上海市臨檢中心 二代測序NGS培訓班 5-郝瑞-NGS測序原理及MiSeq介紹

NGS測序原理及MiSeq介紹郝瑞

PhD.臨床應用專家

Illumina

中國rhao@?

2013

Illumina,

Inc.

Allrightsreserved.Illumina,

IlluminaDx,

BaseSpace,

BeadArray,

BeadXpress,

cBot,

CSPro,

DASL,DesignStudio,

Eco,

GAIIx,

Genetic

Energy,

GenomeAnalyzer,

GenomeStudio,

GoldenGate,

HiScan,

HiSeq,

Infinium,

iSelect,

MiSeq,

Nextera,

NuPCR,

SeqMonitor,

Solexa,

TruSeq,

TruSight,

VeraCode,

thepumpkin

orange

color,

and

the

Genetic

Energy

streaming

bases

design

are

trademarks

or

registered

trademarks

of

Illumina,

Inc.

Allother

brands

andnames

contained

herein

are

theproperty

of

theirrespective

owners.Illumina

引領高通量測序行業(yè)的發(fā)展BGILifeBGI500MGI2000/200PGMIon

ProtonIon

S5/S5

XLDiscontinueRocheAB454DiscontinueSolidIlluminaSBSaSeq6000100

genomeIlluminaHiSeq

2000

MiSeq10K

genomeiSeqHiSeq2500HiSeq

X

NextSeq1K

genomeMiniSeqGAYears20052007201020122014201620172推動全球測序技術發(fā)展，數(shù)據(jù)結果接受廣泛>90%

of

the

world’s

sequencing

dataisgenerated

using

IlluminaSBStechnology.*>90%的測序數(shù)由illumina平臺產(chǎn)出*Datacalculations

on

file.

Illumina,Inc.,2015.3illumina測序實驗流程illumina二代測序儀生物學意義BiologicalMeaning簇生成Clustering測序Sequencing數(shù)據(jù)分析Analysis測序樣品制備4文庫制備

---決定測序成功與否的關鍵步驟①④②③④①②雙端標簽文庫dual

Index

Libraryshown①

與流動槽（Flow

Cell）結合的區(qū)域②

Read1和Read2測序引物結合的區(qū)域③

插入片段④

標簽序列區(qū)域（Index）文庫制備的目的是在需要測序的DNA片段兩端加上能夠與測序儀配合的接頭序列（Multiplexed,

SR,

PE）5建庫方式?

全基因組建庫：物理打斷建庫（Truseq

DNA

PCR

Free）酶切打斷建庫

(Nextera

DNA

Flex)?

靶向建庫：多重PCR

（Ampliseq

for

illumina各panel）捕獲建庫（Truseq

Exome、Trusight

tumor系列）?

RNA建庫（Truseq

RNA系列）小RNA建庫（Truseq

small

RNA）?

其他：甲基化、ChIP-Seq、Drop-Seq……6NotSure

WhichKitto

Use?Use

the

SamplePreand

Array

Selector/library-prep-array-kit-selector.html7Illumina

SequencingWorkflowCluster

GenerationcBotMiSeq8Illumina高通量測序技術原理3’

5’DNAATGTACGATCCGTGCAGTCACCCGATAGCSingle

molecule

array5’文庫制備簇生長測序123456789T

G

TACG

AT…堿基識別獲取圖片9WhatisaFlowCell?流動槽(Flow

Cell)

是什么?A

flow

cellis

a

thick

glass

slide

withchannels

orlanes一種含有通道的厚玻璃片Cluster

generationoccurs

ona

flow

cell簇生成在流動槽（flow

cell）上完成Each

laneis

randomly

coated

with

alawn

of

oligos

thatarecomplementary

to

library

adapters每條通道中都隨機植入了能與文庫接頭互補結合的大量短DNA片段10簇生成過程雙鏈DNA變性片段雜交與延伸單鏈DNA接頭序列新合成鏈原始模板鏈Discard

洗去丟棄流動槽表面隨機植入了大量引物鏈3’

extension3’

延伸橋式PCR擴增雙鏈DNA橋式結構變性橋式PCR擴增11Illumina

SequencingWorkflowHiSeqHiScanSQGA

IIxSequencingMiSeq12Illumina高通量測序原理——準確的邊合成邊測序技術Add

4Fl-NTP’s

+Polymerase加入4種不同熒光標記的dNTP和DNA合成酶Incorporated

FI-Terminator

&

fluorescentdye

cleaved

fromFI-NTP結合在DNA鏈上的熒光NTP中的熒光標記和阻斷基團被切除，可以繼續(xù)下一輪反應NTP

imaged對結合上的熒光dNTP進行照相X

36-

30113Clusters

DNA簇100

Microns14Illumina

SequencingWorkflowICS/RTACAS

AVAMSRData

AnalysisBaseSpace15照相讀取序列T

G

C

T

A

C

G

A

T

…125678934T

T

T

T

T

T

T

G

T

…Theidentity

ofeachbaseof

aclusterisreadofffromsequentialimages根據(jù)每個點每輪反應讀取的熒光信號序列，轉換成相應的DNA序列16Illumina數(shù)據(jù)分析流程分析類型軟件輸出格式初級分析測序儀完成Control

Software/Real

TimeAnalysis圖像文件、光強數(shù)據(jù)、堿基讀取數(shù)據(jù)二級分析測序儀

&云端&Dragen服務器序列比對,突變檢測bcl2fastqLocal

RunManager三級分析云端&本地注釋，過濾，報告Variant

Interpreter

Variant

Studio17云端二級分析____BaseSpace一鍵式分析，多種公開及私有分析軟件可供選擇即插即用，與測序儀無縫連接自由拓展，提供自動化的整體解決方案嚴密的權限以及安全控制輕松分享18DRAGEN

Bio-IT

Platform19Illumina高通量基因檢測平臺解決方案iSeq?20Illumina高通量基因檢測儀生產(chǎn)級測序儀S1,S2,S4HiSeqX桌面式測序儀NovaSeq

6000Mid

HighNextSeq550Micro,

NanoV2,V31300-1800Gb|5.3-6B2x150167

–

6000

Gb|

1.6

–

20B2x150Mid,

HighMiSeqMiniSeq120

Gb|400M2x150iSeq15

Gb|25M2x3007.5

Gb|25M2x1501.2

Gb|4M2x150Decreasing

price

per

GB21IlluminaMiSeqDx獲得

CNDA測序數(shù)據(jù)準確可靠，準確性>99.9%，行業(yè)準確性最高的測序平臺儀器兼容IVD及RUO兩個模塊，可獲得高質量的接近600bp的連續(xù)讀長測序儀高度一體化，操作簡單應用靈活，具有四款芯片支持不同應用需要第一臺FDA獲批的新一代測序儀中國第一臺獲CNDA的進口新一代測序儀嚴格按照GMP生產(chǎn)可接受全血和FFPE樣本22MiSeqDx擁有RUO和

IVD

兩個分析模塊IVD

模塊分析臨床科研分析APPAPP重測序實體瘤Panel遺傳病Panel擴增子分析新突變拼接TruSight

Tumor15PanelTargeted

-

RNASmall

RNA1ForResearch

Use

Only.

Notintended

fordiagnosticpurposes.23MiSeqDx提供完整的實驗和分析系統(tǒng)肺癌結直腸癌乳腺癌MiSeqDxInstrumentLocalRunManager分析軟件MiSeqDxv3核心測序試劑未來更多的IVD

kits液體活檢ctDNAEmpowering

Single-Site

IVDDevelopment

andMenuExpansion1.

The

MiSeqDx

v3

coreconsumables

arecapableof

running

2x300cyclesbut

inonly

intendedforDx

purposesusing

2x150bp

sequencing2.

TSCA

=TruSeq?

Custom

Amplicon24MiSeqDx

實驗儀器操作簡單測序數(shù)據(jù)分析?Local

RunManager

分析軟件?解讀結果?點擊

MiSeqDx開始界面?放入已添加文庫的測序試劑?按照MiSeqDx

提示完成設置后即可運行測序反應Sequencing≤28

hours*Analysis

&Interpretation1-3hours*10

min5

-

30min*Typical

times

withTSCA

Kit

Dxworkflow.

Maybeupto9hrsif

processing

>than48

samples

at

once*Library

prep

and

index

reagents,

panel

design

with

design

studio

and

purchase

oligos

fromGMP

oligo

vendor1.

Based

onPPAfor

SNVs,Insertions,

Deletions

and

NPA

(See

Datasheet

and

package

insert

for

more

detail)25MiSeqDx測序試劑盒模塊化MiSeqDx

測序試劑盒v3

(2x150bp*)?

數(shù)據(jù)輸出量>5Gb1?

Reads>25M1?

數(shù)據(jù)質量Q30

≥80%1?

準確度

≥99.96%1?

有效期：12個月*2x150

tested

for

IVDclaims,but

maximum

runlength

for

kit

is2x300

for

partners’

custom

modules1.

MiSeqDxInstrument

Data

Sheet–minimum

runrequirements

for

accuracy

and

reproducibilitystatistics

for

TSCA

Kit

Dxworkflow.2.

DoM=Dateof

Manufacture26MiSeqDx

RUO

和

IVD模塊的實驗特性Dx模塊研究模塊/RUO參數(shù)/IVDOutput≥15Gb300Mb–15

GbReads≥25M1-25MMax

ReadLength2x3001x36-2x300Runtime≤56hours≤56hoursQuality(2x300)>70%

≥Q30>75%

≥Q3027MiSeq

研究模塊/RUO

–

多種通量和讀長選擇，適合各種應用支持6種不同模式的讀長，四種不同reads數(shù)的芯片(Nano,Micro,V2,V3)通量范圍從150M-15G更廣泛的通量

和讀長范圍，可根據(jù)項目周期和最優(yōu)成本靈活安排各類應用。28Illumina

新一代測序技術覆蓋各個領域個人健康管理農(nóng)業(yè)基因組癌癥生物制藥遺傳病傳染病法醫(yī)檢測生殖健康基礎研究29腫瘤不同階段的基因組學解決方案腫瘤易感性健

康

管

理腫瘤篩查個體化診療預后、轉移監(jiān)控常規(guī)活檢NGS檢測液體活檢靶向用藥超早期檢測精準醫(yī)學微小殘留病新一代測序技術可以潛在影響癌癥控制治療的每個環(huán)節(jié)30Illumina高通量檢測技術推動出生缺陷防控一級預防（孕前）二級預防（孕期）三級篩查（新生兒）

遺傳病檢測（兒童/成人）胚胎植入前遺傳學診斷-Karyomapping產(chǎn)前篩查/產(chǎn)前診斷-NIPS新生兒篩查-

Panel-

cWES遺傳病檢測-CMA-Panel/cWES/WES攜帶者篩查-Panel/cWES/WES胚胎植入前遺傳學篩查-VeriSeq

PGS-CMA-Panel/cWES/WES控制源頭早發(fā)現(xiàn)，早干預早診斷，早治療31illumina

測序技術在微生物領域的應用WhatNGS時代過去WholeGenome16SrRNA

Gene

SequencingPCR&Sanger測序顯微鏡培養(yǎng)32Q&A33謝謝！官方微信：illuminatechsupport@34NGS平臺比較NGS平