高速逆流色譜溶劑體系篩選及其聯(lián)用技術(shù)課件

高速逆流色譜溶劑體系篩選及其聯(lián)用技術(shù)

報告內(nèi)容一、溶劑體系篩選方法二、高速逆流色譜聯(lián)用三、關(guān)于上海同田生物一、溶劑體系篩選方法

基本原則:不造成樣品分解或變性

對樣品有較大溶解度固定相在分離柱中有較好保留樣品在兩相溶劑系統(tǒng)中有合適的分配系數(shù)溶劑體系的篩選方法

1.分配系數(shù)（K

）法

K＝Cs/CmCs為溶質(zhì)在固定相中的質(zhì)量濃度Cm為溶質(zhì)在流動相中的質(zhì)量濃度Cs和Cm的比值可通過HPLC測得

理想的分配比值k=0.5~2，允許0.2~5CsCm兩種溶質(zhì)分離因子：

α＝K1/K2（>1.5）

當(dāng)Cs

/Cm

＜＜0.5時，出峰時間太快，分離度較差當(dāng)Cs

/Cm

＞＞2時，出峰時間太長，且峰形變寬蘆薈提取物的HPLC圖譜實例（HPLC法測K值）蘆薈未知物蘆薈苷A蘆薈苷B蘆薈提取物的HSCCC圖譜蘆薈苷B蘆薈苷A蘆薈未知物對已知化合物類別的物質(zhì)可參考相關(guān)文獻，在文獻提供的體系的基礎(chǔ)上進行調(diào)整對未知樣品，可采用氯仿-甲醇-水=10-3-7或正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=1-1-1-1兩個極性分布范圍較廣的體系先進行嘗試，也可以根據(jù)樣品的極性選擇相對應(yīng)的溶劑體系，再根據(jù)目標(biāo)組分的分配系數(shù)進行調(diào)整

2.經(jīng)驗法

溶劑體系根據(jù)極性可以分為三類：疏水性（石油醚體系，正已烷體系）

中等疏水性（氯仿體系，甲基叔丁基醚體系）親水性（正丁醇體系，乙酸乙酯體系）

3.分析型HSCCC法優(yōu)點：分析時間短溶劑消耗少進樣量小，節(jié)省樣品確定的體系可直接用于放大制備，重現(xiàn)性佳儀器：TBE-20A

轉(zhuǎn)速：1600r/min

流速：0.5ml/min

樣品：8％沙棘提取物

體系：正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水

洗脫方式：下相作為流動相實例（分析型HSCCC法）

0.8：1.2：1.2：1.2

0.8：1.2：1.2：1.5

正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（0.8：1.2：1.2：1.7）

槲皮素

山萘酚

異鼠李素

HSCCC工藝重現(xiàn)性TBE-20A分析型HSCCCTBE-300B半制備型HSCCCTBE-1000A制備型HSCCC

Ito認為溶劑體系的篩選可以從氯仿-甲醇-水(2:1:1)開始，如果分配系數(shù)落在0.2-5的范圍內(nèi)，通過調(diào)整可以獲得滿意的分配系數(shù)。如果樣品主要分布在非水相的下相中時，應(yīng)嘗試下表中箭頭向上的體系，如果樣品主要分布在上相時，則應(yīng)試驗相反方向的體系。BHAW方法是將非極性溶劑體系正已烷-乙腈（1:1）和極性溶劑體系正丁醇-水（1:1）結(jié)合起來，形成了7種多元溶劑體系，編號為-3～+3首先試驗0號溶劑體系，以確定下一步試驗的方向。如果樣品傾向于極性的水相，應(yīng)該進一步實驗0～+3號正方向的體系，否則應(yīng)該試驗0～-3號反方向的體系這組溶劑的特點是紫外透明性很好小結(jié)：溶劑體系的選擇是HSCCC分離中最關(guān)鍵也是難度最大的一個環(huán)節(jié)，一般從樣品的溶解度，通過參考文獻及常用體系,測定K值等來篩選溶劑體系，然后再通過上述提到的各種方法進行調(diào)整。

隨著逆流色譜技術(shù)的普及，越來越多的人致力于體系篩選的研究工作。注意事項：?KTA系列設(shè)備的出場設(shè)置的最高壓力為1MPa，適合HSCCC的0～2MPa壓力范圍；如不是，需要設(shè)置最高壓力為1～2MPa?KTA系列的連接接頭為M5型號，而HSCCC為M6型號接頭，所以連接時需要使用轉(zhuǎn)換接頭2.HSCCC與ELSD的聯(lián)用技術(shù)優(yōu)勢：基于樣品的濃度梯度洗脫時基線穩(wěn)定，無溶劑峰可用于檢測揮發(fā)性低于溶劑的任何化合物HSCCC-ELSD聯(lián)用技術(shù)已成功用于脂肪酸，生物堿，皂苷類，萜類，甾體類等的分離

注意事項：ELSD連接接頭為M5型號，而HSCCC為M6型號，所以連接時需要使用轉(zhuǎn)換接頭(廠家提供)半制備型和制備型HSCCC與ELSD檢測器聯(lián)用時，需用分流器實現(xiàn)同時檢測與餾分的收集分流器解析圖三通管HSCCC組分流出口調(diào)速閥組分收集分流－進入ELSD檢測器分流－進入收集器三通管3.HSCCC-ESI-MS聯(lián)用技術(shù)高速逆流色譜與熱噴霧式質(zhì)譜聯(lián)用法是一種新近發(fā)展起來的、具有適用范圍廣和靈敏度高等特點的分析方法可直接用于復(fù)雜樣品中有關(guān)成分的鑒別和測定不需要對流出液做任何分離就可用于鑒定，降低了分離過程對樣品造成污染的可能性適用于分析非揮發(fā)性或熱不穩(wěn)定性物質(zhì)分析速度快

HSCCC-ESI-MS

Oka等解決了HSCCC與質(zhì)譜聯(lián)用的根本問題即接口問題，設(shè)計了T型連接器，發(fā)現(xiàn)聯(lián)用并不影響色譜的分離和質(zhì)譜的分析HSCCC-ESI-MS聯(lián)用技術(shù)已成功地用于同時在線分離和分析丹參酮ПA，EGCG，三萜酸，多肽，多酚類和黃酮類等HSCCC能夠獲得高的溶質(zhì)-溶劑比的流出物，從而使流動相吸收紅外光譜的問題得到緩解高速逆流色譜與傅里葉紅外光譜的聯(lián)用只需要一個簡單的流動池接口，不需要其他附加的去除溶劑的方法4.HSCCC-FT-IR聯(lián)用技術(shù)優(yōu)點：可以在分離的同時獲得被分離物的結(jié)構(gòu)信息缺點：需要較大的樣品量（每種組分0.2-1mg）Romanach和DeHaseth應(yīng)用HSCCC-FT-IR聯(lián)用技術(shù)成功地對苯酚、硝基苯酚以及乙酰苯酚等進行了分離與鑒定，在線記錄相應(yīng)的IR光譜小結(jié)：隨著HSCCC的普及，HSCCC與多種其他技術(shù)聯(lián)用，為HSCCC的應(yīng)用擴展了更大的空間。三、關(guān)于上海同田生物技術(shù)有限公司

公司位于上海張江科技園，占地約30畝，建筑面積約20000平方米，總投資人民幣6000萬元。

2008年11月25日，上海市高新技術(shù)企業(yè)認定辦公室公告，上海同田生物技術(shù)有限公司被認定為上海市2008年第一批高新技術(shù)企業(yè)。

公司致力于高速逆流色譜儀（HSCCC）、高純度天然產(chǎn)物有效成分單體、天然藥物原料/中間體的研究開發(fā)、生產(chǎn)和銷售。

作為多分離柱高速逆流色譜儀國家新型專利的擁有者、高速逆流色譜領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)者，我們與通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)中國有限公司（GEHealthcareBio-sciencesco.,ltd.）建立了長期的合作伙伴關(guān)系。TBE300B＋?KTAPrime在高速逆流色譜技術(shù)領(lǐng)域，公司所研制并批量生產(chǎn)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型多分離柱高速逆流色譜儀，性能穩(wěn)定可靠，有分析型、半制備型、制備型等7種不同產(chǎn)品：

國內(nèi)部分代表客戶名單：香港賽馬會中藥研究院香港大學(xué)植物系中國科學(xué)院過程工程研究所（北京）中國科學(xué)院植物研究所（北京）國家中藥制藥工程技術(shù)研究中心（上海）山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司山東聊城大學(xué)化工學(xué)院

泰國德國

公司于2008年底已在西班牙，比利時，韓國，泰國，新加坡，瑞士，南非，捷克，意大利，印度等十一個國家設(shè)立了代理商。中國對照品行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者，ISO9001：2000質(zhì)量管理體系認證企業(yè)長達10年的對照品研發(fā)及標(biāo)準(zhǔn)制定經(jīng)驗同田對照品均通過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，附HPLC檢測報告，大部分產(chǎn)品可提供NMR,MS等圖譜。銀杏內(nèi)酯B銀杏內(nèi)酯A銀杏內(nèi)酯C部分對照品獲得國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書天然植物<銀杏,大豆>單體提取物上海市高新技術(shù)成果轉(zhuǎn)化項目<石杉堿甲>上海市高新技術(shù)成果轉(zhuǎn)化項目同田對照品質(zhì)量目前已得到美國，德國，瑞士，英國，新加坡等多家