機(jī)械攪拌罐培養(yǎng)大腸桿菌

微生物發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)中南民族大學(xué)工商學(xué)院環(huán)境與生物工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心第一頁，共十三頁。1實(shí)驗(yàn)六、機(jī)械攪拌罐培養(yǎng)大腸桿菌

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)材料四、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、注意事項(xiàng)七、思考題第二頁，共十三頁。21、學(xué)會(huì)發(fā)酵參數(shù)的設(shè)置。

2、掌握發(fā)酵液參數(shù)的測(cè)定方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡谌?，共十三頁?微生物在發(fā)酵培養(yǎng)的過程中其體系參數(shù)會(huì)發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)通過使用機(jī)械攪拌罐發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌后測(cè)定其發(fā)酵液的菌體量、葡萄糖濃度、pH值。

采用分光光度計(jì)法在波長620nm下測(cè)定其濁度進(jìn)行菌體量分析；利用pH計(jì)測(cè)定其pH值；葡萄糖濃度的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色定糖法，其原理為

3，5一二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度與還原糖的量成正比。二、實(shí)驗(yàn)原理第四頁，共十三頁。4三、實(shí)驗(yàn)材料1.菌種：大腸桿菌。2.培養(yǎng)基：①種子活化培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L

；蛋白胨10g/L

；氯化鈉5g/L

；pH7.0-7.2。

②發(fā)酵培養(yǎng)基：6g/LNa2HPO4，3g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，1g/LNH4Cl，0.5g/LMgSO4?7H2O，0.011g/LCaCl2，10g/L葡萄糖,pH7.0

。3.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和3，5-二硝基水楊酸試劑。

第五頁，共十三頁。5四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）種子培養(yǎng)用接種環(huán)從保存斜面中接一環(huán)至盛有種子活化培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)。（二）大腸桿菌的培養(yǎng)調(diào)小氣量，燃燒酒精，旋松接種口蓋，在火焰保護(hù)下，打開接種口蓋，倒入種子，旋緊接種口蓋子。開始發(fā)酵，發(fā)酵條件為35℃、300r/min。每隔2小時(shí)取樣。第六頁，共十三頁。6（三）取樣每次取樣時(shí)將管口先流出的10ml培養(yǎng)液作為廢液，取隨后流出的20ml。（四）發(fā)酵結(jié)束處理剩余菌液進(jìn)行滅菌處理，排放到指定地點(diǎn)，進(jìn)行罐的清洗。

四、實(shí)驗(yàn)步驟第七頁，共十三頁。7（五）取樣分析1.取樣菌體量的分析：測(cè)定620nm濁度。2.葡萄糖濃度的測(cè)定：3,5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS法）

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取九支試管，編號(hào)，按下表加入各種試劑。將各管快速搖動(dòng)混勻，在沸水浴中加熱5min,取出后立即用水冷卻到室溫，再向每支試管中加入21.5ml蒸餾水,搖勻,于520nm波長測(cè)A值,以葡萄糖mg數(shù)為橫坐標(biāo),光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

四、實(shí)驗(yàn)步驟第八頁，共十三頁。8

（2）樣品測(cè)定

取離心的上清夜稀釋，取1ml于試管中，加蒸餾水1ml，加3,5-二硝基水楊酸試劑1.5ml，加完試劑后同以上操作，測(cè)定吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖的含量，計(jì)算培養(yǎng)基中葡萄糖的量。項(xiàng)目0123456781mg/ml溶液(ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸餾水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.43,5-二硝基水楊酸試劑(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.53.pH值的測(cè)定將不同時(shí)段取樣離心的上清夜用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)量,觀察發(fā)酵過程中pH值的變化,并以時(shí)間為橫坐標(biāo),相應(yīng)pH值為縱坐標(biāo)作圖。第九頁，共十三頁。9(1)以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體數(shù)量，濁度，葡萄糖濃度，pH為縱坐標(biāo)作圖，觀察各參數(shù)的變化。

(2)計(jì)算最大比生長速率和葡萄糖的比消耗速率。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果第十頁，共十三頁。101.機(jī)械攪拌罐培養(yǎng)大腸桿菌接種和取樣過程中應(yīng)注意避免造成污染和正確使用設(shè)備。

2.注意正確使用離心機(jī)并注意安全。

3.酸度計(jì)的正確使用。六、注意事項(xiàng)第十一頁，共十三頁。11七、思考題

機(jī)械攪拌罐在培養(yǎng)大腸桿菌的過程中和發(fā)酵液參數(shù)的測(cè)定要注意哪些問題？第十二頁，共十三頁。12內(nèi)容總結(jié)微生物發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過使用機(jī)械攪拌罐發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌后測(cè)定其發(fā)酵液的菌體量、葡萄糖濃度、pH值。利用pH計(jì)測(cè)定其pH值。葡萄糖濃度的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色定糖法，其原理為3，5一二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度與還原糖的量成正比。②發(fā)酵培養(yǎng)基：6g/LNa2HPO4，3g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，1g/LNH4Cl，