上海市臨檢中心 PCR人員上崗培訓(xùn)班 課件5、2016年P(guān)CR培訓(xùn)班課件-鮑蕓

個(gè)體化藥學(xué)基因檢測(cè)及質(zhì)量控制上海市臨床檢驗(yàn)中心分子生物學(xué)室

鮑蕓2016.3上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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LaboratoryOutline藥物基因組學(xué)檢測(cè)技術(shù)質(zhì)量控制上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory第一部分：藥物基因組學(xué)上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory個(gè)體化用藥意義長(zhǎng)期以來(lái)，人們已經(jīng)習(xí)慣了針對(duì)同一種疾病按照相同的劑量服用同樣的藥物。但科學(xué)的發(fā)展已經(jīng)使人們認(rèn)識(shí)到，藥物反應(yīng)（包括療效和毒性）存在著極大的個(gè)體差異。解決藥物治療過(guò)程中療效和/或副作用個(gè)體差異的問(wèn)題?

具體的藥物對(duì)具體的患者適用不適用,藥物選擇?

具體的患者對(duì)具體的藥物敏感不敏感,劑量選擇?

藥物配伍時(shí)的相互作用的強(qiáng)弱,

處方選擇上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory藥物基因組學(xué)（Pharmacogenomics）研究基因序列多態(tài)性與藥物效應(yīng)多樣性之間的關(guān)系，即基因本身及其突變體與藥物效應(yīng)相互關(guān)系的一門(mén)科學(xué)。藥物基因組學(xué)是以藥物效應(yīng)及安全性為目標(biāo)，研究各種基因變異與藥效及安全性的關(guān)系。不以發(fā)現(xiàn)人體基因組基因?yàn)橹饕康暮?jiǎn)單運(yùn)用已知的基因理論知識(shí)改善病人的治療上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory藥物基因組學(xué)（Pharmacogenomics）20世紀(jì)50年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)不同遺傳背景會(huì)導(dǎo)致藥物反應(yīng)的差異。20世紀(jì)80年代，發(fā)現(xiàn)基因組中每500-1000個(gè)堿基存在1個(gè)變異，即基因位點(diǎn)多態(tài)性。許多藥物相關(guān)酶基因具有多態(tài)性，并由此建立藥物基因組學(xué)。20世紀(jì)90年代，世界上第一家基因與制藥公司成立，研究藥物基因組學(xué)。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory藥物相關(guān)基因的分類(lèi)?

基于目前的認(rèn)識(shí)，藥物相關(guān)基因大致分為四類(lèi)：參與藥物代謝過(guò)程的酶與藥物結(jié)合的受體藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜通道信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory藥物代謝酶藥物代謝即藥物生物轉(zhuǎn)化，可分為2相：第I相：通過(guò)藥物分子的氧化、還原、水解等引入極性集團(tuán)。需要有藥物代謝酶的催化，其中最主要的代謝酶是細(xì)胞色素P450（CYP）酶系。第II相：極性集團(tuán)與受體內(nèi)源性成分結(jié)合，生成極性強(qiáng)、水溶性好、藥理惰性的化合物。催化該反應(yīng)的酶主要是硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（TPMT）、N-乙?；D(zhuǎn)移酶（NAT）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory藥物代謝酶—P450家族

目前臨床所用的藥物中，約80%的I相代謝反應(yīng)由CYP家族酶催化，是藥物代謝的主要酶系。

有報(bào)道的由于基因多態(tài)性引起的不良反應(yīng)中，80%是被CYP酶催化的藥物。

目前已發(fā)現(xiàn)至少有53個(gè)CYP基因，其中有顯著意義的基因多態(tài)性的酶有CYP2C19、CYP2C9、CYP3A、CYP2D6等。

CYP3A催化許多內(nèi)源性物質(zhì)的代謝，如睪酮及可的松的6-β-羥化代謝。

CYP2C19參與代謝多種藥物，如質(zhì)子泵抑制劑、抗抑郁類(lèi)及抗癲癇類(lèi)藥等。

CYP2C9參與華法林、醋酸香豆素、甲苯磺丁脲等藥物代謝。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory藥物代謝酶—P450家族上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory藥物代謝酶—P450家族CYP2B6,

3%CYP2E1,

4%CYP2A6,

3%各亞家族CYP2C19,

8%CYP3A4/5,

36%酶代謝藥物比例CYP1A2,

11%CYP2C8/9,

16%CYP2D6,

19%上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory藥物代謝酶—P450家族

遺傳多態(tài)性使其表達(dá)的酶活性存在差異，根據(jù)個(gè)體的酶活性高低可分為強(qiáng)代謝型和弱代謝型。表型定義動(dòng)力學(xué)結(jié)果臨床表現(xiàn)野生型，兩個(gè)等位基因表達(dá)的蛋白具有正常的酶活強(qiáng)代謝型（EM）代謝標(biāo)準(zhǔn)的藥物劑量正常的藥物反應(yīng)1、加強(qiáng)藥物的反應(yīng)與毒性2、延長(zhǎng)藥物效應(yīng)及毒性時(shí)間，增強(qiáng)藥物反應(yīng)及毒性3、可能生成有活性或毒性的代謝物4、某些前體藥物的有效代謝產(chǎn)物生成減少或缺乏，致使治療失敗1、降低的首過(guò)效應(yīng)，產(chǎn)生增加劑量，升高血漿濃度水平弱代謝型

不具有酶活性或酶活

2、降低清除率，延長(zhǎng)半衰期，（PM）性極低藥物在體內(nèi)累積3、改變代謝途徑4、不產(chǎn)生活性代謝物上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory華法林(Warfarin)代謝受CYP2C9基因型影響HigashiMK,etal.

JAMA

287:1690-1698,

2002.上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory華法林(Warfarin)代謝受CYP2C9基因型影響上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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LaboratoryWhat

is

a

SNP?C>TSNP指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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LaboratoryWhat

is

a

SNP?

Single

Nucleotide

Polymorphisms（單核苷酸多態(tài)性），在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入。

變異形式以轉(zhuǎn)換和顛換為主，二者之比為2：1。SNP多在CG序列上出現(xiàn)，而且多是C

>T

。

SNP發(fā)生率>0.1%

,人類(lèi)基因組上的SNP總量大概是3×106個(gè)。

是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種，人體許多表型差異、對(duì)藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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LaboratorySNP重要性

藥物基因組學(xué)

與人類(lèi)健康相關(guān)的基因（eg.肥胖、酒精代謝）

每個(gè)基因中都存在相關(guān)的遺傳標(biāo)記（包含非編碼區(qū)域的位點(diǎn)）。

快速、準(zhǔn)確、低成本的基因分型。

人群多樣性和遷徙歷史上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory等位基因和基因型(genotype)等位基因(alle)指位于基因型(genotyp)指某一生物個(gè)體一對(duì)同源染色體的相同位

一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的特定遺傳變異。置上控制著相對(duì)性狀的一

通常指的是兩條染色體同一位點(diǎn)的對(duì)基因。多態(tài)性。如A/A,A/G或

G/G。第二部分：檢測(cè)技術(shù)上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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LaboratorySNP分型技術(shù)

基因芯片技術(shù)是在固相支持介質(zhì)上進(jìn)行分子雜交和原位熒光檢測(cè)的一種高通量SNP分析方法。

Taqman探針技術(shù)在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入2種不同熒光標(biāo)記的探針，他們分別與兩個(gè)等位基因完全配對(duì)。測(cè)序法Sanger測(cè)序焦磷酸測(cè)序法

PCR-RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法）分型技術(shù)

飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）

MultiplexSNaPshot分型技術(shù)檢測(cè)技術(shù)—基因芯片技術(shù)基因芯片（gene

chip）又稱DNA微陣列（microarray）,是將大量DNA片段通過(guò)一定方式固定于某種固相載體（如含硅玻璃片）表面形成致密、有序的DNA分子點(diǎn)陣。檢測(cè)技術(shù)—基因芯片技術(shù)主要技術(shù)包括：

芯片制備：先將玻璃片或硅片進(jìn)行表面處理，然后使DNA片段或蛋白質(zhì)分子按順序排列在芯片上。

樣本制備：將樣品進(jìn)行提取、擴(kuò)增。獲取對(duì)象可以是蛋白質(zhì)或DNA、RNA，然后用熒光標(biāo)記。

雜交反應(yīng)：雜交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行的反應(yīng)的過(guò)程。合適的反應(yīng)條件能使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少錯(cuò)配率。

信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析：雜交反應(yīng)后的芯片上各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的熒光位置、熒光強(qiáng)弱經(jīng)過(guò)芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，獲得有關(guān)生物信息。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory基因芯片技術(shù)基本流程圖檢測(cè)技術(shù)—基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)掃描結(jié)果示意圖上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory檢測(cè)技術(shù)—Taqman探針技術(shù)Taqman探針技術(shù)：在pcr反應(yīng)系統(tǒng)中加入2種不同熒光標(biāo)記的探針，他們分別與兩個(gè)等位基因完全配對(duì)。探針的5’端和3’端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)溶液中存在PCR產(chǎn)物時(shí)，該探針與模板退火，即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而將探針5’-端連接的熒光分子從探針上切割下來(lái)，破壞兩熒光分子間的PRET，發(fā)出熒光。通常用于少量SNP位點(diǎn)分析。檢測(cè)技術(shù)—Taqman探針技術(shù)檢測(cè)技術(shù)—測(cè)序法Sanger測(cè)序仍是目前基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。相對(duì)于其他分型技術(shù)具有最高的準(zhǔn)確性，并能檢測(cè)新的突變。焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)是一種新型的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)，焦磷酸測(cè)序法適于對(duì)已知的短序列的測(cè)序分析上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory檢測(cè)技術(shù)—

Sanger雙末端終止法測(cè)序1977年，英國(guó)人Frederick

Sanger

創(chuàng)建了雙脫氧鏈末端合成終止法（chaintermination

method），簡(jiǎn)稱Sanger法、雙脫氧法或酶法。他發(fā)現(xiàn)如果在DNA復(fù)制過(guò)程中摻入ddNTP，就會(huì)產(chǎn)生一系列末端終止的DNA鏈，并能通過(guò)電泳按長(zhǎng)度分辨。不同末端終止DNA鏈的長(zhǎng)度是由摻入到新合成鏈上隨機(jī)位置的ddNTP決定的。Frederick

Sanger

：1980年因發(fā)明測(cè)序技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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LaboratorySanger雙末端終止法測(cè)序基本原理是利用DNA聚合酶，以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加

入

不

同

的

雙

脫

氧

核

苷

三

磷

酸

（

dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測(cè)序引物引導(dǎo)下，按照堿基配對(duì)原則，每個(gè)反應(yīng)體系中合成一系列長(zhǎng)短不一的引物延伸鏈，通過(guò)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后，從凝膠底部到頂部按5′→3′方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列

。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory自動(dòng)化測(cè)序測(cè)序流程--ABI測(cè)序儀熒光標(biāo)記BigDye

Terminators；美國(guó)ABI公司擁有專利四色熒光分別標(biāo)記的起鏈終止劑作用的四種ddNTPs，與四個(gè)反應(yīng)管循環(huán)測(cè)序反應(yīng)及四個(gè)泳道電泳檢測(cè)的傳統(tǒng)雙脫氧鏈終止法相比，實(shí)現(xiàn)了一個(gè)反應(yīng)管完成反應(yīng)與一個(gè)電泳道檢測(cè)。由于使用了四色熒光分別標(biāo)記了四種ddNTPs，可按照四種不同熒光來(lái)分別識(shí)別A、T、G、C，因此，可在一個(gè)反應(yīng)管中完成循環(huán)測(cè)序反應(yīng)，并通過(guò)一個(gè)電泳道電泳即可完成測(cè)序任務(wù)。具有分辨率高、重現(xiàn)性好、靈敏度高、快速和易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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LaboratorySanger測(cè)序法基本檢測(cè)流程O(píng)RTargetregion

PCR

amplification第三部分：質(zhì)量控制上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory質(zhì)量控制藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)相關(guān)基因的檢測(cè)質(zhì)量控制與保證是個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證的核心內(nèi)容，是個(gè)體化用藥基因診斷規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的首要前提。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory質(zhì)量控制

分析前質(zhì)量保證

分析中質(zhì)量保證

分析后質(zhì)量保證上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析前質(zhì)量保證

采樣前準(zhǔn)備

標(biāo)本采集

標(biāo)本的運(yùn)輸與保存

標(biāo)本的接收與保存上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析前—采樣前準(zhǔn)備

分子診斷項(xiàng)目的申請(qǐng)與完善?

填寫(xiě)規(guī)范的申請(qǐng)單：包含足夠的信息，識(shí)別患者和有資質(zhì)開(kāi)具申請(qǐng)單的醫(yī)生?

優(yōu)化檢測(cè)項(xiàng)目：檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)與臨床醫(yī)生溝通，幫助醫(yī)生合理解釋檢驗(yàn)結(jié)果，接收合理的反饋意見(jiàn)

患者的正確識(shí)別及知情同意?

采集管上患者信息標(biāo)識(shí)：通常應(yīng)包括姓名、送檢醫(yī)院及科室、住院號(hào)等。采樣前需首先核對(duì)確定患者的身份，核實(shí)能標(biāo)示患者的信息。?

患者知情同意：告知患者所檢測(cè)項(xiàng)目的目的、意義、基本過(guò)程、項(xiàng)目可能存在的不足如檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)與臨床用藥實(shí)際不相符的情況、剩余核酸的去向及保存時(shí)間，保護(hù)受檢者的個(gè)人隱私。

送檢單的填寫(xiě)與項(xiàng)目的復(fù)核?

申請(qǐng)單需填寫(xiě)的信息包括：申請(qǐng)的檢測(cè)項(xiàng)目、標(biāo)本編號(hào)、受檢者姓名、性別、出生日期、民族、采樣日期及時(shí)間、標(biāo)本來(lái)源（組織類(lèi)型）、相關(guān)臨床資料（如身高、體重、疾病診斷、疾病分型分期、合并疾病、用藥情況）、采樣單位及科室名稱、送檢醫(yī)師姓名等信息。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析前—標(biāo)本采集按要求建立標(biāo)本采集SOP。人員進(jìn)行系統(tǒng)培訓(xùn)。采樣前應(yīng)對(duì)標(biāo)本采集容器進(jìn)行評(píng)價(jià)，確保容器本身不會(huì)干擾測(cè)定過(guò)程，并保存評(píng)估記錄。所用的材料如注射器、棉簽、拭子等應(yīng)為一次性使用，以防止污染。無(wú)論采集哪種類(lèi)型的標(biāo)本，采樣時(shí)都必須戴手套，以避免標(biāo)本中病原微生物感染和皮膚脫落細(xì)胞對(duì)標(biāo)本的污染。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析前—標(biāo)本采集

全血和骨髓樣本?

一般用EDTA或枸櫞酸鹽抗凝，避免用肝素（抑制PCR反應(yīng)）。?

全血標(biāo)本采集外周靜脈血2~3

mL并置于采血管中。?

如檢測(cè)目的是細(xì)胞內(nèi)RNA，建議用含RNA穩(wěn)定劑的采樣管，或采樣后盡快將全血或骨髓加入到RNA穩(wěn)定溶液中

組織標(biāo)本?

新鮮組織和活檢組織：采樣大小取決于組織類(lèi)型。?

石蠟包埋組織：推薦用10％中性緩沖甲醛溶液固定組織標(biāo)本，避免使用含重金屬離子的固定液如Bouin液等。?

組織切片：用于DNA檢測(cè)時(shí)，手術(shù)標(biāo)本需提供10

μm厚的石蠟切片4～8張，面積為成人拇指蓋大小；活檢穿刺標(biāo)本提供10

μm厚切片8～10張。

口腔脫落細(xì)胞?

可同時(shí)用于DNA和RNA分析。?

口腔拭子，患者清水漱口后，將消毒醫(yī)用棉簽伸進(jìn)口腔，在口腔內(nèi)側(cè)臉頰粘膜處左右反復(fù)擦拭20次左右，取出棉簽，將棉簽置于干凈濾紙上陰干，至少棉簽3根。棉簽立即放入干凈封口塑料袋內(nèi)封閉并放入紙質(zhì)信封，信封上應(yīng)做好詳細(xì)標(biāo)記。濾紙應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌處理。漱口標(biāo)本也可作為口腔脫落細(xì)胞的來(lái)源。?

用于RNA分析的口腔脫落細(xì)胞必須保存在RNA穩(wěn)定劑中。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析前—標(biāo)本的運(yùn)輸與保存分子檢測(cè)人員應(yīng)熟知標(biāo)本運(yùn)送與保存的條件要求。標(biāo)本一經(jīng)采集，應(yīng)盡快送到臨檢實(shí)驗(yàn)室。臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定樣本運(yùn)輸與保存的SOP。在運(yùn)送工具的選擇、標(biāo)本的運(yùn)送和保存環(huán)境等方面應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定執(zhí)行。運(yùn)送過(guò)程中應(yīng)防止盛放標(biāo)本的容器破碎和標(biāo)本丟失，注意標(biāo)本的隔離、封裝、容器的密閉。標(biāo)本應(yīng)標(biāo)明采集的日期和時(shí)間、運(yùn)送時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室接收時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室接收時(shí)標(biāo)本的溫度。運(yùn)送條件根據(jù)標(biāo)本類(lèi)型和待測(cè)靶核酸的性質(zhì)而定。DNA分析應(yīng)在采集后8小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，否則需低溫運(yùn)送。當(dāng)待測(cè)核酸為RNA時(shí)，能在10分鐘內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)本可室溫運(yùn)送；如果運(yùn)送時(shí)間較長(zhǎng)，則應(yīng)將標(biāo)本置于干冰中，4小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；如果標(biāo)本中添加了RNA穩(wěn)定劑，則可室溫運(yùn)送或郵寄。標(biāo)本的長(zhǎng)距離運(yùn)送應(yīng)符合生物安全要求。標(biāo)本運(yùn)輸人員應(yīng)接受適用于標(biāo)本類(lèi)型和遠(yuǎn)程運(yùn)輸?shù)陌踩桶b程序的培訓(xùn)。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析前—標(biāo)本的接收與保存

標(biāo)本的驗(yàn)收、接受與拒收：

檢查項(xiàng)目包括：申請(qǐng)單的項(xiàng)目填寫(xiě)、標(biāo)識(shí)；申請(qǐng)單有無(wú)醫(yī)師簽字；所填項(xiàng)目是否與標(biāo)本所示一致；申請(qǐng)單姓名、科別、門(mén)診或住院號(hào)；知情同意書(shū)；標(biāo)本采集及送檢之間的時(shí)間間隔（要求采樣1周以內(nèi)）；檢查標(biāo)本的量和外觀質(zhì)量，血液標(biāo)本的外觀質(zhì)量包括采血管是否密閉、有無(wú)溶血、管壁有無(wú)破損、標(biāo)本是否有明顯的污染跡象（如開(kāi)蓋），樣本接收時(shí)的溫度，樣本量是否符合要求。

拒收無(wú)標(biāo)簽、標(biāo)簽不清晰、采血管破裂、已開(kāi)蓋、運(yùn)送時(shí)間超過(guò)1周的樣本。拒收標(biāo)本時(shí)應(yīng)及時(shí)與送檢單位聯(lián)系，要求重新采樣或重新送樣。每個(gè)接受的合格標(biāo)本均應(yīng)分配一個(gè)唯一的標(biāo)識(shí)碼。樣本簽收時(shí)實(shí)行送樣人和收樣人雙簽名制度。

樣本的登記與錄入：樣本簽收后立即登記樣本基本信息，收樣日期和時(shí)間，并盡快將標(biāo)本信息錄入實(shí)驗(yàn)室（或醫(yī)院）信息系統(tǒng)，后續(xù)的操作過(guò)程及樣本保存均用唯一編號(hào)。

標(biāo)本預(yù)處理：部分送檢標(biāo)本到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后需進(jìn)行預(yù)處理，如保存于濾紙上的血液標(biāo)本需采用穿孔機(jī)將濾紙上的血斑取下裝入離心管中，用溶解液沖洗浸泡濾紙，搖床上室溫孵育以除去濾紙上的血紅蛋白。甲醛固定石蠟包埋組織在進(jìn)行核酸檢測(cè)前需進(jìn)行徹底的脫蠟。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析中質(zhì)量保證

實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要求

檢測(cè)方法

儀器設(shè)備的使用、維護(hù)與保養(yǎng)

人員培訓(xùn)

檢測(cè)體系的性能驗(yàn)證上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析中質(zhì)量保證—實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要求原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》要求進(jìn)行設(shè)置，并按要求嚴(yán)格控制空氣流向，避免PCR產(chǎn)物污染。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析中質(zhì)量保證—檢測(cè)方法方

法優(yōu)

點(diǎn)缺

點(diǎn)適用性通量較高，操作簡(jiǎn)單，儀器設(shè)備

探針較昂貴易普及。對(duì)相同位點(diǎn)、大樣本標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，可用于mRNA表達(dá)檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光PCR高通量，高靈敏度，可以檢測(cè)插

需要特殊儀器設(shè)備。入/缺失突變和未知突變。等位適合于較大樣本、突變比例高于5％的各種類(lèi)型SNP檢測(cè)、甲基化位點(diǎn)的確定。焦磷酸測(cè)序基因含量的比例可用于室內(nèi)質(zhì)控。直接獲取序列，分型的金標(biāo)準(zhǔn)，

通量低，不能檢測(cè)突變比

各種SNP的檢測(cè)，未知突變的篩查以可發(fā)現(xiàn)未知突變。

例小于20％的SNP。

及驗(yàn)證其他分型的結(jié)果。Sanger測(cè)序法PCR-RFLP無(wú)需特殊的儀器設(shè)備，成本較低，通量低，只適用于部分SNP

適用于無(wú)條件夠買(mǎi)貴重儀器設(shè)備的實(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)。

分型

驗(yàn)室開(kāi)展小樣本的分型檢測(cè)。通量高靈活度低，成本高，需要

適用于具備芯片檢測(cè)能力的實(shí)驗(yàn)室對(duì)特殊的儀器設(shè)備。

已知固定位點(diǎn)、大樣本標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)?；蛐酒ㄔ诩?xì)胞核原位對(duì)基因的異常進(jìn)行

成本高，通量低，時(shí)間較

適于對(duì)基因擴(kuò)增和缺失異常進(jìn)行檢測(cè)。原位雜交（FISH）檢測(cè)長(zhǎng)。分析中質(zhì)量保證—儀器設(shè)備的使用、維護(hù)與保養(yǎng)參考生產(chǎn)商提供的操作說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)書(shū)面的、有案可查的預(yù)防性維護(hù)及校準(zhǔn)計(jì)劃，確定儀器設(shè)備的維護(hù)周期，建立儀器設(shè)備日常維護(hù)的SOP。對(duì)于某些計(jì)量分析儀器(如移液器等），應(yīng)依照我國(guó)計(jì)量法規(guī)定，由計(jì)量檢定機(jī)構(gòu)定期進(jìn)行校驗(yàn)，并保存好校驗(yàn)證書(shū)。加熱系統(tǒng)及冰箱等設(shè)備的維護(hù)包括對(duì)溫度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。儀器維護(hù)過(guò)程中要注意清潔劑的使用，每臺(tái)儀器應(yīng)該配備專用的清潔工具。在例行儀器的維護(hù)和保養(yǎng)后，應(yīng)填寫(xiě)儀器維護(hù)保養(yǎng)記錄表。如使用或維護(hù)中發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，應(yīng)及時(shí)匯報(bào)并將出現(xiàn)的問(wèn)題詳細(xì)記錄，專業(yè)工程師上門(mén)維修，最后由維護(hù)操作人員簽名。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析中質(zhì)量保證—人員培訓(xùn)操作人員需要有一定的專業(yè)技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)才能獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)結(jié)果。加強(qiáng)人員培訓(xùn)是確保檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵。人員培訓(xùn)分為入職培訓(xùn)、內(nèi)部培訓(xùn)和外部培訓(xùn)。掌握和建立安全操作的概念、“防污染”的概念、具備獨(dú)立進(jìn)行質(zhì)控活動(dòng)和儀器維護(hù)的能力，可對(duì)試劑和質(zhì)控品的出入庫(kù)及使用情況、設(shè)備保養(yǎng)等情況進(jìn)行準(zhǔn)確記錄，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員開(kāi)展內(nèi)部培訓(xùn)，進(jìn)行處事能力考核和周期性能力再考核。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析中質(zhì)量保證—檢測(cè)體系性能驗(yàn)證定性檢測(cè)的性能驗(yàn)證指標(biāo)主要包括重復(fù)性/精密度、準(zhǔn)確度（突變型的檢測(cè)能力）、分析特異性、檢出限等。定量檢測(cè)監(jiān)測(cè)體系性能驗(yàn)證的指標(biāo)主要包括準(zhǔn)確度、精密度、線性、可報(bào)告范圍、檢出限、參考區(qū)間、靈敏度、特異性等。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析后質(zhì)量保證

檢測(cè)報(bào)告、解釋及報(bào)告發(fā)放

檢測(cè)后樣本的保存和處理上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析后質(zhì)量保證—檢測(cè)報(bào)告、解釋及報(bào)告發(fā)放檢測(cè)報(bào)告的內(nèi)容及要求檢測(cè)結(jié)果的解釋檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告流程與發(fā)放檢測(cè)后咨詢服務(wù)上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析后質(zhì)量保證—檢測(cè)報(bào)告的內(nèi)容及要求

報(bào)告單要求有統(tǒng)一的格式和內(nèi)容，報(bào)告應(yīng)包含：醫(yī)療機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室名稱、項(xiàng)目名稱、標(biāo)本編號(hào)或條碼、送檢單位及（或）科室名稱、患者信息（姓名、性別、年齡）、標(biāo)本類(lèi)型、標(biāo)本采集與接收時(shí)間、送檢醫(yī)生姓名、疾病診斷、報(bào)告單出具的時(shí)間、標(biāo)本處理過(guò)程、檢測(cè)方法和主要設(shè)備、檢測(cè)過(guò)程、檢測(cè)結(jié)果并附相關(guān)圖表、結(jié)果解釋、用藥方案建議、檢測(cè)的局限、必要的參考文獻(xiàn)、檢測(cè)人員、審核人員和復(fù)核人員簽字、結(jié)果報(bào)告日期和備注，檢測(cè)單位聯(lián)系信息。

檢測(cè)結(jié)果應(yīng)以清晰易讀且易被醫(yī)師和患者理解的形式進(jìn)行報(bào)告，報(bào)告單上應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)化的基因命名和計(jì)量單位。定量檢測(cè)應(yīng)注明參考區(qū)間、檢測(cè)方法的線性或測(cè)定范圍；定性檢測(cè)可直接寫(xiě)基因型、基因擴(kuò)增有或無(wú)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定的程度（低、中、高）、甲基化有無(wú)等。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析后質(zhì)量保證—檢測(cè)結(jié)果的解釋根據(jù)個(gè)體的遺傳信息調(diào)整用藥劑量，以增加藥物療效，減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。

藥物劑量的調(diào)整往往需根據(jù)隨機(jī)對(duì)照臨床研究的結(jié)果；對(duì)目前缺乏隨機(jī)對(duì)照臨床研究的遺傳變異，可依據(jù)基因型對(duì)藥物藥代動(dòng)力學(xué)曲線下面積影響的大小估算用藥劑量；當(dāng)一個(gè)藥物的反應(yīng)性受多個(gè)基因或基因與環(huán)境因素間相互作用影響時(shí)，可根據(jù)國(guó)內(nèi)國(guó)際大規(guī)模臨床試驗(yàn)推導(dǎo)出的、納入了個(gè)體基因型及其他因素的用藥劑量計(jì)算公式確定用藥劑量。根據(jù)個(gè)體的遺傳信息確定用藥的種類(lèi)，避免應(yīng)用針對(duì)特定基因型個(gè)體無(wú)效或可能產(chǎn)生嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)的藥物。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析后質(zhì)量保證—檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告流程與發(fā)放

首先要對(duì)檢測(cè)結(jié)果報(bào)告進(jìn)行審核分析，包括審核檢測(cè)過(guò)程的有效性，受檢者的基本信息，結(jié)果數(shù)據(jù)分析。審核者應(yīng)當(dāng)是主管技師以上的工作人員、本專業(yè)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人、高年資檢驗(yàn)人員和臨床實(shí)驗(yàn)室主任授權(quán)人，審核者對(duì)檢驗(yàn)報(bào)告的質(zhì)量負(fù)責(zé)。

應(yīng)建立檢測(cè)報(bào)告單發(fā)出和管理制度。明確檢測(cè)結(jié)果報(bào)告發(fā)放的程序和責(zé)任，設(shè)定并公示檢測(cè)結(jié)果報(bào)告時(shí)間，報(bào)告時(shí)間是指從接受送檢標(biāo)本起，到檢測(cè)結(jié)果發(fā)放的時(shí)間。應(yīng)制定個(gè)體化用藥基因檢測(cè)數(shù)據(jù)管理制度，數(shù)據(jù)中應(yīng)錄入患者信息和檢驗(yàn)數(shù)據(jù)；檢測(cè)數(shù)據(jù)的修改必須征得報(bào)告結(jié)果簽發(fā)人員同意后，由操作人員進(jìn)行修改；所有檢測(cè)報(bào)告和原始記錄應(yīng)當(dāng)歸檔保存，實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)至少要拷貝3份并保存在不同的地方，以便日后核對(duì)。

一般檢驗(yàn)報(bào)告單和檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)至少保存兩年；室內(nèi)質(zhì)控和參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的記錄和質(zhì)控信息至少保存兩年；儀器狀態(tài)和維修記錄要保留到儀器使用終身。檢測(cè)結(jié)果的查詢通?？筛鶕?jù)患者姓名、標(biāo)本編號(hào)、檢測(cè)項(xiàng)目和送檢日期進(jìn)行查詢。分析后質(zhì)量保證—檢測(cè)后樣本的保存和處理

樣本完成檢測(cè)后要進(jìn)行一定時(shí)間的保留，以備必要時(shí)復(fù)查。

標(biāo)本的保存也可為科研工作的開(kāi)展和回顧性調(diào)查提供條件。完成檢測(cè)后剩余的DNA樣本至少在-20℃保存2年。DNA在-70℃的環(huán)境下可保存至少7年。純度不高的DNA樣品建議保存在-20℃或更低的溫度中，以確保DNA的完整性。在不影響受檢者個(gè)人隱私及利益的前提條件下，DNA及臨床資料也可匿名用于科學(xué)研究，但需在知情同意書(shū)中明確。

廢棄的樣本應(yīng)作為生物危險(xiǎn)品處置。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory分析后質(zhì)量保證—檢測(cè)后咨詢服務(wù)個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備相關(guān)資質(zhì)、取得國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)培訓(xùn)基地培訓(xùn)合格證的個(gè)體化用藥咨詢?nèi)藛T，對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目提供咨詢服務(wù)，負(fù)責(zé)對(duì)檢測(cè)報(bào)告在臨床上出現(xiàn)的各種情況進(jìn)行解釋和檢后服務(wù)。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory質(zhì)量保證室內(nèi)質(zhì)量控制室間質(zhì)量評(píng)價(jià)上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory室內(nèi)質(zhì)控室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。通過(guò)對(duì)已知陰性和弱陽(yáng)性質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部連續(xù)自評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的可靠程度，判斷檢驗(yàn)報(bào)告是否可發(fā)出。在每次檢測(cè)時(shí)，結(jié)合試劑要求設(shè)立試劑對(duì)照、陰性質(zhì)控、陽(yáng)性質(zhì)控，并且將質(zhì)控樣本與待測(cè)樣本同步檢測(cè)。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory室內(nèi)質(zhì)控—華法林項(xiàng)目包含3個(gè)基因位點(diǎn)：CYP2C9*2、*3及VKORC1(-1639

)陰性質(zhì)控：野生型樣本或ddH2O陽(yáng)性樣本：留樣標(biāo)本或含特定突變質(zhì)粒或細(xì)胞株陽(yáng)性質(zhì)控樣本無(wú)需在每次檢測(cè)中都包括所有的突變位點(diǎn)，可根據(jù)需要設(shè)立針對(duì)1-2個(gè)位點(diǎn)的對(duì)照。但實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)有多個(gè)突變的質(zhì)控品，在不同批次檢測(cè)中輪流更換使用。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory室內(nèi)質(zhì)控—華法林項(xiàng)目如使用質(zhì)粒作為質(zhì)控品，則無(wú)法監(jiān)控核酸提取過(guò)程。純化后的核酸可以使用凝膠電泳對(duì)其完整性進(jìn)行評(píng)價(jià)提取濃度和純度可以使用紫外分光光度計(jì)，通過(guò)A260讀數(shù)確定濃度，A260/A280比率判定核酸純度。上海市臨床檢驗(yàn)中心Shanghai

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Laboratory目前開(kāi)展個(gè)體化用藥檢測(cè)項(xiàng)目室間質(zhì)評(píng)序號(hào)

開(kāi)展項(xiàng)目涉及藥物相關(guān)基因位點(diǎn)分型*2(681)rs4244285

A>G*3(636)rs4986893

A>G氯吡格雷（Clopidogrel）藥物相關(guān)基因檢測(cè)12CYP2C19*17

rs12248560

C>T*2(430)

rs1799853

C>T*3(1075)

rs1057910

A>CCYP2C9華法林藥（Warfarin）物相關(guān)基因檢測(cè)VKORC1CYP3A5(-1639G>A)rs9923231*3

(698G>