質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌演示文稿

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌演示文稿目前一頁\總數(shù)十四頁\編于點優(yōu)選質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌目前二頁\總數(shù)十四頁\編于點1、重組質(zhì)粒的鑒定當(dāng)質(zhì)粒的重組或其他載體重組后，通常會發(fā)生質(zhì)粒的重組失敗，包括質(zhì)粒的本身環(huán)化。因而要求進(jìn)行篩選，把重組成功的質(zhì)粒找出來。在目前常用的質(zhì)粒和其他載體中含有相應(yīng)的抗生素抗性基因，若重組成功，或不含質(zhì)粒的自身環(huán)化，抗生素抗性基因表達(dá)，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌便具備抵抗相應(yīng)抗生素的能力，可以在含該抗生素的培養(yǎng)基上生長傳代。若重組失敗，大腸桿菌便不能抵抗該抗生素而死亡。2、為擴(kuò)增質(zhì)粒和其他載體作準(zhǔn)備由于大腸桿菌繁殖快，在適宜的條件下繁殖一代僅需要20-30min，而且常用質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌中增殖達(dá)到幾百個拷貝。因此，通過對轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌培養(yǎng)，可以在短時間內(nèi)極大的擴(kuò)增目的質(zhì)粒。一、實驗?zāi)康哪壳叭揬總數(shù)十四頁\編于點二、實驗原理通過CaCl2對特定的大腸桿菌處理，制備感受態(tài)的細(xì)菌。這些細(xì)菌可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重組質(zhì)粒，產(chǎn)生5×106~2×107個轉(zhuǎn)化的菌落。當(dāng)質(zhì)粒與這些大腸桿菌混合后，質(zhì)粒粘附在大腸桿菌的表面，在42℃時，大腸桿菌出現(xiàn)熱休克，質(zhì)粒可通過大腸桿菌細(xì)胞膜上形成的空隙進(jìn)入菌體內(nèi)。隨后，加入LB培養(yǎng)液，于37℃振動培養(yǎng)可使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因，提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌可以在相應(yīng)抗生素培養(yǎng)皿中傳代，形成菌落。目前四頁\總數(shù)十四頁\編于點三、實驗流程：滅活物/質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑菌搖菌菌液PCR目前五頁\總數(shù)十四頁\編于點四、實驗方法---凍融法連接產(chǎn)物滅活70℃，10min（冰上解凍）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞50μl、滅火物10μl混合物，冰上放置30min42℃,90sec冰上2min加入1000ulLB液體（無抗）37℃，振蕩1h離心10000rpm,1min,RT去上清800μl留下200μl上清于1.5ul離心管中重懸涂板37℃恒溫箱，倒置培養(yǎng)12h(時間不得超過20h)目前六頁\總數(shù)十四頁\編于點1、無菌落，失敗，或培養(yǎng)條件不充分。2、菌落布滿如苔樣，失敗，可能是抗生素濃度不夠或失效。3、菌落布滿，抗生素濃度太高，失敗。4、出現(xiàn)菌落，符合要求。（1）（2）（3）（4）目前七頁\總數(shù)十四頁\編于點五、結(jié)果分析和失敗原因（1）有菌落，說明轉(zhuǎn)化成功，但有兩種可能性：其一，質(zhì)粒自身環(huán)化；其二，重組成功。（2）無菌落，說明實驗沒成功。（3）菌落布滿如苔樣，可能是抗生素濃度不夠或失效。（4）出現(xiàn)大菌斑，大多數(shù)是霉菌污染所致。1、結(jié)果分析目前八頁\總數(shù)十四頁\編于點1、平板中的抗生素部分失效，長出的克隆是雜菌。2、倒Ka平板時，培養(yǎng)基太燙，應(yīng)冷卻到50℃以下加Ka抗生素。2、涂板時來回用力過大，涂布環(huán)或者涂布棒灼燒過熱，或不待冷卻就涂布。3、感受態(tài)細(xì)胞長時間處在常溫狀態(tài)，會嚴(yán)重影響其轉(zhuǎn)化，操作時動作迅速。4、操作時動作過于劇烈，減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷。切記感受態(tài)細(xì)胞比較嬌嫩。5、操作過程不規(guī)范，染菌。2、轉(zhuǎn)化失敗的原因目前九頁\總數(shù)十四頁\編于點六、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（1）從LB平板上挑取新活化的E.coli

TOP10單菌落于50mlLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜；（2）將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600＝0.5左右；（3）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4℃下4100rpm離心10min。（4）棄掉上清,加入30ml0.1mol/L預(yù)冷的CaCl2溶液，重懸，冰上放置15-30min后，4℃下4100rpm離心10min；（5）棄掉上清，加入2ml預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl，加入無菌甘油300μl，重懸混勻,冰上放置幾分鐘；（6）分裝，每管100μl，液氮冷凍后,保存于-70℃冰箱。目前十頁\總數(shù)十四頁\編于點七、挑菌、搖菌

（1）離心管標(biāo)號（2）每個管內(nèi)吸入650μlLB+Ka抗生素（3）用牙簽挑取單個菌（4）搖床上搖菌（時間大于8h）準(zhǔn)備：離心管、牙簽、鑷子、LB+抗生素目前十一頁\總數(shù)十四頁\編于點八、藍(lán)白斑篩選原理

藍(lán)白斑篩選-----篩選重組子：根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等?，F(xiàn)在許多載體都含有一個大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS）。受體菌則含編碼β-半乳糖苷酶C端aa的序列。當(dāng)外源基因插入時，二者溶為一體后，有β-半乳糖苷酶表達(dá)，在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）培養(yǎng)基中形成藍(lán)色菌落。而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達(dá)而形成白色菌斑。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。目前十二頁\總數(shù)十四頁\編于點

藍(lán)白斑篩選：（1）未轉(zhuǎn)化的菌不具有抗性，不生長；（2）轉(zhuǎn)化了空載體，即未重組質(zhì)粒的菌，長成藍(lán)色菌落；（3）轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的菌，即目的重組菌，長成白色菌落。目前十三頁\總數(shù)十四頁\編于點九、菌液PCR驗證加樣：easybuffer:2.5μl×樣數(shù)

DNTP：1.5μl×樣數(shù)

M13R:1μl×樣數(shù)M13F:1μl×樣數(shù)ea