第一章細(xì)胞的分離與胞內(nèi)詳解

第一章細(xì)胞的分離與胞內(nèi)詳解演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)優(yōu)選第一章細(xì)胞的分離與胞內(nèi)目前二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)第一節(jié)細(xì)胞分離細(xì)胞分離的目的

（1）胞內(nèi)目標(biāo)物的獲?。壕w或細(xì)胞通過(guò)物理或化學(xué)方法處理后釋放目標(biāo)產(chǎn)物，然后除去細(xì)胞或碎片后進(jìn)一步分離純化就可得到胞內(nèi)目標(biāo)物。

（2）胞外目標(biāo)物的獲?。褐苯永蒙镌弦夯蚺囵B(yǎng)液進(jìn)行分離純化可得到胞外目標(biāo)物。目前三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)細(xì)胞分離的主要技術(shù)手段一、重力沉降二、離心沉降三、過(guò)濾目前四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)一、重力沉降概念：指因組成懸浮系的流體和懸浮物具有密度差，在重力場(chǎng)中發(fā)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，因而得到分離的沉降操作。菌體和動(dòng)植物細(xì)胞的重力沉降特點(diǎn)：簡(jiǎn)便易行；但菌體細(xì)胞體積很小，沉降速度很慢。因此需使菌體細(xì)胞聚并成較大凝聚體顆粒后再進(jìn)行沉降操作，提高沉降速度。措施：加入中性鹽、聚丙烯酰胺等高分子絮凝劑

目前五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)固體顆粒勻速沉降時(shí)的沉降速度為dp2（ρS－ρL）gvg＝18μL其中：dp為固體顆粒粒徑；

ρS為固體密度；

ρL為液體密度；g為重力加速度，9.81；

μL為液體粘度目前六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)二、離心沉降（一）離心分離原理（二）離心分離方法（三）離心分離設(shè)備目前七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（一）離心分離原理離心沉降是在離心力的作用下發(fā)生的單位質(zhì)量的物質(zhì)所受到的離心力：式中：

r為離心半徑，即從旋轉(zhuǎn)軸心到沉降顆粒的距離；ω為旋轉(zhuǎn)角速度；

N為離心機(jī)的轉(zhuǎn)數(shù)，s－1目前八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)分離因子Z定義：離心設(shè)備所能達(dá)到的離心力/重力加速度(g)的比值

意義：衡量離心設(shè)備的離心程度的重要技術(shù)參數(shù)，用于離心機(jī)的分類(lèi)一般將Zg稱(chēng)作離心力，離心設(shè)備的旋轉(zhuǎn)半徑越大，轉(zhuǎn)數(shù)越高，離心力越大目前九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)固體顆粒離心沉降速度：式中：dp為固體顆粒粒徑ρs為固體密度ρL為液體密度μL為液體粘度目前十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)Vs還可用下式表示：其中S稱(chēng)為沉降系數(shù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量越大，沉降系數(shù)越大目前十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（二）離心分離方法（1）差速離心分級(jí)（2）區(qū)帶離心目前十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（1）差速離心分級(jí)差速離心是生化工業(yè)中最常用的離心分離方法如以菌體細(xì)胞的收集或除去為目的的固液離心分離；菌體和細(xì)胞一般在500-5000g的離心力下就可完全沉降；工業(yè)規(guī)模的離心操作中，為提高分離速度，所用離心力較大。目前十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過(guò)程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開(kāi)，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。目前十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)目前十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)操作中，根據(jù)實(shí)際物系的特點(diǎn)（目標(biāo)產(chǎn)物和其他組分的性質(zhì)和相互作用等）、分離的目的和所需分離的程度，選擇適當(dāng)?shù)牟僮鳁l件（離心轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間），可使料液中的不同組分得到分級(jí)分離。目前十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（2）區(qū)帶離心用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離純化，但處理量小，一般僅限于實(shí)驗(yàn)室水平。方法：事先在離心管中用某種低分子溶質(zhì)（如蔗糖、CsCl、NaBr溶液）調(diào)配好密度梯度，在密度梯度之上加待處理的料液后進(jìn)行離心操作。分為：差速區(qū)帶離心、平衡區(qū)帶離心目前十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)差速區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心的密度梯度中的最大密度小于待分離的目標(biāo)產(chǎn)物的密度。離心時(shí)，由于離心力的作用，顆粒離開(kāi)原樣品層，按不同沉降速率沿管底沉降。離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開(kāi)，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降的越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，則在較上部分依次出現(xiàn)。目前十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)目前十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)平衡區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心的密度梯度比差速區(qū)帶離心的密度梯度高，離心操作的結(jié)果使料液中的高分子溶質(zhì)在與其自身密度相等的溶劑密度處形成穩(wěn)定的區(qū)帶，區(qū)帶中的溶質(zhì)濃度以該密度為中心，呈Gauss分布。目前二十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（三）離心分離設(shè)備按設(shè)備所能達(dá)到的離心力或離心轉(zhuǎn)數(shù)分類(lèi)：低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)項(xiàng)目低速離心機(jī)高速離心機(jī)超速離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)(r/min)2000－600010000－2600030000－120000離心力(g)2000－70008000－80000100000－600000適細(xì)胞應(yīng)細(xì)胞核范細(xì)胞器圍蛋白質(zhì)適用適用適用適用適用適用適用適用適用目前二十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)冷凍高速離心機(jī)目前二十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)按用途分類(lèi)：1)分析性：一般都帶有光學(xué)系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，依據(jù)待測(cè)物質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為（用離心機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)），能推斷物質(zhì)的純度、形狀和分子量等。

分析性離心機(jī)都是超速離心機(jī)。

2)制備性：主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大。實(shí)驗(yàn)室用；工業(yè)用目前二十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)按工業(yè)應(yīng)用分類(lèi):1)管式離心機(jī)2)碟片式離心機(jī)目前二十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)管式離心機(jī)又稱(chēng)圓筒式離心機(jī)，結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單操作時(shí)，料液從圓管下端的中心輸入，在離心力作用下，管內(nèi)液體基本上是以旋轉(zhuǎn)軸為中心的圓筒面，從上端的中心排出輕相（上清液）。固液分離（間隙操作）液液分離（連續(xù)操作）目前二十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)間隙操作時(shí)，固體顆粒沉降于管壁；連續(xù)操作時(shí)，從管壁附近的出口排出重相（濃縮的懸浮液）應(yīng)用：液-液分離(連續(xù)式)；低固體含量(<1%)的固-液分離(間歇式)優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)廉；分離效果好，分離因子高（8000－15000g）缺點(diǎn)：沉降面積小，處理能力有限；低固體含量的懸浮液(<1%)目前二十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)設(shè)管長(zhǎng)為L(zhǎng)；離心機(jī)的旋轉(zhuǎn)軸心到液面的距離為r1；轉(zhuǎn)筒內(nèi)徑為r2；Vg為粒子的重力沉降速度則使兩相完全分離的最大處理流量（即離心機(jī)的處理能力）為：目前二十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)在離心操作中，r1和r2近似相等，上式可簡(jiǎn)化為設(shè)：則：∑具有面積的單位，稱(chēng)為離心沉降面積，是離心機(jī)結(jié)構(gòu)和操作條件的函數(shù)。以上計(jì)算的處理能力是理論值，而實(shí)際處理能力一般低于理論值，需乘以一個(gè)校正系數(shù)ε，實(shí)際處理能力：目前二十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)碟片式離心機(jī)又稱(chēng)分離板式離心機(jī)離心轉(zhuǎn)子中有許多等間隙的碟形分離板，以增大沉降面積，提高處理能力目前二十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)操作過(guò)程中，料液從中心進(jìn)料口輸入，通過(guò)轉(zhuǎn)子底部的液孔進(jìn)入分離板外徑處，進(jìn)入分離板的間隙。輕相通過(guò)分離板的間隙向轉(zhuǎn)子上部出口排出。以連續(xù)操作為目的的碟片式離心機(jī)設(shè)有連續(xù)排出重相（濃縮懸浮液）的噴嘴。連續(xù)操作時(shí)，重相從噴嘴連續(xù)噴出。特點(diǎn)：碟片式離心機(jī)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，離心轉(zhuǎn)速一般較管式離心機(jī)低，但沉降面積大，處理能力強(qiáng)。目前三十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)離心設(shè)備的選擇

基本參數(shù)選擇

顆粒d,固液差, 基本型號(hào)固體物濃度 亞型 產(chǎn)物熱穩(wěn)定性 低溫離心 流量Q,規(guī)模 規(guī)格、臺(tái)數(shù) 活cell密封滅菌設(shè)計(jì)目前三十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)三、過(guò)濾定義：利用薄片形多孔性介質(zhì)（如濾紙）截留固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固液分離的方法稱(chēng)為過(guò)濾（filtration）。過(guò)濾介質(zhì)：1）無(wú)定形顆粒：顆?；钚蕴?、沙、無(wú)煙煤2）成形顆粒：燒結(jié)金屬、燒結(jié)塑料3）非金屬織物：尼龍、玻璃纖維4）金屬織物：不銹鋼絲網(wǎng)5）無(wú)紡品：紙、石棉目前三十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（一）過(guò)濾基礎(chǔ)理論過(guò)濾時(shí)濾液的透過(guò)速度：dQA△pdtμL(Rm+Rc)式一式中：Q為濾液體積，m3；A為過(guò)濾面積，m2；△p為操作壓力，pa；

μL為濾液的粘度，pa×s；Rm和Rc分別為介質(zhì)和濾餅的阻力，m-1=目前三十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)濾餅阻力Rc與濾餅干重W（kg）之間有如下關(guān)系：

Rc＝αW/A式二式中：α為濾餅的平均比阻，m/kg。1）不可壓縮性濾餅（如堅(jiān)硬的乳膠粒子）α為常數(shù)2）可壓縮性濾餅（如菌體、細(xì)胞）α＝k△pm；其中：m為壓縮指數(shù)，一般在0.3－1.2之間；對(duì)于一定的料液，k為常數(shù)。

由此可知，可壓縮濾餅的比阻值α隨壓力提高而增大。在過(guò)濾操作中，一般需緩慢增大操作壓力，最終壓力不能超過(guò)0.3－0.4MPa目前三十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)隨著過(guò)濾操作的進(jìn)行，濾餅干重w不斷增加，與濾液體積Q之間有如下關(guān)系：w＝ρLQcs/(1-βcs)式三式中：ρL為濾液密度；cs為料液中形成濾餅的固形成分含量；

β為濕濾餅和干濾餅的質(zhì)量比將式三代入式二，得到Rc的表達(dá)式：同時(shí)Rm用相同形式表達(dá)：式中：Q0為形成相當(dāng)于過(guò)濾介質(zhì)阻力的濾餅時(shí)透過(guò)的虛擬濾液體積，特定過(guò)濾介質(zhì)的Q0值為常數(shù)目前三十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)最后把Rc、Rm代入式一，得過(guò)濾基本方程：

式四目前三十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)Ruth恒壓過(guò)濾方程恒壓操作條件下積分式四，得Ruth恒壓過(guò)濾方程：（Q＋Q0）2＝K（t＋t0）式五其中

K稱(chēng)為Ruth恒壓過(guò)濾系數(shù)

t0為透過(guò)虛擬濾液量Q0所需的虛擬時(shí)間微分式五可得：目前三十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)恒速過(guò)濾恒壓過(guò)濾操作中濾餅阻力不斷上升，過(guò)濾速度不斷下降。采用往復(fù)式恒流泵可進(jìn)行恒速過(guò)濾，其間操作壓力不斷上升。目前三十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（二）懸浮液的預(yù)處理提高過(guò)濾速度和過(guò)濾質(zhì)量是過(guò)濾操作的目標(biāo)。由于濾餅阻力是影響過(guò)濾速度的主要因素，因此在過(guò)濾操作前，一般要對(duì)濾液進(jìn)行預(yù)處理，改變料液的物理性質(zhì)（黏度、顆粒、顆粒穩(wěn)定性等），降低濾餅的阻力，固液分離速度，分離器分離效率。目前三十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)預(yù)處理方法加熱：最簡(jiǎn)單和最廉價(jià)的處理方法。黏度、促凝聚、固體成分體積、破壞凝膠結(jié)構(gòu)、增加空隙率調(diào)pH值：方法簡(jiǎn)單有效、成本低廉凝聚：在凝聚劑(如鋁鹽、鐵鹽、石灰和NaCl)作用下，細(xì)胞蛋白質(zhì)等膠體去穩(wěn)定，并聚集成1mm大小的凝聚塊的過(guò)程。

機(jī)理：破壞雙電層，水解后膠體吸附，氫鍵結(jié)合等。目前四十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)絮凝：在絮凝劑高分子聚合電解質(zhì)的作用下，膠體顆粒和聚合電解質(zhì)交連成網(wǎng)，形成10mm大小的絮凝團(tuán)過(guò)程。

絮凝劑：如聚丙烯酰胺、聚二烯丙基四胺、環(huán)氧化乙烯。

機(jī)理：絮凝劑主要起中和電荷、橋架和網(wǎng)絡(luò)作用惰性助濾劑：一種顆粒均勻、質(zhì)地堅(jiān)硬的粒狀物質(zhì)，用于擴(kuò)大過(guò)濾表面的適應(yīng)范圍，減輕細(xì)小顆粒的快速擠壓變形和過(guò)濾介質(zhì)的堵塞。

使用方法：預(yù)涂層；按一定比率混合。

助濾劑種類(lèi)：硅藻土、纖維素、未活化的炭、爐渣、重質(zhì)碳酸鈣等。目前四十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（四）過(guò)濾設(shè)備生化工業(yè)中常用的過(guò)濾設(shè)備主要有加壓葉濾機(jī)、板框過(guò)濾機(jī)、旋轉(zhuǎn)真空過(guò)濾機(jī)等。如何選擇過(guò)濾器？1、濾液的澄清度2、顆粒大小的分布3、發(fā)酵液的黏度4、固體顆粒的濃度5、濾餅的干燥度6、濾餅的洗滌7、生產(chǎn)能力FiltingmediumTypeofFilterOtherrequirements目前四十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)第二節(jié)細(xì)胞破碎許多生物產(chǎn)物在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中保留在細(xì)胞內(nèi)，如一些胞內(nèi)酶、大部分外源基因表達(dá)產(chǎn)物和植物細(xì)胞產(chǎn)物等。這些產(chǎn)物在收集菌體或細(xì)胞后，需破碎細(xì)胞，使目標(biāo)產(chǎn)物選擇性地釋放到液相。破碎的細(xì)胞或其碎片去除后，上清液用于進(jìn)一步的分離純化。目前四十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)一、細(xì)胞破碎和產(chǎn)物釋放原理細(xì)胞破碎主要采用各種機(jī)械破碎法和化學(xué)破碎法，或兩種方法結(jié)合。機(jī)械破碎中細(xì)胞所受的機(jī)械作用力：壓縮力和剪切力?；瘜W(xué)破碎又稱(chēng)化學(xué)滲透，利用化學(xué)或生化試劑（酶）改變細(xì)胞壁或膜的結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)的溶解速率；或者完全溶解細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體后，在滲透壓作用下使細(xì)胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)。目前四十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)目前四十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)二、細(xì)胞破碎技術(shù)機(jī)械破碎法化學(xué)法物理滲透法高壓勻漿酸堿處理滲透壓沖擊法珠磨法化學(xué)試劑處理凍結(jié)－融化法噴霧撞擊破碎酶溶超聲波破碎目前四十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（一）高壓勻漿高壓勻漿又稱(chēng)高壓剪切破碎破碎原理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速?lài)姵龊笞矒舻脚鲎箔h(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。目前四十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)高壓勻漿法適用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎，料液細(xì)胞質(zhì)量濃度可達(dá)到200g/L。團(tuán)狀和系狀菌易造成高壓勻漿器堵塞，不宜使用高壓勻漿法。高壓勻漿過(guò)程伴隨溫度上升，為保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性，需對(duì)料液作冷卻處理。適用范圍及注意事項(xiàng)目前四十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（二）珠磨原理：珠磨機(jī)的破碎室內(nèi)填充玻璃或氧化鋯微珠。在攪拌槳的高速攪拌下微珠高速運(yùn)動(dòng)，微珠之間以及微珠和細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細(xì)胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。WSK臥式高效全能珠磨機(jī)目前四十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)珠磨破碎操作的有效能量利用率僅為1％左右，破碎過(guò)程產(chǎn)生大量的熱能。因此在設(shè)計(jì)操作時(shí)應(yīng)充分考慮換熱能力問(wèn)題。珠磨法適用于絕大多數(shù)微生物細(xì)胞的破碎，但與高壓勻漿法相比，影響破碎率的操作參數(shù)較多，操作過(guò)程的優(yōu)化設(shè)計(jì)較復(fù)雜。目前五十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（三）噴霧撞擊破碎原理：細(xì)胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)，形成粒徑小于500μm的微粒子。高速載氣（如氮?dú)猓鼋Y(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生破碎。目前五十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1）將細(xì)胞冷凍使其成為剛性球體，降低破碎難度2）細(xì)胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的一瞬間，破碎程度均勻，避免細(xì)胞反復(fù)受力發(fā)生過(guò)度破碎3）細(xì)胞破碎程度可通過(guò)調(diào)節(jié)載氣流速控制，避免細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，適用于細(xì)胞器的回收目前五十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（四）超聲波破碎原理：利用發(fā)射超聲波的探頭處理細(xì)胞懸浮液，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。優(yōu)缺點(diǎn)：破碎強(qiáng)烈，適用于多數(shù)微生物的破碎。但有效能量利用率極低，操作過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，對(duì)冷卻的要求苛刻，所以不易放大，主要用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。目前五十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)超聲波破碎儀目前五十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)化學(xué)和生物化學(xué)滲透酸堿處理：調(diào)節(jié)pH值，提高目標(biāo)產(chǎn)物溶解度化學(xué)試劑處理：用表面活性劑（如十二烷基硫酸鈉）、螯合劑（如EDTA）、鹽或有機(jī)溶劑處理細(xì)胞，可增大細(xì)胞壁通透性。尿素等變性劑能破壞氫鍵作用，降低胞內(nèi)產(chǎn)物之間的相互作用，使之容易釋放。酶溶：利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。如：溶菌酶、纖維素酶。目前五十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)機(jī)械法和化學(xué)法的比較機(jī)械破碎法缺點(diǎn)：A、高能、高溫、高噪音、高剪切力，易使產(chǎn)品變性失活；B、非專(zhuān)一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難；C、細(xì)胞碎片大小不一，難分離。化學(xué)破碎法缺點(diǎn)：A、費(fèi)用高；B、化學(xué)或生化試劑的添加引起新的污染；C、破碎速度低，效率差，一般只有有限的破碎，常與機(jī)械法連用。目前五十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)物理滲透法滲透壓沖擊法：將細(xì)胞置于高滲透壓的介質(zhì)中，達(dá)到平衡后，將介質(zhì)突然稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖溶液中。在滲透壓的作用下，水滲透通過(guò)細(xì)胞壁和膜進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞壁和膜膨脹破裂。凍結(jié)－融化法：將細(xì)胞急劇冷凍后在室溫緩慢融化，此凍結(jié)－融化操作反復(fù)進(jìn)行多次，使細(xì)胞受到破壞。優(yōu)點(diǎn)：條件比較溫和，有利于目標(biāo)產(chǎn)物的高活力釋放回收。缺點(diǎn)：破碎效率較低、產(chǎn)物釋放速度低、處理時(shí)間長(zhǎng)、不適于大規(guī)模細(xì)胞破碎，局限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的小批量使用。目前五十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)三、破碎技術(shù)研究應(yīng)注意的問(wèn)題（一）破碎技術(shù)對(duì)下游分離技術(shù)的影響。破碎顆粒清除，產(chǎn)物的分離純化（二）在發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過(guò)程和環(huán)境對(duì)破碎難易程度的影響（三）菌種的培育，胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物（四）目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放：在細(xì)胞內(nèi)存在的許多物質(zhì)中，選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物，而使其他物質(zhì)盡量少釋放出來(lái)，并降低細(xì)胞的破碎程度，對(duì)下游分離純化操作的順利實(shí)施非常重要。目前五十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的一般原則1）僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周?chē)鶤、目標(biāo)產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，采用較溫和的方法，如化學(xué)法B、目標(biāo)產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，需采用強(qiáng)烈的機(jī)械法破碎2）選擇性溶解目標(biāo)產(chǎn)物目標(biāo)產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合時(shí)，可采用調(diào)節(jié)pH、離子強(qiáng)度或添加與目標(biāo)產(chǎn)物具有親和性的試劑等方法，使目標(biāo)產(chǎn)物容易溶解釋放。溶液性質(zhì)應(yīng)使其他雜質(zhì)不易溶出；機(jī)械法和化學(xué)法并用可使操作條件更溫和，在相同的目標(biāo)產(chǎn)物釋放率的情況下，降低細(xì)胞的破碎程度。目前五十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)第三節(jié)包涵體的分離和蛋白質(zhì)的復(fù)性重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，由于表達(dá)量高，通常重組蛋白會(huì)以包涵體形式存在。即這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)聚集成沒(méi)有生物活性的直徑為0.1-3.0μm的固體顆粒。這些顆粒需要經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性才能獲得天然結(jié)構(gòu)及生物活性。目前六十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長(zhǎng)激素>30%形成包涵體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體目前六十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)一、形成包涵體的原因重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需要的酶類(lèi)，導(dǎo)致中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀缺乏蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中所需要的酶和輔助因子，或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵重組蛋白的氨基酸組成和其所處的環(huán)境同樣影響包涵體的形成。一般含硫氨基酸越多越容易形成包涵體；發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體目前六十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)二、減少包涵體的策略降低重組菌的生長(zhǎng)溫度，減緩蛋白質(zhì)的表達(dá)速度和降低表達(dá)量將目標(biāo)蛋白質(zhì)與分子伴侶蛋白、折疊酶和二硫鍵異構(gòu)酶共表達(dá)，提供有利于蛋白質(zhì)折疊的輔助因子使用非代謝性碳源降低代謝速度和蛋白質(zhì)表達(dá)量將目標(biāo)蛋白質(zhì)與親水性蛋白質(zhì)融合表達(dá)目前六十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)三、形成包涵體的有利之處包含體蛋白質(zhì)主要在大腸桿菌表達(dá)體系中形成，大腸桿菌易于高密度培養(yǎng)，有利于大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)包含體蛋白質(zhì)的表達(dá)量高包含體富含目的基因表達(dá)產(chǎn)物，有利于后續(xù)的分離純化沉積于包含體內(nèi)的目標(biāo)蛋白質(zhì)不易被蛋白酶水解無(wú)活性形式表達(dá)，避免對(duì)宿主細(xì)胞的毒害或殺傷目前六十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)四、包含體的組成與特性主要成分為基因表達(dá)產(chǎn)物——重組蛋白，50％以上其他成分因表達(dá)系統(tǒng)而異，包括磷脂、微量的質(zhì)粒、rRNA和RNA聚合酶，最多的是黏附于包含體顆粒的外膜蛋白質(zhì)（并非構(gòu)成成分，而是提取包含體時(shí)的不溶性物質(zhì)，可被表面活性劑反復(fù)清除除去）。大小為0.5-1μm，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等

目前六十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)五、包含體的解決方法（一般步驟）（一）包含體的分離純化（二）包含體溶解（可溶性變性、還原蛋白質(zhì)）（三）變性蛋白質(zhì)的復(fù)性和重新氧化（四）蛋白質(zhì)一般的分離純化目前六十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（一）包含體的分離純化在質(zhì)粒DNA、脂多糖和其他蛋白質(zhì)存在下，蛋白質(zhì)的聚集體生成速率增大，復(fù)性收率降低。而純化的變性/還原蛋白質(zhì)的復(fù)性收率大幅度提高。為提高蛋白質(zhì)復(fù)性收率，必須進(jìn)行包含體的純化。即在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑（如2M尿素在50mMTris,pH8左右,1mMEDTA中）洗滌。還可用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。

目前六十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)包含體的分離純化一般過(guò)程細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、酶解或兩者結(jié)合）離心沉降回收包含體（包含體密度較大，可通過(guò)離心與細(xì)胞碎片、可溶性產(chǎn)物分離）粗包含體的洗滌（EDTA、尿素、TritonX-100等溶解吸附在包含體表面的磷脂和膜蛋白質(zhì)）離心沉降回收包含體根據(jù)需要，可重復(fù)③、④直至包含體純度達(dá)到要求目前六十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（二）包含體溶解獲得適當(dāng)純度的包含體后，需溶解包含體，使目標(biāo)蛋白質(zhì)肽鏈伸展，為進(jìn)一步的復(fù)性創(chuàng)造條件。通常利用高濃度的強(qiáng)變性劑溶解包含體，如8M尿素、鹽酸胍。含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑解離錯(cuò)配的二硫鍵，如二硫蘇糖醇，β-巰基乙醇等。目前六十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)8mol/L尿素等。通過(guò)破壞離子間的相互作用而破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。去污劑：如SDS。破壞蛋白內(nèi)部的疏水鍵，增溶幾乎所有的蛋白酸：如70%甲酸。可以破壞次級(jí)鍵而增溶蛋白，適用于少數(shù)蛋白1）強(qiáng)變性劑2）還原劑：如DTT，打開(kāi)二硫鍵。3）金屬螯合劑：如EDTA。螯合Cu2+,Fe3+等金屬離子，避免其與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)包含體溶解試劑目前七十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)（三）變性蛋白質(zhì)的復(fù)性和重新氧化變性蛋白質(zhì)溶解在高濃度變性劑中，降低變性劑濃度至非變性濃度范圍即可引發(fā)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性對(duì)于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，其復(fù)性過(guò)程稱(chēng)為氧化復(fù)性，需添加氧化劑和還原劑，調(diào)節(jié)復(fù)性液的氧化還原環(huán)境，促進(jìn)正確二硫鍵的形成主要復(fù)性方法：稀釋復(fù)性、添加劑輔助復(fù)性、分子伴侶或人工分子伴侶輔助復(fù)性、反膠團(tuán)的應(yīng)用、色譜柱復(fù)性等目前七十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)稀釋復(fù)性直接稀釋復(fù)性：即將變性蛋白質(zhì)溶液直接稀釋到適宜的復(fù)性緩沖液中蛋白質(zhì)濃度越高，聚集體生成速度越快，復(fù)性收率越低。因此，為提高復(fù)性收率，通常需在較低的濃度下進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性操作。但降低蛋白質(zhì)濃度勢(shì)必增大復(fù)性液的體積，給后續(xù)的分離純化增加困難。目前七十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于五點(diǎn)采用向復(fù)性液中脈沖加入變性蛋白質(zhì)溶液的稀釋復(fù)性方法，即將變性蛋白質(zhì)分多批次加入到復(fù)性液中，或采用連續(xù)流加到復(fù)性液中的流加復(fù)性方法，可實(shí)現(xiàn)高濃度下的高收率復(fù)性。由于在流加變性蛋白質(zhì)的同時(shí)復(fù)性液中蛋白質(zhì)發(fā)生折疊復(fù)性，使變性蛋白質(zhì)（折疊中間體）濃度始終保持在較低的水平，最終可在較高的蛋白質(zhì)濃度下獲得較高復(fù)性收率透析（或超濾）復(fù)性目前七十三頁(yè)