第十七章 流式細胞儀分析技術及應用

第十七章流式細胞儀分析技術及應用第1頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三流式細胞術(flowcytometry,FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和分選的新技術。第2頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三第3頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三細胞組成細胞功能大小細胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細胞活性DNA,RNA含量胞內細胞因子蛋白質含量激素結合位點鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細胞儀常檢測的細胞特性第4頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三采用激光作為激發(fā)光源，利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析，一、工作原理第5頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三（1）液流系統（2）光學系統（3）數據處理系統1.流式細胞儀的基本結構：第6頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三由樣本和鞘液組成待測細胞 單個細胞的懸液 熒光染料標記的單抗對其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流（1）液流系統第7頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

第8頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三噴嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系統示意圖第9頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三FCM的液流系統（如何形成單個細胞流）樣本管鞘液管第10頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學系統第11頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學系統示意圖第12頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三主要由計算機及其軟件組成（3）數據處理系統第13頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三基本工作原理第14頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統和散射光感受系統收集光信號熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號計算機系統分析結果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過程第15頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三區(qū)別流式細胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學信號形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學放大統計計算機，>5000人工，200結果多參數，綜合分析簡單，單參數流式細胞儀與顯微鏡的區(qū)別第16頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內顆粒折射等有關，主要分為前向散射光和側向散射光。二、散射光的測定第17頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三第18頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。第19頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三FALSSensorLaser前向散射光示意圖第20頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三

側向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內部結構屬性。第21頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三FALSSensor90LSSensorLaser側向散射光示意圖第22頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三

測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

第23頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)第24頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三第25頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三熒光補償第26頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。四、細胞分選原理第27頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉落入收集器壓電晶體產生機械振動不充電充電（一）分選基本原理第28頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三參數：FS,SS,FL數據顯示方式（單參數直方圖、雙參數散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數散點圖）設門分析技術第二節(jié)數據的顯示與分析第29頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內部結構復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少一、參數第30頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三單參數直方圖雙參數直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數直方圖多參數分析直分析方圖設門分析:REGION和GATE設置二、數據顯示方式第31頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三

由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。（一）單參數直方圖第32頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三單參數直方圖細胞相對數量信道(channel)第33頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三1.雙參數直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度第34頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三雙參數直方圖點圖第35頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據需要進行組合分析。（四）流式細胞儀的多參數分析第36頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數組合的直方圖只體現這群細胞的分布情況。根據門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。三、設門分析技術第37頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞A、B、C均為任意門第38頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三線性門第39頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三Region設置:

區(qū)閾（region,R）與門(gate,G)是兩個相關的概念，區(qū)閾可與門對應，但是也可以包含于門。第40頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字門分析時，起就可以由四個區(qū)域構成，即G=D1+D2+D3+D4。

第41頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三樣本制備標記染色液相芯片技術質量控制第四節(jié)流式細胞儀免疫分析的技術要求

第42頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三外周血淋巴細胞樣品的制備 分離單個核細胞培養(yǎng)細胞的樣品制備蛋白酶消化機械吹打使貼壁細胞脫落 洗滌尼龍網過濾單細胞懸液一、免疫檢測樣品制備第43頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三新鮮實體組織單細胞懸液的制備機械法酶處理法化學試劑處理法表面活性劑處理法單細胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）第44頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三適用條件:有較高的量子產額和消光系數對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差易與標記單抗結合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標記染色第45頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復合染料藻膽蛋白類（一）幾種常見的熒光染料第46頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯后量子產額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團，消光系數和量子產額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料第47頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三

用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復合染料第48頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復合染料機制第49頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)在免疫學檢驗中的應用第50頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三T淋巴細胞及其亞群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細胞及其亞群分析

B1(CD19+CD5+):產生IgM型自身抗體,參與免疫調節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關

B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激,產生高親和性特異性抗體NK細胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴細胞及其亞群的分析第51頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三細胞介導細胞毒性試驗(死細胞與活細胞比例)細胞內細胞因子測定二、淋巴細胞功能分析三、淋巴造血系統及白血病免疫分型對淋巴瘤和白血病進行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預后及檢出微小殘留病變第52頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三CD4+Th細胞、CD4+/CD8+比例

MDR(+)表示對化療藥物耐藥四、腫瘤耐藥基因分析五、AIDS病檢測中的應用第53頁，共55頁，2023年，2月20日，星期三HLA-B27可出現在