分枝桿菌分離培養(yǎng)和藥敏試驗

分枝桿菌分離培養(yǎng)、藥敏試驗及菌種鑒定方法標準化河南CDC結核病預防控制所趙玉玲2006年4月耐藥菌株尤其是耐多藥菌株的不斷擴散，正日益成為我國結核病控制的一大難題，若耐藥結核菌的播散和流行得不到有效遏止，將會出現(xiàn)較多慢性傳染源，從而導致結核病治療、管理的難度進一步加大，對國家結核病防治規(guī)劃的有效實施將構成威脅。因此，監(jiān)測結核病耐藥性情況可以為制定、評價和完善國家結核病防治規(guī)劃（NTP）提供參考依據(jù)。我國2000年全國流調結核菌耐藥狀況

初始耐藥：18.6%獲得性耐藥：46.5%總耐藥：27.8%我國2000年全國流調結核菌耐藥狀況初始耐多藥率：7.6%獲得性耐多藥率：17.1%總耐多藥率：10.7%6種抗結核藥物的耐藥率順序異煙肼（17.6%）鏈霉素（17.3%）利福平（16.6%）對氨基水楊酸（2.8%）乙胺丁醇（1.5%）氨硫尿（1.3%)8?。ù危┠退幈O(jiān)測耐藥狀況

省份耐藥率（%）新病人復治病人總河南（1996）35.066.040.5河南（2001）29.860.835.5內蒙35.765.344.8遼寧42.155.843.3山東17.650.024.5湖北17.544.523.3浙江14.859.321.9廣東13.038.115.58?。ù危┠退幈O(jiān)測耐藥狀況省份耐多藥率（%）新病人復治病人總河南（1996）10.834.415.1河南（2001）7.836.612.9內蒙7.036.816.1遼寧10.424.211.7山東2.919.56.4湖北2.121.86.4浙江4.535.09.4廣東2.817.54.38省（次）耐藥監(jiān)測耐藥狀況省份利福平耐藥率（%）新病人復治病人總河南（1996）14.643.519.7河南（2001）9.642.615.3內蒙9.851.021.2遼寧11.429.113.1山東3.823.27.9湖北3.826.98.8浙江6.545.012.6廣東3.522.25.3分枝桿菌種類分枝桿菌(Mycobaterium)迄今報道有100多個種?！恫芟到y(tǒng)細菌學手冊》將分枝桿菌軍菌種劃分為兩大類：緩慢生長分枝桿菌與快速生長分枝桿菌。在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，接種很稀的新鮮培養(yǎng)物，在適宜的培養(yǎng)溫度下，7天以上肉眼可見單個菌落，稱為緩慢生長分枝桿菌，其代表菌種是結核分枝桿菌(M.tuberculosis).在上述條件下，7天以內肉眼可見單個菌落，成為快速生長分枝桿菌。分枝桿菌種類分枝桿菌屬，除結核分枝桿菌復合群（結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌）及麻風分枝桿菌外，余者統(tǒng)稱為非結核分枝桿菌（NontuberculosisMycobacteria,NTM）結核分枝桿菌是引起人類結核病的主要病原菌，此外，牛分枝桿菌除引起牛結核病外，少數(shù)人類結核病也由其引起。非洲分枝桿菌致病力較弱，是熱帶非洲人結核病病原體。田鼠分枝桿菌對人類無致病性。分枝桿菌種類

類別

Rubyun分群

對人致病的分枝桿菌緩

結核分枝桿菌復合群

人型、牛型、非洲型慢

非結核分枝桿菌Ⅰ群堪薩斯、海、猿生

非結核分枝桿菌Ⅱ群瘰癘長

非結核分枝桿菌Ⅲ群鳥-胞內、蟾快速生長非結核分枝桿菌Ⅳ群偶發(fā)、龜營養(yǎng)與發(fā)育結核菌是兼性需氧菌，在有氧和含有比較低氧的環(huán)境下均能生存，比如骨結核，淋巴結核。在少量二氧化碳的環(huán)境中生長的也很好。結核菌生長的適宜溫度和人體相近為37℃。結核菌生長所必須的元素有氧、碳、氮、氫、磷、鉀、鎂等。結核分枝桿菌的生長特性生長適宜溫度37℃，PH6.8~7.2，對營養(yǎng)要求較高專嗜甘油作為碳源，天門冬酰胺是最好氮源。在常用的羅氏培養(yǎng)基上生長的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皺折，呈顆粒、結節(jié)或菜花樣，乳白色或米色，不透明。結核菌生長緩慢，在一般培養(yǎng)基上分裂一代需要10~18小時，根據(jù)接種量的多少，一般10~30天肉眼可見菌落生長。耐藥性是結核桿菌的重要生物學特性耐藥菌不斷生長繁殖，終致菌群中以耐藥菌為主（敏感菌被藥物淘汰），抗結核藥物即失效。由基因突變而出現(xiàn)的極少量天然耐藥菌（自然變異），通常不致引起嚴重后果。藥物與結核桿菌接觸后，有的細菌發(fā)生誘導變異，逐漸能適應在含藥環(huán)境中繼續(xù)生存（繼發(fā)耐藥）。耐異煙肼菌株的致病力顯著減弱，耐鏈霉素菌株的致病力一般不降低，耐利福平菌株有不同程度降低，對利福平及異煙肼同時耐藥，其致病力降低較單一耐異煙肼者更顯著。實驗室檢驗技術涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分枝桿菌藥物敏感試驗分枝桿菌菌種鑒定血清學檢測分子生物學結核病細菌學實驗室布局原則結核病細菌學檢查要有獨立的實驗室，不得與其他實驗室混用。培養(yǎng)基制備、洗刷等相對潔凈的操作與涂片鏡檢、培養(yǎng)前處理、藥敏試驗等污染操作要有獨立分開的場所，最好分別在專用的房間進行。分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法的重要意義(1)不論從結核病控制、流行病學檢查或臨床診斷的角度看，分枝桿菌的分離培養(yǎng)檢查法都是結核病確診最可靠的方法，是結核病病原學診斷的“金標準”。分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法的重要意義(2)開展進一步檢測的基礎，是獲得純培養(yǎng)物進行菌種鑒定、藥物敏感性試驗以及其他生物學研究的基礎。(3)隨著結核病控制工作水平的提高，一些具備條件的基層結核病細菌學實驗室也應逐步開展分枝桿菌的分離培養(yǎng).酸性改良羅氏培養(yǎng)基成分和制備方法略。去污染處理(痰標本)視標本性狀，加1~2倍體積4%氫氧化鈉（NaOH)消化液于痰瓶中，擰緊螺旋蓋，渦旋震蕩器上震蕩1min，使痰液充分勻化，室溫放置。自加入氫氧化鈉消化液起，整個處理時間應在15~20min。標本較多時，應分批處理病理組種織或干芬酪塊標本切碎判后置于無碎菌組織研設磨器，加破入適量（滲0.5~梅1ml）生理鹽早水后充膜分研磨梁成混懸艦液；混清懸液經(jīng)股300廁0r/mi由n離心3假0min后，沉淀橡物進行堿航處理[與滴2~4倍兼量2%氫旬氧化鈉（NaOH備)混合，讀處理1往5min盼]后接種瞇。尿液留全量夜雜尿，靜置柳4~5h,取沉淀辜部分約該10ml,奇300著0r/回min離心3普0min,取沉淀進運行堿處理毀[與等倍啟量4%硫海酸（H2SO4）混合,鴨處理1目5min]后接種較.去污染處使理(其他輛標本)去污染處室理(其他叨標本)膿液采用4擺%硫酸谷（H2SO4）以1︰遙3混勻校后，靜秀置25min（期間震蕩斜數(shù)次)，恰按無菌手蜜續(xù)接種0舞.1ml經(jīng)處理勉的標本怒至L-J培養(yǎng)基，盾每份標本飯接種2支晉培養(yǎng)基。餅酸處理去熄污染時間忙不超過2市5min。胸腹水,飲支氣管灌埋洗液標本參照痰標份本處理辦魯法.去污染處層理(其他脅標本)腦脊液無菌操厚作收集換的腦脊步液,置釣冰箱或繪室溫2膝4h,待薄膜形鉗成后將薄彼膜接種到L-J培養(yǎng)基;撈或將腦脊米液在無制菌操作環(huán)捎境中300宏0r/恢min離心30min,取沉淀嚷直接接其種到L-J培養(yǎng)基令.非無漫菌操作榆采集的罰腦脊液痕標本,螞離心后印的沉淀濕進行堿劇處理[距與等倍易量4%渡氫氧化揮鈉（NaO團H)混合,邀處理1嬌0~1含5min]后接種于瓣酸性L-J培養(yǎng)基去污染低處理（至其他標壤本）糞便標本與傻生理鹽川水混合烏后,充鉆分振蕩渣使之成溉為混懸余液;定害性濾紙指過濾后怠,濾液搖經(jīng)300迫0r/砌min離心10min板;沉淀進行同酸處理[朵與2~4救倍量的4脹%硫酸（H2SO4）]混合,巴處理1巡壽5~2旬0min)后接種L-J培養(yǎng)基懂.咽喉棉拭扭子將棉拭晴子放入愚一無菌妄試管,靈加入適交量生理劣鹽水浸詳泡,加滑入等體祖積4局%氫氧隨化鈉（NaO抵H)后強烈餐振蕩,腹靜置1咳5min后接種薯.分離培細養(yǎng)的操醒作流程痰標本靜中、加1~2次倍體積4%NaOH渦旋振蕩1~2min室溫靜置15min分別接種貼0.1ml前處理澤液至2錢支培養(yǎng)基斜趣面置37偏℃溫肥箱培養(yǎng)接種后鐮3天,瞧7天觀察,此價后每周觀察一南次有菌落生旨長需經(jīng)抗酸染色拐確認,至第8周舍無菌落生長報選告陰性簡易培病養(yǎng)程序簡易培摧養(yǎng)程序離心培造養(yǎng)程序離心培養(yǎng)皆程序離心力這對痰涂漆片和培符養(yǎng)結果尊的影響離心力（xg）涂片陽性（+）培養(yǎng)陽性（+）涂片陽性/培養(yǎng)陽性比率12601.87.10.2530004.511.20.4038009.611.60.83結果報戰(zhàn)告1.接種置后第3、棵7天各觀剛察1次菌儀落生長情偉況。發(fā)現(xiàn)援菌落生長五者，經(jīng)抗肌酸染色證圓實后，可衛(wèi)報告快速氏生長分枝千桿菌陽性兆。此后每俘周觀察1狼次，記錄宿菌落生長平及污染情株況。陽性蠟生長物經(jīng)勝抗酸染色件證實后，帳可報告分恰枝桿菌生箏長。滿8托周后未見福菌落生長頁者方可報圓告培養(yǎng)陰核性結果。結果報待告2.觀察膛時發(fā)現(xiàn)非挪結核分枝嫌桿菌生長槍時，應報消告污染。煩培養(yǎng)污染俗率應控制陡在2%~訓5%范圍扇。污染率疾過高，提估示培養(yǎng)基堤滅菌不佳柿，標本前掃處理、接威種等環(huán)節(jié)神有誤，應彩當分析原及因，采取負相應措施吩。結果報共告培養(yǎng)結果毀報告方式(1)嗚分枝桿思菌培養(yǎng)青陰性:垂斜面無止菌落生申長,以術“培養(yǎng)詞陰性”套報告,臉不可以社“–”表示.(2)旗分枝桿恥菌培養(yǎng)遲陽性（莫１＋）痛：菌落惑生長占腳斜面面龍積的1色/4．(3)參分枝桿體菌培養(yǎng)兼陽性（魂2＋）界：菌落經(jīng)生長占士斜面面仆積的1殺/2．(4)購分枝桿陸菌培養(yǎng)檔陽性（什3＋）儲：菌落媽生長占貸斜面面昆積的3夫/4．(5)分駛枝桿菌培姻養(yǎng)陽性（蘆4＋）：槽菌落生長即布滿整個薯斜面(6)誼報實際激菌落數(shù)良:菌落凝生長不盜足斜面夜面積1錘/4．分離培膠養(yǎng)的注躲意事項選擇痰罷標本中部膿性、廣血樣、難干酪樣化的部分械進行培件養(yǎng)陽性壟率較高華。從加入前緊處理液到剩接種的時軟間不得多強于20分辜鐘.渦旋振盯蕩、離查心、傾幸倒上清呀液、接失種時容兇易產生方氣溶膠涉，應注奔意使用陸安全儀拒器，正吩確操作凡。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)興基上菌落艇生長需經(jīng)眾抗酸染色廳確認后方灶可報告陽真性。分離培養(yǎng)冤的優(yōu)點敏感性說較直接缺涂片法播高，理殲論上1傲0~1流00條小菌/毫沃升可檢橋出陽性奪；特異性較狐直接涂片婆法高，可征以從菌落堅生長速度腦，色素產騎生初步判吐斷非結核斑分枝桿菌規(guī)；分離出喪具有活刮力的純右培養(yǎng)物廉，為進尿一步試忙驗提供同基礎。分離培養(yǎng)送的缺點需時長，蘋根據(jù)接種濕量的大小谷，一般2新~8周才位能得到肉告眼可見菌虜落。結果受伯標本保想存運送碧時間，魯培養(yǎng)基皆成分和內質量，扇前處理干方法等怨影響，竭操作較掉直接涂足片法復掃雜，需左經(jīng)嚴格坡培訓。需培養(yǎng)永基凝固詳滅菌器億，離心跑機，渦藍旋振蕩柴器，恒針溫培養(yǎng)愧箱等設位備。成本是遞直接涂龍片法的潔7~8臟倍。分枝桿際菌快速悲培養(yǎng)檢陡查分枝桿菌亭快速培養(yǎng)嶺檢查是使促用分枝桿潮菌快速培撥養(yǎng)分枝桿凡菌儀，通掙過測定細欣菌生長代題謝而間接冬檢測分枝忠桿菌生長彩情況的方取法。由于膛應用營養(yǎng)板豐富的液排體培養(yǎng)基擁，并且檢墨測儀能連巾續(xù)檢測，星故提高了沒從標本中改分離分枝判桿菌的敏嬌感性進而楊縮短報告泊結果的時槍間。為保粱證檢查方蔬法的可靠啄性，目前付快速培養(yǎng)市檢查系統(tǒng)圣除提供相街應儀器，邊試劑以外姥，均根據(jù)悟不同系統(tǒng)薯制定了相古應的臨床鉆標本前處彎理、接種西、檢測和你報告結果枕的規(guī)程,翠故在進行正相應的檢殼查時，結青果的可重蟻復性和可除比性均能揚得到認可卵。分枝桿近菌快速冰培養(yǎng)檢頁查在進行分爽枝桿菌快凝速培養(yǎng)檢記查時，標醉本接種前純的去污染納處理，必對須嚴格按蓋照系統(tǒng)說殘明書中規(guī)霞定的方法蕩進行。孵五育檢測過筍程中系統(tǒng)賺報告陽性圈時，相應盼標本的培繞養(yǎng)液必須象首先進行督抗酸染色鋒鏡檢，發(fā)織現(xiàn)抗酸桿寶菌后方可訓發(fā)出陽性匠報告。幾種常搬見分枝騎桿菌快灶速培養(yǎng)齡儀Bec能tec嘩-T漆B64辰0全自動分鹽枝桿菌培艇養(yǎng)儀在營衡養(yǎng)豐富的稍培養(yǎng)液中先加入放射農性14C標記的乏棕閭酸待作為底懸物，分餐枝桿菌神生長過忌程中分酒解14C棕閭酸棉，產生CO2，儀器通杜過檢測CO2含量換旱算成生連長指數(shù)郊。培養(yǎng)累時間通甲常需要苗4~2何5天。優(yōu)點：黨簡便、舅快速，補可進行齡藥敏試開驗及初意步菌種摸鑒定。缺點：價則格昂貴，涂需進口專濾利液體培穴養(yǎng)基，且雖有放射性在污染，正放逐漸被非齊放射性的絞培養(yǎng)方法船所替代。幾種常見湊分枝桿菌寧快速培養(yǎng)麗儀Bec救tec棋-tb篩960全自動惜快速細韻菌培養(yǎng)模系統(tǒng)是銀將熒光絨物質包負埋在7H9液體培寄養(yǎng)管的印底部，旗分枝桿餡菌生長醬過程中筋，O被消耗，厭底物產生喂熒光，儀徐器通過測攤定熒光強擠度，用生晝長指數(shù)來悠表示測定走結果，培踐養(yǎng)時間通襖常需要7駕~42天襖。特點：簡陷便、快速爸，可進行刊藥敏試驗慕及初步菌證種鑒定。躺連續(xù)測定頁熒光強度禮，每60水分鐘自動佳測一次，堤無放射性衰污染。幾種常見禍分枝桿菌警快速培養(yǎng)蠟儀Bec摸t/a拳ler拉t3短D全自動快造速細菌培譯養(yǎng)儀，分礎枝桿菌生期長過程中屆代謝產生CO2，CO2的產生陳使瓶底洗顏色感股受器產蜜生不同寄的顏色筑變化。暈通過比廟色傳感雪器來測反定，CO2產生的搶速率和役總量與秘細菌生槐長的速態(tài)率和總辨量一致顏。簡便、快切速，可進娛行藥敏試襲驗及初步油菌種鑒定律。既能進蜂行分枝桿犯菌培養(yǎng)，仍又能進行陸普通菌培彼養(yǎng)，每1請0分鐘自芬動測一次字，無放射普性污染。藥物敏感亭性測定的組重要意義臨床治朗療的重逗要參考流行病學飯的重要指沈標分枝桿菌梨藥敏試驗在條件具屑備和有一閘定經(jīng)驗的爐實驗室方屋可進行此洽項試驗。下列情再況可進臘行分枝術桿菌藥法物敏感線性試驗狹：初始結核漢病人觀察鉗起始耐藥駁菌感染復發(fā)結頁核病人痰菌陰結轉后復疏陽者化療3~皆6個月痰受菌持續(xù)陽寺性者痰菌減少籠后又持續(xù)覺增加者細菌流行屆病學檢查非結核分斃枝桿菌病哥等藥物敏董感性試嚇驗常用邊標準方佛法絕對濃度藏法是由G.M樣eiss迫ner燦(德國)于1964年首先別提出的,是我國30多年來排一直沿脂用的藥數(shù)敏試驗攪方法。比例法是由法國漁的G.C株anet導ti和J.G皂ros犯set扶e于196蒜3年首先提寺出,是WHO全球耐藥冠監(jiān)測項目燥中推薦的睡標準藥敏公試驗方法被。二者在模臨界藥物量濃度接種摘菌量、結鞭果判讀方斥法等方面炸都有一定責差別.抗性比開濁法是英國科戶學家D.A園.Mi醋tch呆iso非n首先提出寧,由于方恥法比較煩麥瑣,現(xiàn)已疼不多用.比例法和盟絕對濃度破法的一致孤性比例法驗和絕對員濃度法喘是測定冊分支桿傲菌藥物摸敏感性村的二種喘常規(guī)方絡法,前者是嚇世界衛(wèi)轎生組織(WHO炒)在“全球久結核病耐子藥監(jiān)測項浸目”中推醉薦的統(tǒng)一遮方法,后者是我音國各級實幟驗室30多年來普匠遍沿用的挨方法。近熱年來,隨著我形國部分睡省陸續(xù)歉加入WHO耐藥監(jiān)測障項目,二種方法平的一致性欺問題以及商藥敏試驗匪是否向比誘例法轉軌份已成為國倒內爭議的貓熱點。比例法辨和絕對尾濃度法套的一致取性綜合以往變國內有關設比例法和汁絕對濃度繼法的試驗綿報道，對雙2種方法銜研究結果爪顯示,比例法粉和絕對須濃度法晶檢測結藝果的一合致率4藥均高嬸達96%以上,對于結懲核分支紀桿菌,二種方法嫩測試H、S、R和E的耐藥率捐均無顯著符性差異。眼絕對濃度燒法向比例育法轉軌，干將會使我龍們的藥敏俱試驗結果軍與國際接末軌，與干國際具有臣可比性，獨而不會影根響到與我三國既往資五料的連續(xù)蛙性和可比盤性。比例法和府絕對濃度鼓法的區(qū)別從試驗技屯術角度講,比例法笛與絕對突濃度法垃的主要焰區(qū)別是:(1大)絕對濃度剛法對接種全量（1債0-3mg）要求十炸分嚴格,既要避敬免由于概過量接屋種產生鍬自然突癢變的可嬸能,又要保倦證對照幅培養(yǎng)基雨上菌落妨生長旺插盛,相比之下,比例法由匯于設定了休高、低2個（1插0-4mg和10-6mg）接種量的相參考系統(tǒng),且試驗結鋸果的判定素是通過計刻算活性單階位的比值搭獲得,因此對襪接種量童這一藥熟敏試驗線的重要栗變異因數(shù)素進行普了一定儲程度的碧校正．比例法和勞絕對濃度岡法的區(qū)別(2)比例法潮定義1%為“敏握感”和懇“耐藥劍”的臨歪界點,而絕對濃捕度法規(guī)定渾低濃度含雄藥培養(yǎng)基淹上生長的搶菌落數(shù)多備于20個判斷掛為耐藥,按接種舒菌量的搬活菌單鑰位計算牙與比例胡法的1%耐藥有塵相同的鉛理論基礎。傲在此基貧礎上,由于絕對師濃度法每兵種藥物設滔定高、低2個藥物鵝濃度,所以絕對恢濃度法在吐一定程度帶上反映了井耐藥的程奇度和水平瞞。如果說踩比例法是幕定性的藥辯敏試驗,絕對濃艦度法則困包含有卵“半定隙量試驗烈”之意榴。（3）比浴例法操作諷較為繁瑣宿，且需定渴量技術。藥敏試填驗基礎纏培養(yǎng)基為無淀粉財改良羅氏農培養(yǎng)基，撇配方與酸待性羅氏培躍養(yǎng)基相比貨，只有磷辯酸二氫鉀提(KH2PO4)的量不同刺，其他成被分完全相爬同。抗結核藥餐物溶液的電配制和稀援釋1.藥敏陸試驗用抗嫂結核藥物削應從廠家聾取得純品競，并確認嚷純度和效愿價，在有輸效期內使陡用。2.異鞋煙肼(INH)責、利福平(RFP)瓣、氨硫脲(TB1)、乙硫異驕煙胺(TH132掛1)、環(huán)絲氨牙酸(SC)的生物效胖價按其重幅量單位計鍛算，計算彈用藥量時黎只需考慮狡其純度.臂鏈霉素硫蚊酸鹽（SM-S岔O4)、乙胺丁醇棒鹽酸鹽（EMB-執(zhí)Cl)、卡那霉井素硫酸昌鹽(KM-衫SO4)、卷曲霉素剛硫酸鹽(CPM變-SO4)、紫霉素硫哥酸鹽(VM-隆SO4)、對氨基每水楊酸述鈉鹽(PAS酸-Na賠)等在考慮剛其純度的幣同時，應隙按廠家標情定的毫克合效價計算顯其鹽型藥伍用量?？菇Y核托藥物溶苗液的配醫(yī)制和稀幟釋3.加食入培養(yǎng)賽基中實涉際藥量毒的計算裳可參考膽下列公創(chuàng)式：實際藥量曾=（培養(yǎng)黑基內藥物惠終濃度×需制備逼培養(yǎng)基在體積）佩/（該抱藥物純娘度×該藥五物校價橫×10么00）各變量單受位：實際螞藥量：mg效價：凈%培養(yǎng)基內桌藥物終濃藝度：μg/m京l純度：%需制備逼培養(yǎng)基魯體積：ml抗結核藥延物溶液的英配制和稀紫釋4絕麻對濃度嶄法按所賄需濃度翅制成高物濃度藥短液，再奸按相應懸比例稀月釋成低皇濃度藥憐液。5.比例苗法按藥物粒儲存液，廣分裝至無互菌試管，姐每管5~貓10ml,封口，貸-20℃保存夸，3個意月內使猾用。注意事肥項：除RFP、圍TB1、TH1321用二甲基臘甲酰胺溶裁解，再用維滅菌生理董鹽水稀釋況外，其他跟藥物可用效滅菌蒸餾鮮水溶解、慚稀釋。含藥培養(yǎng)綱基制備每10體0ml基礎培發(fā)養(yǎng)基加汪入1ml配制、稀達釋好的抗胡結核藥液撤，混勻，解無菌分裝全每管7ml，8扭5℃凝固澤50min.制成的所培養(yǎng)基37℃無菌試館驗24h，檢查培深養(yǎng)基污脆染情況哭后置4紀℃避搏光保存檔，1個間月內使圖用。藥敏試驗擇方法絕對濃度鐵法和比例大法藥敏試遙驗均包括供菌懸液制納備、稀釋德、接種、蔑培養(yǎng)和結碎果報告、丙質量控制熊等。絕對濃度準法具體操抄作步驟略該。比例法藥學敏試驗1．菌懸液制澆備（1）群臨床分士離分枝次桿菌的配新鮮培蛛養(yǎng)物（泉初生長騾2周）丸無須二恨次傳代齡即可做孔藥敏試押驗，初察生長２脊周以后些和貯存蔽培養(yǎng)物尺須在改巷良羅氏炮培養(yǎng)基吩上二次好傳代，卷取２～較３周的椒亞培養(yǎng)偽物進行開試驗。（2）取洞上述培養(yǎng)菊物（須刮黨取斜面各皇個部分的蒸培養(yǎng)物）瞧置于玻璃健磨菌器底跳部，插入俗磨菌棒捻攻動使成乳首酪狀，以未0.５％Twee墊n-80生理鹽水徐磨菌稀釋贈，與標準犧麥氏比濁蘋管（Mac招Faa溝rla史nd獲No.咱1）比濁，即碧配成１mg/m早l的菌懸尋液。比例法地藥敏試粗驗2.稀斗釋（1）當菌液稀爸釋：靜正置片刻汪，使菌余液中的姻顆?；蛎鷫K沉晌淀后，幟用刻度棵吸管或什22號爺標準接萄種環(huán)將糧１mg/m乒l的菌液上呼清逐步稀蘆釋至0.作01mg/取ml和0.屈1mg/本ml。(a)象:22號接種救環(huán)10賢0倍稀扣釋法：用2紹2號標虹準接種宜環(huán)沾取爺2滿環(huán)頁１mg/m愚l的菌液閑，移至悉2ml滅菌生業(yè)理鹽水絨中，即待稀釋成敏0.0蓬1mg/步ml菌液；兄用同樣焦方法再哥進行1緒00倍中稀釋，軟即成1洽0-4mg/壤m(xù)l菌液（注賢：22號揭標準接種肢環(huán)：金屬昨絲直徑0掀.7mm,接種環(huán)深內徑3mm，滿環(huán)移液疲0.01ml）。比例法藥言敏試驗2.稀釋(b)微量吸管位10倍稀找釋法：用無菌待微量刻度妖吸管吸取極0.5ml上述1mg/m存l菌懸液至漢4.5滅己菌生理鹽版水中，即億可得到0虜.1mg/m當l菌液.按炎上述方法廟連續(xù)進行傳10倍稀嗽釋，可得丸到10-2mg/斧ml和10-4mg/m駕l的菌液旋。比例法藥盜敏試驗3.接蛾種:用拔22號角標準接窯種環(huán)分染別沾取鳥1環(huán)(作即0.意01ml)10-2mg/m耗l和10-4mg/m獅l的菌液，鋸用劃線法寺均勻接種城至對照及疏含藥培養(yǎng)碑基表面，烘應注意使垃菌液盡可促能均勻分滅散于培養(yǎng)緒基斜面。嫂最終接種臨量為10-4mg和10-6mg。4.培養(yǎng)才:接種后勞的培養(yǎng)基誘置于37舊℃培養(yǎng)斷，4周后翁報告結果定。比例法偷藥敏試燃驗結果報告屆及解釋1.按以頁下方式記明錄菌落生攔長情況.(1)少鳥于50個舒菌落:膏報實際菌蓬落數(shù)(2)5貓0~10翁0個菌落慣:漁1罷+(3)但100沉~20柱0個菌余落:渡2+(4)愚大部分滅融合(挽200釣~50貧0個菌蕉落):蛇3+(5)融鹽合(大于積500個脖菌落):輝4+比例法潔藥敏試償驗結果報告賣及解釋2.計譯算耐藥扮百分比側:耐藥百分班比=含藥侮培養(yǎng)基上培生長的菌騎落數(shù)/對概照培養(yǎng)基盛上菌落數(shù)*10元0%若耐藥百顏分比大于餅1%，則屬認為受試姻菌對該抗打結核藥耐瓶藥。比例法藥非敏試驗質量控節(jié)制1.若顏高稀釋逮度菌液稼(10-4mg/m萌l)在對駝照培養(yǎng)喬基上生右長的菌驅落數(shù)少罰于20倍個菌落窩，則應找從對照你管傳代酸培養(yǎng)，都重復試卻驗。2.每并批試驗營以結核鍵分枝桿筍菌參考著菌株(H37RV)1慢0-3mg檢測含評藥培養(yǎng)蓄基的質陶量。附：麥馳氏1號園比濁管勢的制備：0.喂1ml1隆%氯化鋇(BaC表l2)加入9堆.9ml1光%硫酸(H2SO4)，封口，躁比濁前乒搖勻。藥敏試驗活流程2~3周嘩新鮮純培養(yǎng)斃物磨菌，立制備１mg/混ml的菌液稀釋至收適當濃營度接種適當系菌量至含藥培媽養(yǎng)基和對照天斜面37℃培養(yǎng)4龍周報告結果藥敏試驗勺準備比例法結鞭果判讀舉加例接種量對照INHEMB10-4+++++310-62690耐藥百分數(shù)（%）34.60.1判度結果耐藥（R）敏感（s）藥敏試驗密注意事項培養(yǎng)基制桑備：（1）藥生物稱量、問效價計算爐、溶解、峽稀釋要準名確；（2）用差標準化的研儀器和材始料：培養(yǎng)傅基蒸汽凝喪固滅菌器糧，螺旋蓋吐培養(yǎng)管；（3）欠凝固滅漲菌時間賀、溫度禽嚴格掌朗握；（4）每訪次制作培劃養(yǎng)基應表躲明批次，尖使用時用H37RV敏感株容作為敏寧感對照天考核含增藥培養(yǎng)化基的質繪量。藥敏試戒驗注意途事項試驗操宵作：（1）應沉在生物安驕全操作臺秧內進行操總作；（2）落要使用混標準化權的磨菌敗管、吸可管、接煉種環(huán)進歷行稀釋洲和接種鑰；（3）要報使用新鮮混菌落，取誼菌落時要依刮取整個過斜面，不灰要只取單扮個菌落；（4）菌蛛液制備、估稀釋、接個種要力求領準確，以茶保證接種陪量在要求慮范圍內；（5）煌注意觀鄭察溫箱龜溫度。藥敏試挨驗方法而局限性在得到雪純細菌澆的培養(yǎng)漢物后仍貞需4周病可報告關結果，蹤蝶遠遠滯誼后于臨此床診治爪的需要訪；試驗比較瘡煩瑣，結帥果受多種撒因素影響禿，可重復職性較差；實驗室耐誓藥與臨床演耐藥之間肉有一定的抓差距。噬菌體甲法將分枝桿逐菌噬菌體迅感染結核廚分枝桿菌律，未進入遭菌體內的哄噬菌體用卵特異的抗菊噬菌體物休質滅活，鬧進入菌體浸內的噬菌悅體得到保置護而復制言增殖，溶啄菌后釋放陵子代噬菌洽體，將此地噬菌體與斤相應的結尼核分枝桿乓菌混合，狼接種在固要體培養(yǎng)基惹上培養(yǎng)，笛觀察蝕斑法的產生。牲蝕斑的數(shù)侍量與噬菌革體數(shù)量有跟關，也與茂臨床標本銳中活的結歌核分枝桿敘菌有關。如果用噬逐菌體做藥器敏試驗，鑰若有耐藥奔結核分枝側桿菌存在影，細菌能炕存活，會白出現(xiàn)蝕斑占，蝕斑的蠢數(shù)量與在約含抗結核顫藥物培養(yǎng)浴基上存活充的結核分購枝桿菌有扭關。分枝桿菌借菌種鑒定詠的意義非結核宗分枝桿袖菌的發(fā)依病率在網(wǎng)不同的榴國家、丈不同的徑地區(qū)報犬告差別幣很大。地據(jù)資料斷報道，書日本在林198固0年報壁告：在普分枝桿網(wǎng)菌感染庫中，非筆結核分嘩枝桿菌魔的發(fā)病鑄率為1曲2%，棚并有逐駕年上升號趨勢，徒其中主丘要為鳥昨胞內復帖合群，耕高達8若9.6%，其次夾為堪薩車斯占8.0%我國年挎對非結糟核分枝棚桿菌的賄研究資末料尚不父充足，嚷也缺乏文較大規(guī)宜模的流芝調，據(jù)些報告非孤結核分戶枝桿菌陷在我國呆的發(fā)病店率占分歌枝桿菌謹?shù)?.3%左右。分枝桿菌江菌種鑒定躍的意義一般來說乞，非結核來分枝桿菌董對抗結核棉藥物的敏惱感性低于脖結核菌，憶但各型和違各菌株之須間對藥物星的敏感性敘差別甚大遙。分枝桿鞠菌菌種狗鑒定形態(tài)學菌落形粱態(tài)、顏幼色生長條件28℃生長試提驗，結核疤分枝桿菌只在28℃的孵測育環(huán)境彎中不能傍生長；由而TNM菌群的窄大部分饑分枝桿奧菌可以才生長。生化反應硝酸還原、煙酸試悶驗酶尿素酶熱耐熱觸酶分子生桂物學方廳法分枝桿訪菌菌種株鑒定分枝桿菌怖菌群鑒定粗的目的既撤是鑒定菌閱株屬于結叮核分枝桿帖菌復合群喉還是非結乖核分枝桿晌菌，也是喉進一步菌愉種鑒定的障基礎。分枝桿菌課臨床分離姿株藥物敏羨感性試驗毛應與菌種跡初步鑒定秧同步進行達，以對硝請基苯甲酸剝（PNB）、噻吩-州2-羧酸狠肼（TCH零）鑒別培養(yǎng)膽基初步鑒界別結核分炸枝桿菌、種牛分枝桿廁菌和非結校核分枝桿賣菌鑒別培伐養(yǎng)基的芽制備過練程略。分枝桿界菌菌種飛初步鑒精定分枝桿菌PNBTCH28℃生長耐熱觸酶硝酸還原煙酸試驗牛分枝桿菌——————結核分枝桿菌—+————

NTM++++++分枝桿菌情菌種鑒定班質量控制欄要求經(jīng)過初步回鑒定的分累枝桿菌，胳需進一步業(yè)進行菌種叮鑒定，可趕送上一級固實驗室。鑒別菌爐株應生發(fā)長旺盛蜂，生長糟時間為胃3~4榆周為宜精。所有培養(yǎng)三基、試劑候應在規(guī)定露期限內使駕用。所有試翼劑均應碼用標準述菌株對留照試驗腸合格后偷使用。分枝桿鏡菌細菌副庫的建騎立分枝桿土菌菌株湖庫是結筐核病控榨制、流傅行病學佳檢查及覺開展進錫一步檢罩測和研冊究的基監(jiān)礎。通盆過對菌領株庫的益基因分搬型和耐門藥性檢瞇測，可御以發(fā)現(xiàn)紙本地區(qū)藍菌株流釀行情況的，調查界耐藥性名趨勢，按為結核船病控制核、流行套病學提國供細菌豪學方面趟的依據(jù)損。菌種保祝存決不抗是簡單取的對臨互床標本短的單純獨的存放霸。菌株搜貯存要播求有嚴最格的貯禿存條件掘，嚴密畜的貯存丹程序，斧入庫菌求株須專史人負責宇，嚴格處按照各班程序進桐行管理醋，每份竹菌株入譽庫、凍檢存、貯笛藏、管鄭理各環(huán)享節(jié)操作浸必須二所人同時具進行，血以確保躍菌住質律量，數(shù)爆據(jù)準確寄無誤。分枝桿待菌細菌嗚庫的建譜立細菌庫程貸序分三部咬分：一、菌霸株貯存遍試驗程獎序包括貯廊存試劑爪（如7H9液體培基匙）的配制縫、菌株凍泰存管編號碑、凍存試恐驗等。每寬批凍存菌痕株實驗狀瓜況、凍存保障礙、實補驗人、凍測存菌株庫榴號、凍存送菌株質控果管號等情饅況須