水中糞大腸菌群的測定

水中糞大腸菌群的測定

測定方法和原理1試劑和儀器2測定過程33結(jié)果計算44學(xué)習(xí)內(nèi)容1.1方法名稱與適用范圍水質(zhì)糞大腸菌群的測定——多管發(fā)酵法HJ347.2-2018方法名稱適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的測定檢出限：12管法為3MPN/L；15管法為20MPN/L。適用范圍1.2相關(guān)術(shù)語

糞大腸菌群，又稱耐熱大腸菌群。44.5℃培養(yǎng)24h，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。最大可能數(shù)，又稱稀釋培養(yǎng)計數(shù)，是一種基于泊松分布的間接計數(shù)法。利用統(tǒng)計學(xué)理論，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的目標(biāo)微生物陽性數(shù)，查表估算一定體積樣品中目標(biāo)微生物存在的數(shù)量（單位體積存在目標(biāo)微生物的最大可能數(shù)）。1.3方法原理將樣品加入含乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，37℃初發(fā)酵富集培養(yǎng)，大腸菌群在培養(yǎng)基中生長繁殖分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)生的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變?yōu)辄S色，產(chǎn)生的氣體進(jìn)入倒管中，指示產(chǎn)氣。44.5℃復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的膽鹽三號可抑制革蘭氏陽性菌的生長，最后產(chǎn)氣的細(xì)菌確定為是糞大腸菌群。通過查MPN表，得出糞大腸菌群濃度值。

測定方法和原理1試劑和儀器2測定過程33結(jié)果計算44學(xué)習(xí)內(nèi)容

2.1培養(yǎng)基和試劑(1)單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g

牛肉膏3g乳糖5g

氯化鈉5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL

蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于含有倒置的小玻璃管的試管中，于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min，貯存于暗處備用。

(2)三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基按上述配方比例三倍（除蒸餾水外），配成三倍濃縮的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，制法同上。注：本試驗測定所使用的乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，也可使用成品的大腸菌群發(fā)酵培養(yǎng)基，如：乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，等。

(3)EC培養(yǎng)液成分：胰胨20g乳糖5g膽鹽三號1.5g磷酸氫二鉀（K2HPO4）4g磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.5g氯化鈉5g蒸餾水1000mL制法：將上述成分加熱溶解，然后分裝于含有玻璃倒管的試管中。置高壓蒸汽滅菌器中，115℃滅菌20min。滅菌后pH應(yīng)為6.9。高壓滅菌鍋生化培養(yǎng)箱2.2儀器和設(shè)備超凈工作臺電子天平玻璃器皿及用具：玻璃試管、杜氏小管、與試管配套的棉塞或橡皮塞、移液管（1mL、5mL、10mL）、三角瓶；接種環(huán)、吸耳球、牛皮紙、酒精燈、火柴、消毒酒精棉球、鑷子、記號筆、試管架等。

測定方法和原理1試劑和儀器2測定過程33結(jié)果計算44學(xué)習(xí)內(nèi)容3.1培養(yǎng)基制備及滅菌（1）水樣接種量的確定將水樣充分混勻后，根據(jù)水樣污染的程度確定水樣接種量。每個樣品至少用三個不同的水樣量接種。同一接種水樣量要有五管（15管法）。相對未受污染的水樣接種量為10mL、1mL、0.1mL。受污染水樣接種量根據(jù)污染程度接種1mL、0.1mL、0.01mL或0.1mL、0.01mL、0.001mL等。使用的水樣量可參考下表1。由于本次測定的是污水處理廠的出水水樣，所以選取的濃度梯度為10-3、10-4、10-5。（2）乳糖蛋白胨培養(yǎng)基分裝10mL3倍10mL1倍10mL1倍10mL1倍如接種體積為10mL，則試管內(nèi)應(yīng)裝有三倍濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液5mL；如接種量為1mL或少于1mL，則可接種于普通濃度的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液10mL中。杜氏小管杜氏小管杜氏小管杜氏小管（3）高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌:115OC，20min無菌水2瓶乳糖蛋白胨培養(yǎng)液試管15支移液管5ml1支1ml10支EC培養(yǎng)液試管15支試管5支3.2水樣制備及稀釋（1）采樣采集污水處理廠出水口的水樣采樣瓶（2）水樣的稀釋及接種1mL10mL90mL無菌水90mL無菌水原液10-110-21mL1mL9mL無菌水10-39mL無菌水10-49mL無菌水10-510mL3.3糞大腸菌群的初發(fā)酵10-510ml3倍10ml1倍10ml1倍1ml1ml37℃

±0.5℃24h±2h10-41ml10-3杜氏小管杜氏小管杜氏小管1.培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，杜氏管中有氣泡（陽性）2.培養(yǎng)基仍為紫色，杜氏管中沒有氣泡（陰性）3.4觀察糞大腸菌群的初發(fā)酵結(jié)果表2.1記錄—初發(fā)酵陽性管數(shù)項目由接種量為10-3ml管轉(zhuǎn)接由接種量為10-4ml管轉(zhuǎn)接由接種量為10-5ml管轉(zhuǎn)接陽性管數(shù)陰性陽性輕微振蕩初發(fā)酵試驗陽性結(jié)果的發(fā)酵管，用接種環(huán)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液中。在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h。培養(yǎng)后立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實為菌群陽性。3.5糞大腸菌群的復(fù)發(fā)酵試驗表2.2記錄—復(fù)發(fā)酵陽性管數(shù)項目由接種量為10-3ml管轉(zhuǎn)接由接種量為10-4ml管轉(zhuǎn)接由接種量為10-5ml管轉(zhuǎn)接陽性管數(shù)陽性空白對照（陰性）接種EC培養(yǎng)液復(fù)發(fā)酵

測定方法和原理1試劑和儀器2測定過程33結(jié)果計算44學(xué)習(xí)內(nèi)容根據(jù)3種不同接種量（對應(yīng)表3中10ml、1ml、0.1ml）的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目，查得每100ml水樣中的糞大腸菌群MPN值。再按照公式換算樣品中糞大腸菌群數(shù)（MPN/L）。4.1糞大腸菌群測定的結(jié)果分析與報告注：如果有超過三個的稀釋度用于檢驗，在一系列的十進(jìn)稀釋當(dāng)中，計算MPN時，只需要用其中依次三個的稀釋度，取其陽性組合。選擇的標(biāo)準(zhǔn)是：先選用5支試管全部為陽性的最大稀釋（小于它的稀釋度也全部為陽性試管），然后再加上依次相連的兩個更高的稀釋。用這三個稀釋度的結(jié)果數(shù)據(jù)來計算MPN值。

式中：C——樣品中糞大腸菌群數(shù)，MPN/L；MPN值——每1