紫外可見分光度法(與“吸收”有關(guān)的文檔共108張)

紫外可見分光度法第一頁，共108頁。分光：將復(fù)合光變成單色光叫分光可見光（400-760nm）紅橙黃綠青藍(lán)紫紅外紫外610-780400-435分光系統(tǒng)第二頁，共108頁。特點(diǎn)：靈敏度高（10-6g/ml），簡單方便。應(yīng)用：1、定性分析2、定量分析發(fā)展趨勢：與計(jì)算機(jī)聯(lián)用及某些數(shù)學(xué)聯(lián)用（如導(dǎo)數(shù)光譜）

紫外光譜主要產(chǎn)生于分子價(jià)電子在電子能級間的躍遷，屬于電子光譜第三頁，共108頁。圖3-1分子能級躍遷示意圖V.振動(dòng)能級J.轉(zhuǎn)動(dòng)能級（一）光譜的產(chǎn)生E=E內(nèi)+E平+E振+E轉(zhuǎn)+E電子

E內(nèi)是分子固有的內(nèi)能，E平是連續(xù)變化的，不具有量子化特征,故ΔE=ΔE振+ΔE轉(zhuǎn)+ΔE電子其中ΔE電子最大，一般為1eV～20eV，(1250nm～60nm)。由外層電子躍遷而產(chǎn)生的光譜位于紫外-可見光區(qū)（一）光譜的產(chǎn)生§1基本原理第四頁，共108頁。分子能級躍遷示意圖V.振動(dòng)能級J.轉(zhuǎn)動(dòng)能級第五頁，共108頁。（二）電子躍遷：有機(jī)化合物分子中主要含有的價(jià)電子類型:

形成單鍵的σ電子；形成雙鍵或叁鍵的π電子及未成鍵的n電子(亦稱p電子)。各分子軌道能級高低順序是：σ＜π＜n＜π*＜σ*σ、π表示成鍵分子軌道，n表示未成鍵分子軌道（亦稱非鍵軌道），σ*、π*表示反鍵分子軌道。第六頁，共108頁。在紫外-可見光區(qū)內(nèi)，有機(jī)化合物的吸收光譜主要由σ→σ*、π→π*、n→σ*及n→π*躍遷產(chǎn)生。第七頁，共108頁。不同類型電子躍遷能量與波段示意圖第八頁，共108頁。分子吸收何種光（λ）與能級差（△E）有關(guān)吸收強(qiáng)度大?。é牛﹦t與躍遷機(jī)率有關(guān),同型軌道之間躍遷幾率大。△EλI0I第九頁，共108頁。σ→σ*躍遷：特點(diǎn):能級間隔△E大，λmax小，一般λmax<150nm，遠(yuǎn)紫外吸收。第十頁，共108頁。（2）π→π*躍遷：△E小a單個(gè)π鍵，λmax=200nm，末端吸收b共軛π鍵，λmax=210-250nm，ε>104。200nmλA末端吸收

具有C＝C或C≡C、C＝N等基團(tuán)的不飽和有機(jī)化合物都會產(chǎn)生π→π*躍遷第十一頁，共108頁。（3）n→π*躍遷含有雜原子的不飽和基團(tuán)，如C＝O、C＝S、N＝N等化合物，其未成鍵軌道中的n電子吸收能量后，向π*反鍵軌道躍遷△E更小，λmax>250nm，ε=10-100。丙酮的λmax＝279nm第十二頁，共108頁。(4)n→σ*躍遷含－OH、－NH2、－X、－S等基團(tuán)的化合物，其n電子吸收能量后向σ*反鍵軌道躍遷λmax=200nm，末端吸收。第十三頁，共108頁。二常用術(shù)語吸收曲線(吸收光譜):以波長λ（nm）為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)所描繪的曲線。第十四頁，共108頁。吸收峰：曲線上吸收最大的地方，它所對應(yīng)的波長稱最大吸收波長（λmax）。谷：峰與峰之間的部位叫谷，該處的波長稱最小吸收波長（λmin）。末端吸收：在圖譜短波端只呈現(xiàn)強(qiáng)吸收而不成峰形的部分稱末端吸收。Aλ吸收峰肩峰（sh）吸收谷末端吸收λmaxλmin第十五頁，共108頁。發(fā)（生）色團(tuán)：是指能在紫外-可見波長范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收的原子團(tuán)，如C＝C、C＝O、－C＝S、－NO2、－N＝N－等特點(diǎn):結(jié)構(gòu)中含有π→π*或n→π*躍遷的基團(tuán)第十六頁，共108頁。助色團(tuán)：是指本身不吸收紫外可見光，但與發(fā)色團(tuán)相連時(shí)，可使發(fā)色團(tuán)所產(chǎn)生的吸收峰紅移并使吸收強(qiáng)度增加的原子或原子團(tuán)。如－OH、－OR、－NH2、－SH、－X等。第十七頁，共108頁。紅移（長移）：吸收峰向長波方向移動(dòng)。如助色團(tuán)、共軛鍵的影響。藍(lán)移（短移）：吸收峰（λ）向短波方向移動(dòng)。如共軛鍵減少或溶劑的影響。濃色效應(yīng)和淡色效應(yīng)：使吸收強(qiáng)度（ε）增加稱濃色效應(yīng)。反之稱為淡色效應(yīng)或減色效應(yīng)。強(qiáng)帶和弱帶：化合物的紫外可見吸收光譜中，凡εmax大于104的吸收峰稱為強(qiáng)帶，凡εmax小于103的吸收峰稱為弱帶。第十八頁，共108頁。三吸收帶紫外-可見光譜為帶狀光譜，紫外-可見光譜中吸收峰稱為吸收帶R帶：由n→π*躍遷引起的吸收帶。如C＝O、－NO、－NO2、－N＝N－等特點(diǎn)：（1）λmax>250nm（2）ε<100，為弱吸收（3）溶劑的極性越大，λmax越小200nm250nm第十九頁，共108頁。例當(dāng)有強(qiáng)吸收峰在其附近時(shí)，R帶有時(shí)紅移，有時(shí)被掩蓋第二十頁，共108頁。K帶：由共軛雙鍵中π→π*躍遷所產(chǎn)生的吸收峰。如1,3-丁二烯。特點(diǎn)：（1）λmax=210-250nm（2）ε>104，為強(qiáng)吸收（3）溶劑的極性越大，λmax越大200nm250nm第二十一頁，共108頁。π-π

*躍遷，K帶第二十二頁，共108頁。π→π*躍遷，K帶n→π*躍遷，R帶，，200nm300nmAλK帶R帶第二十三頁，共108頁。B帶：苯環(huán)骨架振動(dòng)和環(huán)內(nèi)共軛π→π*重疊所致，是芳香族化合物的特征吸收帶。特點(diǎn):(1)在非極性的溶劑中，B帶230-270nm產(chǎn)生細(xì)微振動(dòng)第二十四頁，共108頁。（2）在極性的溶劑中，細(xì)微結(jié)構(gòu)消失，重心在256nm附近，ε在200左右。（3）被取代時(shí)，細(xì)微結(jié)構(gòu)消失（4）B帶是有機(jī)化合物的特征譜帶蒸氣在環(huán)已烷中在水中240nm260nm256nm第二十五頁，共108頁。E帶：由苯環(huán)結(jié)構(gòu)中三個(gè)乙烯的π→π*所產(chǎn)生，分為E1和E2帶。是苯環(huán)的特征吸收譜帶。E1帶：λ＝180nm，ε＝6×104

。E2帶：λ=200nmε＝8×103

。第二十六頁，共108頁。例：B帶λmax增大，282nmE2帶與K帶合并，移至210-250nmBRK

當(dāng)苯環(huán)上有發(fā)色團(tuán)取代并共軛時(shí)，E2帶與K帶合并，吸收帶長移，且使B帶長移。第二十七頁，共108頁。logε1030020010050040070060080012345遠(yuǎn)紫外區(qū)近紫外區(qū)可見光區(qū)σσ*ππ*π*σ＊nn波長(nm)幾種常見的紫外與可見吸收光譜π*nR帶K帶R帶第二十八頁，共108頁。運(yùn)用：預(yù)測一個(gè)化合物的吸收帶可能出現(xiàn)的范圍及吸收帶的類型。R帶（250-500nm）π*n共軛K帶（210-250nm）ππ

*第二十九頁，共108頁。影響吸收帶的因素1.位阻影響立體空間結(jié)構(gòu)影響共軛效應(yīng)。順式二苯乙烯反式二苯乙烯同分異構(gòu)體：第三十頁，共108頁。3.溶劑效應(yīng)：除了影響吸收峰（λ）位置外，還影響吸收強(qiáng)度（ε）和光譜形狀。溶劑極性對異丙叉丙酮的兩種躍遷吸收峰的影響躍遷類型正已烷氯仿甲醇水遷移π

-π

*230238237243長移n

-π

*329315309305短移第三十一頁，共108頁。4.體系pH值的影響：主要是對弱酸弱堿性物質(zhì)的影響。非極性溶劑極性溶劑非極性溶劑極性溶劑n→π*躍遷

π→π*躍遷

第三十二頁，共108頁?！?Lambert-Beer定律0I0btIt3.透光率T＝It/I0

百分透光率T％＝I/I0×100％4.比色池厚度：b5.樣品濃度：C（mol/l，％）6.吸光度：A＝－lgT=lg(I0/It)第三十三頁，共108頁。Lambert定律：C一定，A＝-lgT=K1bBeer定律：b一定，A＝-lgT=K2c兩定律合并：A＝a·b·ca=K1K2a為吸收系數(shù)注：吸光度A是指某一波長（λ）下的吸光強(qiáng)度即入射光為單色光第三十四頁，共108頁。吸收系數(shù)：摩爾吸收系數(shù)(ε)：在一定條件下，當(dāng)C＝1mol/l，b=1cm時(shí)的吸光度。百分吸收系數(shù)（）：一定條件下，當(dāng)C＝1％，b=1cm時(shí)的吸光度。第三十五頁，共108頁。特征：1）ε、E均為特征常數(shù)2）ε、E是有條件的，同一物質(zhì)，不同條件下所測值不同（波長不同、溶劑不同、溫度不同等）。3）ε、E越大，測定吸光度靈敏度越高。4）ε=104-105為強(qiáng)吸收，103-104為中吸收，<103為弱吸收。第三十六頁，共108頁。例：紫草素（C16H6O5288.3），2.00mg溶于100.0ml乙醇中，b=1cm，λmaxε、E注：若溶液中存在多種吸光物質(zhì)時(shí)，吸光度將是各組分吸光度的總和。A總＝Aa+Ab+Ac+……＝εadCa+εbdCb+εcdCc+……I0a、b、cId注：每種物質(zhì)的吸收度僅由本身的性質(zhì)和C決定，與其它物質(zhì)無關(guān)。第三十七頁，共108頁。吸光度A具有加和性，對同一物質(zhì)來說濃度（C）吸光度（A）001CA2C2A3C3A4C4A線性范圍：線性范圍越大越好。工作曲線CA負(fù)偏離正偏離C1第三十八頁，共108頁。三、偏離Beer定律的因素1)化學(xué)因素：離解、締合、配位等化學(xué)變化，使吸光物質(zhì)形態(tài)發(fā)生變化。溶劑、pH、溫度等影響。A＝a·b·c影響吸收系數(shù)a的因素有：1、物質(zhì)的性質(zhì)2、測定波長3、其它因素如溶劑的影響等第三十九頁，共108頁。ε×104亞甲藍(lán)陽離子水溶液的吸收光譜abc(a)6.36×10-6mol/l(b)1.27×10-4mol/l(c)5.97×10-4mol/lCA負(fù)偏離610nm660nm第四十頁，共108頁。2、光學(xué)因素（1）單色光的純度Beer定律前提：入射光是單色光。第四十一頁，共108頁。單色光I0I單色器復(fù)合光狹縫I0比色池760nm400nm可見光單色光的譜帶寬s=λ2-λ1510-520譜帶寬度的值愈小，單色性愈好。第四十二頁，共108頁。（2）雜散光:與所需波長相隔較遠(yuǎn)的光。IoIsIIs<第四十三頁，共108頁。（4）非平行光（3）散射、反射克服方法：比色池：擦干凈溶液：溶液均一，透明；用空白作參比。克服方法：比色池位置放正確，與光路垂直。第四十四頁，共108頁。三、透光率測量誤差透光率測量誤差（ΔT），來自儀器的噪聲。ΔC與T和ΔT有關(guān)第四十五頁，共108頁。不同T%或A時(shí)的濃度相對誤差

第四十六頁，共108頁。結(jié)論：當(dāng)A值在0.2-0.7，相對誤差較小，是測量最適宜范圍。第四十七頁，共108頁?！?顯色反應(yīng)及其顯色條件的選擇能吸收紫外光的物質(zhì)可用紫外光度法直接測定，無色或顏色淺的物質(zhì)，通常選用顯色反應(yīng)來測定。顯色反應(yīng):選用適當(dāng)?shù)脑噭┡c被測物質(zhì)定量反應(yīng)生成有色的物質(zhì)再進(jìn)行測定的分析方法。顯色反應(yīng)中所用的試劑稱為顯色劑。Fe2+與鄰二氮菲能生成穩(wěn)定的紅色配合物λmax=510nm(ε＝11000)，可用此反應(yīng)測定定微量鐵第四十八頁，共108頁。一、顯色反應(yīng)的選擇一般為配位反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、縮合反應(yīng)要求：1、定量關(guān)系明確2、靈敏度高3、產(chǎn)物穩(wěn)定性好4、顯色劑無干擾（一般相關(guān)60nm以上）5、選擇性好第四十九頁，共108頁。二、顯色條件的選擇提高反應(yīng)靈敏度、選擇性、穩(wěn)定性1、顯色劑的用量通常需要加入過量的顯色劑ababAACC第五十頁，共108頁。2、溶液酸度影響顯色劑存在形式和顯色產(chǎn)物的濃度第五十一頁，共108頁。3、顯色時(shí)間abAt注：確定實(shí)驗(yàn)方法要考察穩(wěn)定性。第五十二頁，共108頁。4、顯色溫度：顯色反應(yīng)結(jié)果與溫度有關(guān)。5、溶劑苦味酸在水溶液中呈黃色，而在氯仿中呈無色●顯色反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性也與溶劑有關(guān)●有些物質(zhì)溶解于不同的溶劑中，會出現(xiàn)不同的顏色第五十三頁，共108頁。三、測量條件的選擇干擾物質(zhì)的影響●干擾物質(zhì)本身有顏色或無色但與顯色劑形成有色化合物，且有吸收●干擾物質(zhì)水解，析出沉淀使溶液混濁●與待測離子或顯色劑形成更穩(wěn)定的化合物，使顯色反應(yīng)不能進(jìn)行完全第五十四頁，共108頁。消除干擾的方法：1、控制酸度控制合適的酸度可提高反應(yīng)的選擇性2、選擇適當(dāng)?shù)难诒蝿?、使其生成惰性配合物第五十五頁，共108頁。4、選擇合適的測量波長選擇原則“吸收最大，干擾最小”測定波長一般選擇在被測組分最大吸收波長處，此時(shí)A較大，測定靈敏度高如出現(xiàn)多個(gè)λmax，應(yīng)選擇干擾最小，A較大且平坦處的最大吸收波長第五十六頁，共108頁。KMnO4的測定一般選擇其525nm的λmax，如在K2Cr2O7存在下測量KMnO4，則應(yīng)選擇另一最大吸收波長λ=545nm第五十七頁，共108頁。5、選擇適宜的空白（參比）溶液吸光度值應(yīng)只反映被測物質(zhì)對光的吸收，要扣除其它因素的影響（溶劑、試劑、器皿、試樣都可能引入干擾）常用的空白溶液：第五十八頁，共108頁。①溶劑空白：用溶劑作為空白溶液

適用于在測定長波長下，溶液中只有被測組分對光有吸收，顯色劑及其它組分對光沒有吸收，或吸收很小第五十九頁，共108頁。②試劑空白：在相同條件下依次加入各種試劑和溶劑（不加試樣溶液）所得到的空白溶液。適用于在測定條件下，顯色劑或其他試劑、溶劑對待測組分的測定有干擾情況第六十頁，共108頁。③試樣空白：在與顯色反應(yīng)同樣條件下取同樣量試樣溶液，只是不加顯色劑所制備的空白溶液。

適用于試樣基體有色并在測定條件下有吸收，而顯色劑溶液不干擾測定，也不與試樣基體顯色的情況其它空白：不顯色空白、平行操作空白等第六十一頁，共108頁。6、分離利用化學(xué)反應(yīng)、萃取、色譜分離等方法除去干擾物質(zhì)第六十二頁，共108頁。控制吸光度測量范圍吸光度控制在0.2-0.7。方法：調(diào)節(jié)溶液的濃度改變吸收池的厚度第六十三頁，共108頁?！?紫外-可見分光光度計(jì)單色光I0I單色器復(fù)合光狹縫I0比色池檢測器記錄在紫外-可見光區(qū)可任意選擇不同波長的光測定吸光度的儀器

第六十四頁，共108頁。（一）光源要求：發(fā)射強(qiáng)度高、穩(wěn)定、具有連續(xù)光譜●鎢燈和鎢鹵燈：波長覆蓋寬，但紫外區(qū)很弱。常取波長大于350nm的光為可見區(qū)光源●氫燈和氘燈：發(fā)出波長為150-400nm的連續(xù)光譜。一、主要部件第六十五頁，共108頁。（二）單色器從光源的連續(xù)光譜中分出單色光組成：進(jìn)口狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件、出口狹縫單色器光路示意圖第六十六頁，共108頁。1）色散元件：棱鏡和光柵棱鏡:利用其對不同波長的光有不同的折射率。缺點(diǎn)：色散后光譜按波長排列疏密不均，長波區(qū)密，短波區(qū)疏。為非均勻分布光譜。分光系統(tǒng)紅紫第六十七頁，共108頁。光柵:利用光的干涉作用。特點(diǎn)：色散后的光譜，各譜線間距離相等，為均勻分布的連續(xù)光譜。第六十八頁，共108頁。2）準(zhǔn)直鏡：以狹縫為焦點(diǎn)的聚光鏡。將發(fā)散光變?yōu)槠叫泄?，將色散后的平行光聚焦。第六十九頁，?08頁。3）狹縫：狹縫寬度直接影響分光質(zhì)量。過寬，單色光不純，太窄，光通量小，降低靈敏度。第七十頁，共108頁。（三）吸收池（比色池、比色皿）●玻璃比色皿，只能用于可見光區(qū)。●石英比色皿，可用于紫外光區(qū)和可見光區(qū)。第七十一頁，共108頁。（四）檢測器將光能轉(zhuǎn)變成電能的裝置。光電池：是一種光敏半導(dǎo)體。要求：靈敏度高，噪聲低分類：硒光電池和硅光電池。特點(diǎn)：光電流大小與照射光強(qiáng)成正比。光電流不易放大，光強(qiáng)弱時(shí)，不能測量。易“疲勞”，不能長時(shí)間使用。A第七十二頁，共108頁。光電管光陽極光敏陰極放大器指示器特點(diǎn)：電流可放大，較有高靈敏度。有“疲勞現(xiàn)象”第七十三頁，共108頁。光電倍增管光電倍增管大大提高了儀器測量的靈敏度。第七十四頁，共108頁。光二極管陣列檢測器：由一系列的二極管緊密排列在一塊硅晶體片上組成。光例：HP8452A型二極管陣列：波長范圍為190-820nm，二極管316個(gè)。λA特點(diǎn)：測量速度快第七十五頁，共108頁。（五）信號顯示系統(tǒng)（記錄系統(tǒng)）分類：指針顯示數(shù)字顯示第七十六頁，共108頁。二、分光光度計(jì)的類型1、單光束分光光度計(jì)特點(diǎn)：儀器結(jié)構(gòu)簡單，靈敏度高，但對光源發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定性要求高。第七十七頁，共108頁。2、雙光束分光光度計(jì)特點(diǎn)：可減免因光源強(qiáng)度不穩(wěn)而引入的誤差，但靈敏度較單光束差。第七十八頁，共108頁。3、雙波長分光光度計(jì)將同一光源發(fā)出的光分為兩束，分別經(jīng)過兩個(gè)單色器，從而可以同時(shí)得到兩個(gè)波長（λ1和λ2）的單色光，兩個(gè)波長的單色光交替地照射同一溶液，檢測其信號能測定高濃度試樣，多組分混合試樣及渾濁試樣第七十九頁，共108頁。4、二極管陣列檢測的分光光度計(jì)特點(diǎn)：全波長測定，測定速度快。第八十頁，共108頁?！?分析方法一、定性方法光譜特征：光譜形狀、吸收峰數(shù)目、吸收峰

波長、強(qiáng)度和吸收系數(shù)定性依據(jù)：1、結(jié)構(gòu)相同的化合物在相同條件下有完全相同的吸收光譜第八十一頁，共108頁。2、吸收光譜不同，一定不是相同物質(zhì)。3、吸收光譜相同，可能是相同物質(zhì)。定性鑒別方法：對比法▲將樣品與對照品的光譜進(jìn)行對照、比較▲將樣品光譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比較第八十二頁，共108頁。1、比較吸收光譜三種甾體激素的紫外吸收光譜（10mg/ml甲醇溶液）第八十三頁，共108頁。2、比較吸收光譜的特征數(shù)據(jù)比較λmax、ε或例2安宮黃體酮（Mr=386.5）和炔諾酮（Mr=298.4）λmax240±1nm=408λmax240±1nm=571第八十四頁，共108頁。3、比較吸光度（吸光系數(shù)）的比值不只一個(gè)吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰處測得吸光度比值作為鑒別的依據(jù)?？上^對誤差(或濃度、吸收池厚度)。第八十五頁，共108頁。例3《中國藥典》（2005年版）對維生素B12采用下述方法鑒別：將檢品按規(guī)定方法配成25mg/ml的溶液，分別測定278nm、361nm和550nm處的吸光度A1、A2和A3，A2/A1應(yīng)為1.70～1.88；A2/A3應(yīng)為3.15～3.45。第八十六頁，共108頁。推測分子骨架、判斷發(fā)色團(tuán)之間的共軛關(guān)系、估計(jì)共軛體系中取代基的種類、位置及數(shù)目等二、結(jié)構(gòu)分析第八十七頁，共108頁。1、從吸收光譜中初步推斷官能團(tuán)紫外光譜提供的信息①化合物在220～700nm內(nèi)無吸收，其可能是脂肪烴、脂環(huán)烴或其衍生物，還可能是非共軛烯烴②220～250nm范圍有強(qiáng)吸收帶說明分子結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)共軛體系（共軛二烯或α、β-不飽和醛、酮）第八十八頁，共108頁。③200～250nm范圍有強(qiáng)吸收帶（lgε3~4），250-290nm范圍有中等強(qiáng)度吸收帶（lgε2-3）或有精細(xì)結(jié)構(gòu)，說明結(jié)構(gòu)中含有苯基④250～350nm范圍有弱吸收帶（R帶），說明分子結(jié)構(gòu)中含有醛、酮羰基或共軛羰基。⑤300nm以上的強(qiáng)吸收帶，說明化合物具有兩個(gè)以上較大的共軛體系。若吸收強(qiáng)且具有明顯的精細(xì)結(jié)構(gòu)，說明為稠環(huán)芳烴、稠環(huán)雜芳烴或其衍生物。第八十九頁，共108頁。2、判斷順反異構(gòu)體空間位阻的影響第九十頁，共108頁。3、判斷互變異構(gòu)體某些有機(jī)物在溶液中可能有兩個(gè)或兩個(gè)以上容易互變的異構(gòu)體。例如，乙酰乙酸乙酯是比較典型的具有酮式和烯醇

式互變異構(gòu)的化合物：酮式烯醇式在204nm處有弱吸收在245nm處有強(qiáng)吸收第九十一頁，共108頁。三、純度檢查利用待測物與雜質(zhì)在紫外-可見光區(qū)吸收的差異，選用適當(dāng)波長可以進(jìn)行待測物的純度檢查腎上腺素（虛線）與腎上腺酮的吸收光譜《中國藥典》（05版）中規(guī)定2mg/ml的樣品溶液在310nm處的吸收度不得超過0.05，限量為0.06%（吸收系數(shù)為453）。第九十二頁，共108頁。四、定量分析（一）單組分分析常用的單組分定量分析方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)對照法、吸收系數(shù)法等第九十三頁，共108頁。1、工作曲線法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）步驟：①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光度，繪制曲線。②測定樣品吸光度。③從標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程中求樣品濃度。第九十四頁，共108頁。標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)注意的問題（1）制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線至少要5~7個(gè)點(diǎn)（2）待測液濃度應(yīng)包括在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)（3）供試品溶液和對照品溶液必須在相同的操

作條件下測定。（4）儀器更換元件，維修或重新校正波長時(shí)，

必須重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。第九十五頁，共108頁。不過原點(diǎn)的原因：（