頁㈡導(dǎo)入基因高效表示問題

迄今全部導(dǎo)入細(xì)胞目標(biāo)基因表示率都不十分高，這與基因轉(zhuǎn)移方法、靶細(xì)胞選擇等相關(guān)。當(dāng)前有不少試驗(yàn)室正在研究將高效開啟子構(gòu)建入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。如:人巨細(xì)胞病毒開啟子。因?yàn)榇嬖诮M織特異性，并非一個(gè)開啟子適于全部基因高效表示，所以其它高效開啟子也在研究中。生物技術(shù)制藥基因治療第107頁㈢安全性問題

＊安全性問題是基因治療臨床試驗(yàn)前首先要重視問題。

＊反轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)安全性問題依然必須重視；

＊當(dāng)前基因治療研究還未發(fā)展到定點(diǎn)整合、置換缺點(diǎn)或有害基因階段，治療基因在基因組中隨機(jī)整合，有可能激活原癌基因或失活抑癌基因，從而引發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變。生物技術(shù)制藥基因治療第108頁但迄今為止全部基因治療都是在體細(xì)胞水平。體細(xì)胞基因治療只是影響病人本身，而對(duì)種系細(xì)胞干預(yù)，因?yàn)榛虮恢踩氲骄?、卵?xì)胞或胚胎細(xì)胞，所以它影響會(huì)傳遞給下一代，影響到整個(gè)人類進(jìn)化。生物技術(shù)制藥基因治療第109頁基因藥品制備制備大量純度較高超螺旋質(zhì)粒DNA，培養(yǎng)含表示質(zhì)粒工程菌。㈠工程菌發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中含抗生素，提升質(zhì)粒copy。加氯霉素，能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，不影響質(zhì)粒。離心取得菌體㈡基因藥品純化破壁，除去細(xì)胞碎片、蛋白、脂類、RNA，質(zhì)粒純化生物技術(shù)制藥基因治療第110頁1、PEG沉淀法

PEG溶液高速離心，質(zhì)粒DNA超螺旋雙鏈閉合環(huán)狀，沉降系數(shù)高，其它RNA，線狀DNA低。對(duì)堿裂解法提取質(zhì)粒效果好。堿性裂解細(xì)胞，PH12.6，SDS，DNA變性沉淀

PH7.0質(zhì)粒復(fù)性→上清液DNA→取上清液→乙醇沉淀2、氯化銫梯度平衡離心法

利用質(zhì)粒DNA與大腸桿菌DNA、RNA、蛋白密度不一樣3、柱層析：離子交換，凝膠色譜，反相色譜PH7.0

（三）裸DNA濃縮乙醇沉淀，異丙醇也可，但不易揮發(fā)，易共沉淀生物技術(shù)制藥基因治療第111頁基因藥品導(dǎo)入與靶組織局部直接注射靶組織

(一)靶組織

1、肌肉：攝取外源DNA能力強(qiáng)。肌纖維是有絲分裂后細(xì)胞，轉(zhuǎn)入DNA不會(huì)因細(xì)胞分裂而較快稀釋或丟失。血流豐富，1—3天可表示，7—14天高峰，連續(xù)數(shù)周—數(shù)月。生物技術(shù)制藥基因治療第112頁

2、皮膚：皮內(nèi)、皮下注射，表皮涂抹。

在表皮、真皮、毛囊、毛囊腺細(xì)胞表示。

4小時(shí)表示，1—3天高峰，連續(xù)一周。轉(zhuǎn)移率低，基因槍導(dǎo)入可提升轉(zhuǎn)移效率。

3、黏膜：呼吸道、消化道等。注射、基因槍導(dǎo)入、口服、噴霧表面無角質(zhì)層，易被攝取，血液豐富，輸送至遠(yuǎn)離部位。2—4時(shí)表示，1—4天高峰，連續(xù)3周。生物技術(shù)制藥基因治療第113頁4、靜脈和腹腔靜脈：轉(zhuǎn)移速度快，2分鐘快速分布在肝、脾、肺、心、腎、腦。5分鐘表示，4—12時(shí)高峰，連續(xù)2—4天。

腹腔：轉(zhuǎn)移效率低，半衰期短。生物技術(shù)制藥基因治療第114頁導(dǎo)入系統(tǒng)1、基因槍：將DNA用金或鎢顆粒包裹，經(jīng)過高壓電所產(chǎn)生高能弧，有效穿透單細(xì)胞或靶器官進(jìn)入細(xì)胞漿，甚至細(xì)胞核，防止酶降解，需劑量小2、電脈沖：高壓低電流脈沖電刺激，引發(fā)細(xì)胞膜電荷改變，形成短暫可逆性孔隙，促進(jìn)基因向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)入細(xì)胞、肝臟、黑色素瘤、肌肉。

生物技術(shù)制藥基因治療第115頁3、陽離子脂質(zhì)體

原理：DNA包埋在脂質(zhì)體內(nèi)部，與帶負(fù)電細(xì)胞膜結(jié)合、介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移。

慣用陽離子脂質(zhì)體，帶正電脂類與中性輔助脂類混合物

中性脂質(zhì)體或膽固醇促進(jìn)內(nèi)吞后釋放脂質(zhì)體商品化生物技術(shù)制藥基因治療第116頁

（一）基因轉(zhuǎn)移靶向性許多細(xì)胞表面特異性表示或過表示某種受體、抗原，

將含目標(biāo)基因載體與對(duì)應(yīng)配體、抗體連接如：含葉酸脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染過分表示葉酸受體鼻咽癌上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率比不含葉酸高20-30倍。

基因藥品導(dǎo)入系統(tǒng)靶向性和時(shí)相性生物技術(shù)制藥基因治療第117頁（二）基因表示靶向性

利用組織特異性基因開啟子限制目標(biāo)基因只在靶細(xì)胞內(nèi)表示，靶細(xì)胞內(nèi)存在特異轉(zhuǎn)錄激活因子，作用于基因開啟子，激活轉(zhuǎn)錄。

生物技術(shù)制藥基因治療第118頁使用組織特異性基因開啟子：正常細(xì)胞中特異性蛋白質(zhì)開啟子，疾病狀態(tài)下過表示、特異表示開啟子如：氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶（CAT）基因置于骨鈣素基因開啟子控制下，轉(zhuǎn)染骨髓細(xì)胞，僅在骨組織中表示。生物技術(shù)制藥基因治療第119頁（三）基因表示時(shí)相性

在一定時(shí)間內(nèi)和水平上表示,不能過長(zhǎng)、過短、過高、過低。構(gòu)建某藥品依賴性轉(zhuǎn)錄活化因子，調(diào)控基因表示生物技術(shù)制藥基因治療第120頁用外源性、可口服非毒性小分子藥品，如四環(huán)素、蛻皮激素，經(jīng)過給藥時(shí)間、藥劑量調(diào)整基因表示，不服用時(shí)不表示或低水平表示。用納巴霉素控制促紅細(xì)胞生成素表示，納巴霉素與開啟子上某序列結(jié)合，能誘導(dǎo)基因表示。TATA框等RNA聚合酶Ⅱ等只能開啟基礎(chǔ)水平轉(zhuǎn)錄，還有一類調(diào)控序列，經(jīng)過結(jié)合其它轉(zhuǎn)錄激活因子，提升轉(zhuǎn)錄水平，依賴藥品。

生物技術(shù)制藥基因治療第121頁不足：配體插入影響載體空間結(jié)構(gòu);腫瘤表示某種受體或抗原有相對(duì)專一性;利用外源性DNA序列對(duì)于基因長(zhǎng)久表示有障礙，機(jī)體能識(shí)別并降解;外源藥品可能干擾人體正常生理反應(yīng)

生物技術(shù)制藥基因治療第122頁基因藥品安全性

裸DNA整合至宿主細(xì)胞基因組可能性

危害：產(chǎn)生插入性突變，激活腫瘤基因，或抑制腫瘤抑制基因整合分三類：隨機(jī)插入、同源重組、逆轉(zhuǎn)錄病毒插入同源重組最正確條件：（1）宿主細(xì)胞正在復(fù)制（2）二者DNA上有大于600bp高度同源片段生物技術(shù)制藥基因治療第123頁防范：（1）構(gòu)建DNA基因藥品時(shí)防止使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或去除能引發(fā)插入重組已知序列。（2）肌肉注射，因隨機(jī)整合可能只在復(fù)制再生細(xì)胞中發(fā)生，肌肉細(xì)胞處于分裂后期。整合發(fā)生率比自發(fā)突變頻率要低。乙肝：10%用重組疫苗無足夠免疫反應(yīng)、核酸疫苗誘導(dǎo)高水平免疫,皮膚給藥,誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子激發(fā)免疫。生物技術(shù)制藥基因治療第124頁裸DNA基因藥品應(yīng)用腫瘤

a、IFN干擾素脂質(zhì)體包被注入瘤體；

b、白介素脂質(zhì)體包被注入瘤體；

c、氣管吸入裸DNA抑制肺癌乙肝、結(jié)核（結(jié)核桿菌疫苗—卡介苗）、流感(DNA疫苗交叉保護(hù))、瘧疾生物技術(shù)制藥基因治療第125頁三、基因治療應(yīng)用與展望應(yīng)用展望遺傳性疾病、心血管疾病、腫瘤、感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病深入尋找切實(shí)有效基因精密調(diào)控外源基因在人體內(nèi)表示體細(xì)胞移植和重建生物學(xué)研究降低外源基因?qū)C(jī)體不利影響生物技術(shù)制藥基因治療第126頁基因治療面臨挑戰(zhàn)及展望當(dāng)前全世界已知遺傳病有3000各種，但其中只有3％找到了致病基因，得到治療僅幾千人。外源基因多路徑、多層次表示調(diào)控更是嚴(yán)重挑戰(zhàn)。

不論怎樣，基因治療路還是會(huì)越走越寬廣。

生物技術(shù)制藥基因治療第127頁1990年9月14日，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NationalInstitutesofHealth,NIH）正式同意安德生（W.F.Anderson）領(lǐng)導(dǎo)治療小組為一位因腺苷脫氨酶（ADA）基因缺點(diǎn)而出現(xiàn)嚴(yán)重綜合性免疫缺點(diǎn)癥（SCID）４歲女孩作基因治療。安德生采取白細(xì)胞培養(yǎng)，以帶正常ADA基因病毒感染白細(xì)胞，再將白細(xì)胞注入體內(nèi)。到1991年5月，經(jīng)7次注射，患兒體內(nèi)ADA水平到達(dá)正常人25％，免疫功效逐步恢復(fù)，生活質(zhì)量顯著提升，已能滑冰和上舞蹈課，也未見副作用。

“基因治療之父”基因治療實(shí)例

生物技術(shù)制藥基因治療第128頁GenetherapyforadenosinedeaminasedeficiencyADA=adenosinedeaminase腺苷脫氨酶缺乏生物技術(shù)制藥基因治療第129頁2、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時(shí)間長(zhǎng)，輕傷、小手術(shù)后常出血不止。發(fā)病率為1/300001991年12月13日，復(fù)旦大