高效液相色譜分離檢測技術(shù)

1、固定相（柱填料）

常用填料基質(zhì)可分為硅膠、氧化物和聚合物。

硅膠是HPLC填料中最常用的基質(zhì)。它具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、容易控制的孔結(jié)構(gòu)和比表面積、較好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性以及專一的表面化學(xué)反應(yīng)等優(yōu)點外，還有一個突出的優(yōu)點就是其表面含有豐富的硅羥基，這是硅膠可以進(jìn)行表面鍵合或改性的基礎(chǔ)。

缺點：在堿性水溶性流動相中不穩(wěn)定。4.4.1液譜分離系統(tǒng)目前市場主要可供選擇的硅膠填料粒徑1.7μm，1.8μm，2.2μm－快速液相色譜柱：匹配快速色譜儀2.7μm－多孔殼層：在常規(guī)液相色譜儀上實現(xiàn)快速分離(Halo)3.0μm，3.5μm－普通快速分析5.0μm－常規(guī)分析顆粒越小，柱效越高，但是耐污染性能下降，柱壓升高。目前一頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點

1.液-液分配及離子對分離固定相（1）全多孔型擔(dān)體

氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見。現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料。

（2）表面多孔型擔(dān)體

（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底。目前二頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點4.4.1液譜分離系統(tǒng)HPLC固定相狀態(tài)分液-固色譜法（LSC）液-液色譜法（LLC）分離機(jī)制分吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法分子排阻色譜法化學(xué)鍵合相色譜法親合色譜法離子色譜法目前三頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點一、化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合相（chemicallybondedphase）將固定液（含不同官能團(tuán)的有機(jī)分子）利用化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面上，使其形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的固定相1．鍵合相類型載體-----硅膠類型非極性固定相(ODS）極性鍵合相（鍵合-NH2、-CN、醇基等極性基團(tuán)）

離子型鍵合相（鍵合可交換陰或陽離子基團(tuán))鍵合反應(yīng)---硅烷化反應(yīng)、硅酸酯化反應(yīng)目前四頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點2．分離原理（1）正相鍵合相色譜法特征----固定相極性＞流動相極性分離機(jī)制---類似液-液分配色譜的分離原理應(yīng)用范圍---適于分離溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物(如脂溶性維生素、脂、芳香醇、芳香胺等）

（2）反相鍵合相色譜法特征----固定相極性＜流動相極性分離機(jī)制---“疏溶劑作用”理論應(yīng)用范圍-----適用于分離非極性至中等極性的分子型化合物流動相-----有機(jī)溶劑流動相-----水+有機(jī)調(diào)節(jié)劑目前五頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點疏溶劑作用理論利用非極性溶質(zhì)分子或溶質(zhì)分子中非極性基團(tuán)和極性溶劑接觸時產(chǎn)生排斥力，而從溶劑中被“擠出”，即產(chǎn)生疏溶劑作用，促使溶質(zhì)分子與鍵合相表面的非極性的烷基發(fā)生疏水締合，而使溶質(zhì)分子保留在固定相中.想一想影響溶質(zhì)保留（時間長短）的因素有哪些?目前六頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點（1）溶質(zhì)分子中非極性部分的總表面積

溶質(zhì)和固定相接觸的總表面積愈大，保留值愈大，所以溶質(zhì)的極性愈弱，疏水性越強(qiáng)，保留值越大。（2）鍵合相上的烷基總面積

烷基鍵合固定相的作用在于提供非極性的作用表面。隨著碳鏈的加長，烷基的疏水特性增強(qiáng)，溶質(zhì)的保留值也隨烷基碳鏈長度的增加而增大。影響溶質(zhì)保留（時間長短）的四大主要因素時間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯目前七頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點（3）流動相的表面張力流動相的表面張力愈大，介電常數(shù)愈大，極性亦愈強(qiáng)；溶質(zhì)和烷基鍵合相的締合作用愈強(qiáng)，流動相的洗脫強(qiáng)度弱，導(dǎo)致溶質(zhì)的保留值大。（4）流動相的酸堿性和鹽濃度酸性抑制弱酸解離，增加保留時間；堿性抑制弱堿解離，增加保留時間；鹽濃度增加不利于離子化溶質(zhì)保留。目前八頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點二、離子色譜法1.離子色譜法（IC）離子交換色譜與電導(dǎo)檢測器相結(jié)合分析各種離子的方法2．分離原理[抑制型（雙柱型)]

分離柱交換反應(yīng)：R+-OH-+NaX→R+-X-+NaOH

洗脫反應(yīng)：R+-X-+NaOH→R+-OH-+NaX抑制柱與組分反應(yīng)：R—H++NaX→R-Na++HX

與洗脫劑反應(yīng)：R--H++NaOH→R-Na++H2O在無抑制柱的離子交換色譜中，進(jìn)入檢測器的是高電導(dǎo)的洗脫劑NaOH及被洗脫的組分NaX，后者所產(chǎn)生的電導(dǎo)的微小變化被洗脫劑的高本底所淹沒，難于檢測。而加了抑制柱后，進(jìn)入檢測器的本底是電導(dǎo)率很低的水，因此很容易檢測出具有較大電導(dǎo)率的HX。目前九頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點2．固定相與流動相（1）固定相基質(zhì)

---合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠離子交換劑

----鍵合的離子交換基團(tuán)類型符號官能團(tuán)強(qiáng)陽離子交換劑SCX—SO3H弱陽離子交換劑WCX—COOH強(qiáng)陰離子交換劑SAX—N+R3弱陰離子交換劑WAX—NH2目前十頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點（2）流動相----水緩沖溶液

選擇規(guī)則(1)增加流動相中鹽的濃度，可以降低待測離子的競爭親和力，使其在固定相上的保留時間減少，先出色譜柱;反之，則保留時間增大，后出色譜柱.（2）pH增大，酸的離解度增大而值增大，保留時間增加，后出柱；但有機(jī)堿的離解度降低而分配比減小，保留時間減小，先出柱。(3)緩沖溶液中緩沖劑濃度增大;保留時間會減小。

目前十一頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點三、反相離子對色譜法1．分離機(jī)制

在反相色譜法中，將一種或多種與被測離子電荷相反的離子（稱為對離子或反離子）加到極性流動相中，使其與被測離子結(jié)合，形成疏水性（中性或弱極性）的離子對締合物,而被非極性固定相（有機(jī)相）萃取，進(jìn)入固定相被保留.因待測組分離子的性質(zhì)不同、反離子形成離子對的能力不同和形成離子對疏水性的不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時間的不同，因而出色譜柱先后不同，實現(xiàn)分離.生成離子對反應(yīng)反離子被測離子目前十二頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點2．常用

離子對

試劑陽離子烷基磺酸或鹽類(十二烷基磺酸鈉）分析有機(jī)堿類和有機(jī)陽離子陰離子季銨鹽類(四丁基季銨鹽、十六烷基三甲基季銨鹽

)分析有機(jī)酸和有機(jī)陰離子3．固定相與流動相(1）固定相

-----ODS等非極性固定相

(2）流動相

-----甲醇-水或乙腈-水體系中加入適量離子對試劑，并用緩沖液調(diào)至合適的pH。分離有機(jī)堿的pH值一般為3~3.5；分離有機(jī)酸的pH值一般在7.5左右。目前十三頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點第2節(jié)高效液相色譜儀高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)及流程目前十四頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點一、輸液系統(tǒng)單柱塞往復(fù)泵結(jié)構(gòu)示意圖

1．高壓輸液泵單柱塞往復(fù)泵雙柱塞往復(fù)泵(串或并聯(lián)）恒壓泵(淘汰)恒流泵目前十五頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點2．梯度洗脫裝置內(nèi)梯度----高壓泵將溶劑按程序壓入混合室，混合后再注入色譜柱外梯度---多元溶劑通過比例閥再由泵注入色譜柱二元內(nèi)梯度洗脫裝置示意圖目前十六頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點四元外梯度洗脫裝置雙泵(串聯(lián))工作原理示意圖

目前十七頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點3．洗脫方式等度洗脫梯度洗脫想一想分別在何種情況下選擇等度或梯度洗脫?二、進(jìn)樣系統(tǒng)1．六通閥進(jìn)樣器目前十八頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點2．自動進(jìn)樣器目前十九頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點三、分離系統(tǒng)1．色譜柱類型常量柱內(nèi)徑2～4.6mm，柱長10～25cm半微量柱：內(nèi)徑1～1.5mm，柱長10～20cm毛細(xì)管柱：內(nèi)徑0.5～1mm，柱長30～75mm分析型柱制備型柱內(nèi)徑20～40mm，柱長10～30cm分析型制備型目前二十頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點2．填充劑-----最常用填充劑為化學(xué)鍵合硅膠

四、檢測系統(tǒng)1.紫外檢測器可變波長檢測器光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器結(jié)構(gòu)與光路示意圖

目前二十一頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點三維色譜圖目前二十二頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點2．電化學(xué)檢測器介電型

----測量兩電極之間電容介質(zhì)的介電常數(shù)變化測得組分濃度電導(dǎo)型

---測電導(dǎo)率變化來測量電離物質(zhì)含量電位型

--測定電流為零時電極間的電位差值安培型

---測定電極間的電流變化而測定樣品濃度典型電化學(xué)檢測器示意圖

目前二十三頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點3．蒸發(fā)光散射檢測ELSD是基于光線通過微小粒子時會產(chǎn)生光散射的現(xiàn)象蒸發(fā)光散射檢測器工作原理示意圖五、數(shù)據(jù)記錄及處理系統(tǒng)（類似于GC)目前二十四頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點目前二十五頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點第3節(jié)定性與定量分析技術(shù)一、定性分析技術(shù)1．色譜鑒定法2．兩譜聯(lián)用鑒定法LC-UVLC-MS二、定量測定分析(外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法）1.加校正因子的主成分自身對照法

(1)校正因子測定與計算目前二十六頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點(2）測定測定雜質(zhì)含量時，按供試品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ找?，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度（以噪音水平可接受為限）或進(jìn)樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量程的10%～25%或其峰面積能準(zhǔn)確積分。取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進(jìn)樣。除有特殊規(guī)定外，供試品溶液的記錄時間應(yīng)記錄到主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜釁上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質(zhì)含量。目前二十七頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點2．不加校正因子的主成分自身對照法按上述（1）法配制對照溶液并調(diào)節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進(jìn)樣。除供試品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下有特別規(guī)定外，供試品溶液色譜圖記錄的時間應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖中各雜質(zhì)的峰面積并與對照溶液的主成分的峰面積比較，計算雜質(zhì)的含量。目前二十八頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點第4節(jié)高效毛細(xì)管電泳簡介一、毛細(xì)管電泳分離原理簡介1.電泳流

(電泳)-----在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同速度向其所帶電荷相反方向遷移2.電滲流

（電滲)

-----在一般性況下（pH＞3）石英毛細(xì)管柱內(nèi)表面帶負(fù)電，和溶液接觸時形成雙電層;在高壓電場作用下，雙電層中的水合陽離子整體朝負(fù)極方向移動3.粒子遷移速度電滲流的速度=5~7倍電泳流速度陽離子遷移速度＝電滲速度＋電泳速度陰離子遷移速度＝電滲速度－電泳速度中性粒子遷移速度＝電滲速度目前二十九頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點4.分離原理

在一定電場作用下,在毛細(xì)管中的各種不同的粒子電泳速度和電滲速度也各不相同，電滲流可以帶動陽離子、陰離子和中性物質(zhì)以不同的速度從陰極端流出而實現(xiàn)分離。二、毛細(xì)管電泳儀的基本裝置毛細(xì)管柱、柱恒溫系統(tǒng)、電解液槽、進(jìn)樣器、高壓電源、檢測器和數(shù)據(jù)處理器毛細(xì)管電泳裝置示意圖

目前三十頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點1．毛細(xì)管柱及溫度控制（1）毛細(xì)管柱空心柱----區(qū)帶電泳、膠束電泳及環(huán)糊精電泳填充毛細(xì)管柱---電色譜壁處理柱----蛋白質(zhì)電泳（2）毛細(xì)管恒溫裝置作用---消除電泳產(chǎn)生的焦耳熱精度---±0.1℃恒溫方式高速氣流恒溫液體恒溫目前三十一頁\總數(shù)三十三頁\編于二十一點2．高壓電源直流電源電壓:0~30k