第十七章 流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用

第十七章流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用第1頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。第2頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第3頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA,RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性第4頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三采用激光作為激發(fā)光源，利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，一、工作原理第5頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（1）液流系統(tǒng)（2）光學(xué)系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)：第6頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三由樣本和鞘液組成待測(cè)細(xì)胞 單個(gè)細(xì)胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流（1）液流系統(tǒng)第7頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周?chē)?，保持樣本流中?xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

第8頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三噴嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系統(tǒng)示意圖第9頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管鞘液管第10頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長(zhǎng)/短波長(zhǎng)，通過(guò)短/長(zhǎng)波長(zhǎng)光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），F(xiàn)L1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學(xué)系統(tǒng)第11頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學(xué)系統(tǒng)示意圖第12頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第13頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基本工作原理第14頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三單細(xì)胞液柱已標(biāo)記的單細(xì)胞懸液和鞘液硅化管流動(dòng)室噴嘴熒光檢測(cè)系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號(hào)熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號(hào)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過(guò)程第15頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三區(qū)別流式細(xì)胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對(duì)象細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、組織等承載工具鞘液及流動(dòng)室載玻片檢測(cè)信號(hào)光學(xué)信號(hào)形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學(xué)放大統(tǒng)計(jì)計(jì)算機(jī)，>5000人工，200結(jié)果多參數(shù)，綜合分析簡(jiǎn)單，單參數(shù)流式細(xì)胞儀與顯微鏡的區(qū)別第16頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周?chē)?60°立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。二、散射光的測(cè)定第17頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第18頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。第19頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三FALSSensorLaser前向散射光示意圖第20頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。第21頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光示意圖第22頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。此為血細(xì)胞分類(lèi)的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

第23頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)第24頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第25頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光補(bǔ)償?shù)?6頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。四、細(xì)胞分選原理第27頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)不充電充電（一）分選基本原理第28頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖）設(shè)門(mén)分析技術(shù)第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析第29頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、參數(shù)第30頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點(diǎn)圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析直分析方圖設(shè)門(mén)分析:REGION和GATE設(shè)置二、數(shù)據(jù)顯示方式第31頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖第32頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量信道(channel)第33頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1.雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度第34頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖第35頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析第36頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門(mén)的形狀又分為了線性門(mén)、矩形門(mén)、圓形門(mén)、多邊形門(mén)、任意形狀門(mén)和十字門(mén)。三、設(shè)門(mén)分析技術(shù)第37頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三A淋巴細(xì)胞B單核細(xì)胞C中性粒細(xì)胞A、B、C均為任意門(mén)第38頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三線性門(mén)第39頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Region設(shè)置:

區(qū)閾（region,R）與門(mén)(gate,G)是兩個(gè)相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門(mén)對(duì)應(yīng)，但是也可以包含于門(mén)。第40頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字門(mén)分析時(shí)，起就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。

第41頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三樣本制備標(biāo)記染色液相芯片技術(shù)質(zhì)量控制第四節(jié)流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求

第42頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備 分離單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備蛋白酶消化機(jī)械吹打使貼壁細(xì)胞脫落 洗滌尼龍網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液一、免疫檢測(cè)樣品制備第43頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備機(jī)械法酶處理法化學(xué)試劑處理法表面活性劑處理法單細(xì)胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）第44頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三適用條件:有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對(duì)488nm的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色第45頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細(xì)胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類(lèi)（一）幾種常見(jiàn)的熒光染料第46頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三名稱(chēng)染料激發(fā)波長(zhǎng)熒光顏色溶解性對(duì)PH敏感性特點(diǎn)異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類(lèi)熒光染料第47頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過(guò)一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。能量傳遞復(fù)合染料第48頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制第49頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)在免疫學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用第50頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三T淋巴細(xì)胞及其亞群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細(xì)胞及其亞群分析

B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生IgM型自身抗體,參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)

B2(CD19+CD5-):受外來(lái)抗原刺激,產(chǎn)生高親和性特異性抗體NK細(xì)胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析第51頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗(yàn)(死細(xì)胞與活細(xì)胞比例)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定二、淋巴細(xì)胞功能分析三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型對(duì)淋巴瘤和白血病進(jìn)行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預(yù)后及檢出微小殘留病變第52頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三CD4+Th細(xì)胞、CD4+/CD8+比例

MDR(+)表示對(duì)化療藥物耐藥四、腫瘤耐藥基因分析五、AIDS病檢測(cè)中的應(yīng)用第53頁(yè)，共55頁(yè)，2023年，2月20日，星期三HLA-B27可出現(xiàn)在