免疫學(xué)檢測與抗體技術(shù)

免疫學(xué)檢測與免疫學(xué)技術(shù)一、抗原抗體的檢測技術(shù)二、免疫細(xì)胞的檢測三、細(xì)胞因子的檢測四、免疫相關(guān)基因分析五、免疫標(biāo)記技術(shù)六、免疫PCR(IM-PCR)技術(shù)

七、雜交瘤技術(shù)與T細(xì)胞克隆技術(shù)八、新型抗體的制備技術(shù)九、抗原的制備技術(shù)

一、概述免疫學(xué)檢測是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)手段及分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。

免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用極為廣泛,疾病的診斷、療效評(píng)價(jià)及理論研究等。

二、抗原抗體的檢測技術(shù)*根據(jù)反應(yīng)的基本原理與表現(xiàn)主要分為凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體參與的各種反應(yīng)*根據(jù)抗原抗體反應(yīng)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)還有標(biāo)記抗原(或抗體)檢測相應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)記技術(shù)。對(duì)機(jī)體參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,計(jì)數(shù)及功能測定(一)細(xì)胞計(jì)數(shù)1.熒光抗體染色2.免疫酶染色技術(shù):*ABC法*APAAP法3.免疫金銀染色法(IGSS)4．免疫細(xì)胞化學(xué)法5．四聚體法6．TCR鏈測定三、免疫細(xì)胞的檢測

(二)免疫細(xì)胞功能的測定1.T細(xì)胞功能測定：腫瘤，病毒感染，免疫缺陷，自身免疫病等(1)細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)：可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類。*絲裂原主要有PHA、ConA和PWM；*抗原刺激物有破傷風(fēng)類毒素、PPD和白色念珠菌等；*同種MHC及抗CD3單抗等*腫瘤細(xì)胞-自體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)(2)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)：CTL(3)分泌功能檢測

(4)T細(xì)胞功能的體內(nèi)檢測法*接觸性超敏反應(yīng)*移植物抗宿主反應(yīng)(GVHR)*遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)

2.B細(xì)胞功能判定(1)B細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)：*PWM、SAC，LPS（對(duì)小鼠B細(xì)胞）；*抗IgM抗體及EB病毒等(2)溶血空斑形成試驗(yàn)(3)反向溶血空斑試驗(yàn)(4)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT):ELISPOT是一種可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可測定抗體分泌量的體外實(shí)驗(yàn)方法。*此法的主要優(yōu)點(diǎn)是:①

穩(wěn)定、特異，且抗原用量少；②可同時(shí)檢測不同抗原誘導(dǎo)的抗體分泌，并可定量測定；③可檢測組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞。

3.NK細(xì)胞活性測定體外檢測NK細(xì)胞活性的方法有形態(tài)學(xué)檢查法，放射性核素釋放法，酶釋放法，化學(xué)發(fā)光法及流式細(xì)胞術(shù)等。測定人NK細(xì)胞活性常以K562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，測定小鼠NK細(xì)胞活性常用YAC－1細(xì)胞為靶細(xì)胞。(1)形態(tài)學(xué)檢查法(2)放射性核素釋放法：用放射性核素(51Cr、125I－UdR)標(biāo)記靶細(xì)胞。(3)酶釋放法：測定靶細(xì)胞膜受損后從胞漿內(nèi)釋放至介質(zhì)中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。*NAG酶熒光比色法:NAG酶是細(xì)胞漿中存在的一種溶酶體酶,與其底物作用后,生成熒光產(chǎn)物,應(yīng)用熒光分光光度計(jì)測定，敏感性明顯高于LDH比色法。而且方法簡單，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。(4)化學(xué)發(fā)光法(5)流式細(xì)胞術(shù)：應(yīng)用FCM檢測NK細(xì)胞活性是根據(jù)PI染料排斥法。PI滲入死亡細(xì)胞內(nèi)與DNA和RNA結(jié)合，在488nm波長激發(fā)下產(chǎn)生綠色熒光。此法既可以測定單個(gè)細(xì)胞毒活性，也可以用于總細(xì)胞毒活性試驗(yàn)。*還可利用熒光染料法,細(xì)胞光掃描法，雙標(biāo)記細(xì)胞毒法測定細(xì)胞毒性細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

4．吞噬細(xì)胞功能測定(1)中性粒細(xì)胞趨化功能測定：一般采用濾膜滲透法(Boyden小室法)或瓊脂糖平板法。(2)中性粒細(xì)胞吞噬、殺菌功能測定1)顯微鏡檢法2)NBT試驗(yàn)：此項(xiàng)試驗(yàn)是測定中性粒細(xì)胞吞噬、殺菌功能的一種簡易方法。3)化學(xué)發(fā)光測定法：中性粒細(xì)胞在吞噬過程中出現(xiàn)呼吸爆發(fā),產(chǎn)生活性氧代謝產(chǎn)物。此類活性氧化基團(tuán)與細(xì)胞內(nèi)殺菌作用密切相關(guān)，同時(shí)又能激發(fā)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。(4)巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒測定:通常取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，以-干擾素為激活劑使其活化，作為效應(yīng)細(xì)胞。用125I-UdR標(biāo)記的DBA/2小鼠肥大細(xì)胞瘤P815作為靶細(xì)胞。(3)巨噬細(xì)胞吞噬功能測定：中藥斑蝥酒精浸液敷貼法誘發(fā)無菌性皮炎，從皮膚水泡滲出液中收集巨噬細(xì)胞，在體外進(jìn)行雞紅細(xì)胞吞噬試驗(yàn)，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)，作為判斷巨噬細(xì)胞吞噬功能的指標(biāo)。四、細(xì)胞因子的檢測（一）免疫學(xué)檢測法免疫學(xué)檢測的基本原理是將細(xì)胞因子作為抗原進(jìn)行定量檢測。如免疫斑點(diǎn)法、ELISA法、RIA法和免疫印跡法等均已用于細(xì)胞因子的檢測。某些細(xì)胞因子含量甚微的樣品(如腦脊液)可用免疫聚合酶鏈反應(yīng)(immuno-PCR)進(jìn)行檢測。（二）生物學(xué)測定法根據(jù)細(xì)胞因子對(duì)特定的生物學(xué)活性,應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng),同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比測定,從而得知樣品中細(xì)胞因子的活性水平,一般以活性單位(U/ml)表示。靶細(xì)胞可直接從組織中分離,如骨髓細(xì)胞的集落形成試驗(yàn)和胸腺細(xì)胞(脾細(xì)胞)的增殖試驗(yàn),或用體外培養(yǎng)的依賴細(xì)胞因子才能生長的細(xì)胞因子依賴株及對(duì)細(xì)胞因子殺傷敏感的細(xì)胞作為靶細(xì)胞。1.促進(jìn)細(xì)胞增殖和增殖抑制法*多種IL、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子*各種CSF作用于造血系統(tǒng)的不同細(xì)胞,可促進(jìn)其增殖及在半固體瓊脂凝膠系統(tǒng)中克隆培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的集落形成,故可采用集落形成試驗(yàn)研究CSF的水平*常用的檢測細(xì)胞增殖的方法有3H-TdR摻入法、比色法、染色法和直接計(jì)數(shù)法等。其中測定細(xì)胞代謝酶反應(yīng)細(xì)胞增殖數(shù)的比色法包括MTT、XTT、MTS和NAG等方法。

2.細(xì)胞毒活性測定法許多細(xì)胞因子(TNF)針對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及病毒感染的細(xì)胞具有溶細(xì)胞或抑制細(xì)胞生長的活性。3.抗病毒活性測定法常用于檢測抗病毒活性的細(xì)胞株有WISH,Hep2/c,L929,A549和MDBK等。其中WISH和Hep2/c細(xì)胞株用以檢測人干擾素,L929細(xì)胞株用于檢測小鼠干擾素,Ratec細(xì)胞株用于檢測大鼠干擾素,而MDBK細(xì)胞株則可用于檢測多種族的IFN-α和IFN-γ。常用于攻擊細(xì)胞的病毒有濾泡性口炎病毒(VSV)、鼠腦心肌炎病毒(EMCV)以及Sindbisvirus等病毒。檢測抗病毒活性的方法:測定細(xì)胞因子抑制病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)、抑制病毒蝕斑形成或抑制病毒的產(chǎn)量等。

4.趨化活性測定法多種細(xì)胞因子具有趨化活性，分別能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞定向遷移趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)的方式包括趨化性和化學(xué)增活現(xiàn)象。趨化性(chemotaxis)是指誘導(dǎo)細(xì)胞向趨化因子化學(xué)濃度高的方向作定向移動(dòng),可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗(yàn)測定細(xì)胞因子的趨化活性；化學(xué)增活現(xiàn)象(chemokinesis)是指增強(qiáng)細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng),可采用瓊脂糖小滴化學(xué)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)檢測。

(三)姿分子途生物卵學(xué)測屢定法RN亞A印跡渠法、遙核酸襲酶保涂護(hù)分恢析、養(yǎng)原位漆雜交位、PC滑R和Re荷al躬T而im成e群PC革R等。音亦可媽通過大檢測嘩細(xì)胞停內(nèi)細(xì)縫胞因觸子的蛛基因爺組成王或mR肉NA量，渴推算傻出細(xì)侮胞因卡子的西合成完量。(四非)單個(gè)蜓細(xì)胞該產(chǎn)生診細(xì)胞振因子衰測定根法常用量的方口法有籌反向剩溶血府空斑惑試驗(yàn)辜(RH倍PA土)和反兆向EL性IS沸A斑點(diǎn)飾試驗(yàn)(1忽)反態(tài)向溶做血空豆斑試醒驗(yàn)(RH郊PA欠):事RH殿PA是一供種體痛外檢面測抗戶體分渡泌細(xì)物胞的稱試驗(yàn)甘,亦菜可用閣于檢坐測細(xì)箏胞因鵝子。(2請(qǐng))酶陶聯(lián)免更疫斑努點(diǎn)試紹驗(yàn)(EL陵IS猶PO嚼T)嶄:所用惜的包唐被抗恩體與敬酶標(biāo)我抗體悼應(yīng)分埋別針液對(duì)細(xì)碗胞因揉子的遣不同芳抗原數(shù)決定夢(mèng)簇(五紛)細(xì)胞扛內(nèi)細(xì)峽胞因捷子的狀檢測采用FC吉M免疫滑熒光法技術(shù)倡可從耍單細(xì)發(fā)胞水說平檢寒測不識(shí)同細(xì)獵胞亞楊群中偶的細(xì)掙胞因室子,膜用兩嘩種標(biāo)品記的畏熒光擺抗體洽可在擺一種藍(lán)細(xì)胞雪內(nèi)同欠時(shí)測惜定兩財(cái)種不完同的葵細(xì)胞販因子濟(jì)。細(xì)胞禾因子竹受體伯檢測善的基咸本技漫術(shù)細(xì)胞望因子資的廣概泛生敬物學(xué)幅活性仔是通躬過與夾各自抗相應(yīng)焦的受釣體結(jié)植合而暑發(fā)揮恥的。釘因此爬細(xì)胞游因子賭受體嶄的檢場測與離細(xì)胞滑因子按檢測腿一樣栗，已扒成為她基礎(chǔ)狗理論懼和臨腹床免需疫學(xué)蒜研究愿的一允個(gè)重軟要內(nèi)急容。五、榮粘附遠(yuǎn)分子冶的檢甚測某些箏粘附命分子嶺除表圍達(dá)于者細(xì)胞惠膜表牛面外占，還彩以可筍溶性莊形式立存在井于體竟液中箱。粘壁附分皆子的墊檢測尿方法獲目前泛大多椒采用隸免疫駱學(xué)技管術(shù)檢嚴(yán)查其殿在細(xì)驢胞膜傅上的謙分布鉗和測巡壽定某故些樣閃品中述的含傻量。六、控免疫戴相關(guān)由基因燃分析*包儲(chǔ)括各我種類紫型的亡雜交走技術(shù)治，如您轉(zhuǎn)印怕雜交熟、斑盯點(diǎn)雜貼交、因原位綠雜交訪等以粘及PC豬R技術(shù)畫等。雜交墓技術(shù)渣主要欲工具司是核仙酸探歪針，漏它是東指一慎段用租放射望性核攻素或拾其他丘標(biāo)記宗物(幸生物凡素、毀熒光膀素、雙地高姥辛等哲)標(biāo)棉記，謀并與柄目的聰基因育互補(bǔ)籍的DN蜜A片段傻或單濾鏈DN毛A、遷RN激A。分為cD以NA探針庭、寡黃核苷壯酸探墨針、惰基因爬組DN寺A探針貫及RN煎A探針朽等。*核偷酸探次針技扭術(shù)的努操作未主要糕包括動(dòng)：①蘇質(zhì)粒DN素A的提惰取；語②靶DN破A片段改的分辣離；犁③靶DN竹A片段狐的標(biāo)浸記；祝④待兆測樣魯品mR薪NA的提戚??；竿⑤標(biāo)臺(tái)記cD離NA探針望與待共測樣陪品進(jìn)編行雜鋼交；密⑥放芽射自多顯影墾或顯惡色分恨析。(一壘)細(xì)朗胞因售子基閱因組DN雅A或mR立NA的檢噸測1.No饞rt之he錦rn雜交債分析2.侮斑靜點(diǎn)雜狼交法3.結(jié)原北位雜憂交法4.PC醒R擴(kuò)增既產(chǎn)物果雜交雀分析斷是將薄細(xì)胞吩因子閑的mR恥NA經(jīng)過易逆轉(zhuǎn)艦錄為cD融NA，用特蠻異性兔細(xì)胞略因子浩引物殊進(jìn)行PC食R擴(kuò)增特，通況過So翻ut灑he套rn炮b束lo升t后，齡再用夜標(biāo)記咳探針?biāo)z測逮特異辦細(xì)胞近因子DN合A的水辮平。5．So藥ut鉗he抖rn印跡批雜交6.共斑斯點(diǎn)及與狹縫兼印跡灶雜交頑:文將DN懶A變性辯后直血接點(diǎn)梅樣于創(chuàng)硝酸單纖維易膜上麥再進(jìn)吧行雜咱交7.細(xì)胞限因子mR咬NA表達(dá)股的測推定還洋可采匹用RT跪-P仙CR、原位遙雜交則與原繩位PC搶R,億RN顧A半壽頸期的園檢測,進(jìn)行貼中的蒼轉(zhuǎn)錄敗分析綠等。(二圍)BC哨R及TC姻R克隆種性基滑因重灣排分金析1．So值ut勒he兆rn印跡士雜交垂法：絞僅適堪用于激科研碌，而屢不適付用于比臨床犯診斷披。2.PC炎R(shí)擴(kuò)增堂技術(shù)宋:正塌常多旬克隆躬淋巴步細(xì)胞順群DN滋A的擴(kuò)占增產(chǎn)汗物含版有不雀同長茄度的肥片段鳥，電志泳檢糠查呈管現(xiàn)彌究漫涂仆片狀肺結(jié)構(gòu)疑或多窯條帶忠。而租單克外隆性托基因蝴重排牌經(jīng)PC淹R擴(kuò)增左后，梁產(chǎn)生芒明顯慮相同姻長度娘的片章段，框電泳縱呈現(xiàn)冤單一芝緊密我折帶蓄狀結(jié)浙構(gòu)*應(yīng)避用PC快R擴(kuò)增盈技術(shù)雀進(jìn)行叨基因夫診斷交具有寧特異咬、敏則感(奪1/科104~1昂/1膊05克隆察性細(xì)抄胞)搖、快糧速(捉24h可完死成)濾等優(yōu)固點(diǎn)。*用奏于惡錄性淋麻巴瘤朝和白壇血病育等的帝臨床納診斷淚以及決白血鏈病治靠療后山微小驚殘留株病灶灣的檢損測。(三愧)HL摸A基因守分型獵技術(shù)1．鋼序列帶特異慎性寡查核苷查酸探怨針PC落R(再PC槐R-轟SS姐OP蒸)或PC野R-緞AS糾O:攪PC呼R-船SS型OP是目觀前應(yīng)宜用最飼多的勤一種檢簡單黨、快作速而外又精科確的HL喚A-遍Ⅱ類抗篩原分吃型方梢法，生能鑒環(huán)定所翼有已肅知序冰列的HL嘆A-暗DR貪、D浙Q、雁DP等位洗基因許，精民確地?zé)o分析DN失A的多狂態(tài)性驢。2．楊限制抓性片屢段長駱度多桃態(tài)性勇(PC段R-裂RF繪LP院)技術(shù)射：此薦項(xiàng)技制術(shù)特義別適盞用于雹個(gè)別截標(biāo)本孟和小造樣本本的檢臉測。3．雷單鏈榜構(gòu)象及多態(tài)籌性PC焰R（盆PC謝R-視SS布CP蟻）：藉此御可鑒薦別編石碼HL走A-端Ⅱ類抗壺原基習(xí)因的順多態(tài)步性。應(yīng)用PC營R-誕SS斑CP可以虹直接君比較喉供、橡受體焰之間HL各A-芒Ⅱ類基旦因是星否完危全一華致，底且可食精確歷到12個(gè)爬堿基哀之差島，具鮮有相鐵對(duì)簡宵捷而淋精確硬的特抖點(diǎn)。思在異鄙基因忠骨髓具移植剛的配粉型中魔已初雷步應(yīng)買用于主臨床喜。4．膀序列痕特異拿性引昏物PC車R技術(shù)堪(PC摩R-拖SS混P)磚：該法朝操作供簡單柳、快吵速、帝實(shí)驗(yàn)賤結(jié)果摸容易蒙判斷容，雜匙合子點(diǎn)也很只易檢呢出。蟲不足嗽之處后在于稼，為螞檢出棟所有蛇的等怕位基內(nèi)因必字須用車多個(gè)肥引物飯進(jìn)行攻擴(kuò)增奏。5．受指紋貼圖譜殿(PC猛R-捐fi寇ng億er的pr觸in公ti恢ng杜)技術(shù)醬|：腿進(jìn)行HL寒A-基因的分型使鑒定執(zhí)時(shí)，弦將供想、受仆體的DN祝A擴(kuò)增遙產(chǎn)物宇混合鉗，電類泳后節(jié)得出然一指峰紋圖約，再筑與二胖者各喘自的PC書R指紋測圖譜通進(jìn)行紹比較套，從薪中選愈擇出略指紋裁圖一踩致的德供、太受體墨進(jìn)行穗移植攜。*PC犧R指紋稍圖譜京在選勾擇非自親緣突關(guān)系鈔的供技、受孩體進(jìn)館行骨詢髓和輸器官耀移植行配型肢時(shí)，蛾可以察節(jié)省嘗大量秘時(shí)間濃。6.SN挑P(單個(gè)竟核苷疾酸多侮態(tài)性逆)分纏析(四辯)補(bǔ)感體基怪因分士析(五明)抗辨體基侍因分幕析(六庭)細(xì)宴胞膜便分子座基因卡分析七、維免疫揀標(biāo)記括技術(shù)(一冶)免堂疫熒年光技育術(shù)(二北)放糕射免治疫分蚊析法(三蛇)酶叼免疫造技術(shù)(四倦)發(fā)停光免魚疫測款定八、欣免疫PC愈R(康IM棚-P儀CR胃)技術(shù)免疫PC稼R是將頂抗原換抗體怨的特腐異性腸反應(yīng)桂與PC灘R技術(shù)道結(jié)合刪起來血,用嗓以檢自測微就量蛋喇白質(zhì)葛的方佳法。戲免疫PC踩R是用DN株A分子艙標(biāo)記中特異相性抗?jié)欝w，窮利用PC巡壽R可大賓量擴(kuò)辰增DN店A片段慎的特糊點(diǎn)，掉從而卷將檢嗽測靈宏敏度炊大大擊提高勁，最鈔低檢志測值以可達(dá)請(qǐng)10-2跨1mo哨l/供L。1.直接傷免疫PC夾R是將蕉抗原搜包被翻在固金相載叢體上越,用釀特異焦性單綢抗結(jié)刷合此恩抗原省,再熔用生突物素?；箍骟w通亂過親勤合素腔連接偶生物快素化DN恥A,然后掃將后率者進(jìn)幟行PC攏R2.間接飛免疫PC捕R系將泥所測濁物的膜單抗泄包被卡在固躍相載曾體上,然后傷使所鞠測抗泡原與預(yù)之結(jié)糞合,再將邪特異筋性抗昏體生錢物素變化,并通戰(zhàn)過親巧合素掩連結(jié)捏生物踢素化DN奮A分子盆而將尿后者鋸進(jìn)行PC凍R九、便新型濾抗體重的制侮備技齡術(shù)(一葛)對(duì)年鼠源燭性抗適體的咱改造1．人-鼠嵌笨合抗頃體(ch簽im促er偶ican括ti廟bo鏟dy社)：鼠源云性單鳴抗的V區(qū)，字人免曉疫球立蛋白扮的C區(qū)。2．岔人源賄化抗乘體卵將籍鼠抗圾體的?；パa(bǔ)鋸決定休區(qū)(CD輕R)與人Ig嘉FR和C連接序構(gòu)建漢“人茫源化旋抗體顛”。(1儀)趁模板稈替換升:使領(lǐng)用與借鼠對(duì)環(huán)應(yīng)部續(xù)分有您較大秋同源哭性的催人FR替換輪鼠FR區(qū),坦例憤如可俗通過CD匪R移植畫構(gòu)建經(jīng)“改僅型抗肯體”(2詞)表儉面重?fù)?dān)塑:秘對(duì)鼠CD效R及FR表面銷殘基濤進(jìn)行劈燕重塑霸或鑲汗飾,答使之掃類似尿于人值抗體CD躁R的輪緞廓或北人FR的型廈式。(3足)補(bǔ)米償變嘴換:伴在人FR選擇沾與CD在R有互歲補(bǔ)作墨用、兼與抗脈體的劣親和蛋力有拍密切局關(guān)系嘩或?qū)R空間讀結(jié)構(gòu)影折疊漸起關(guān)晚鍵作喂用的置殘基陣進(jìn)行孫改變妻,以賺補(bǔ)償炒完全京的CD怕R移植(4獎(jiǎng))定忘位保譯留:眾通過族計(jì)算唐機(jī)模紛建從奸現(xiàn)有銹的人衰源抗存體保誤守序晌列中設(shè)搜尋蛋與鼠FR區(qū)最抹類似交的序陸列,掩根據(jù)俊最簡邀位置苗模板庭確定眾鼠可淋變區(qū)門的關(guān)孫鍵位慣置殘液基,筐并保李留所窮有這饞些位雨置而狂將其彈余部扇分進(jìn)變行人屋源化渡。3.孝小分暑子抗見體(1灰)Sc泰Fv：由VH和VL中間敵連以歷1415記個(gè)小封肽,內(nèi)常用具的連稠接肽絞為(Gl雹y4鈴Se散r)3(2鄰)V熱H與VL適當(dāng)稱部位爺各引拒入一芽個(gè)半季胱氨誤酸形系成以狼二硫牢鍵固浮定的Fv段而拉構(gòu)成殲的Ds歉Fv(3岔)將Sc鬼Fv中兩描個(gè)可奸變區(qū)蜜之間收的接明頭縮辯短,弱使兩帥分子賊間VH和VL配對(duì)黨形成撇雙價(jià)直小分村子抗浴體(Di張ab蘋od戰(zhàn)y)(4適)將兩中種不粉同特會(huì)異性增的V基因扭交叉蓄配對(duì)凱,則洋可得優(yōu)到雙勾特異真性Di杯ab困od搭y(5招)在Sc弦Fv的一秩端加援上一棟個(gè)雙挖聚化床結(jié)構(gòu)揀亦可同構(gòu)建述不同錘類型兼的雙尤價(jià)或貴雙特平異性技小分侍子抗頂體,說如Mi妄ni礦bo惹dy等(二腦)抗身體庫勇技術(shù)(三果)產(chǎn)河生嵌響合抗素體的純小鼠膀和產(chǎn)序生人饑抗體渾的小惹鼠利用挪基因搖打靶星和取凈代的故方法謙以及雕轉(zhuǎn)基后因技揚(yáng)術(shù)產(chǎn)艙生嵌晉合抗虎體。通過鋸轉(zhuǎn)基代因、愿基因甩缺失謹(jǐn)及雜顯交和省選擇吩等一寬系列橫過程紡，獲邪得雙渡轉(zhuǎn)染謀基因(人H、鏈基均因)的純順合小回鼠。隔其脾揪、淋墳巴結(jié)控、骨勻髓中臥的B細(xì)胞港可表殲達(dá)人器的鏈。(四閥)細(xì)胖胞內(nèi)雷抗體*細(xì)依胞內(nèi)鉆抗體舞是指利在細(xì)殺胞內(nèi)僚合成染并作愉用于造細(xì)胞朽內(nèi)組位分的蕉抗體咐,亦綱稱為掘內(nèi)抗趁體(in枝tr造ab團(tuán)od螺y)。*若在殿抗體反基因才的N端或C端加帽入引細(xì)導(dǎo)序吳列就伙能使掀抗體愿表達(dá)蘆定位次亞細(xì)依胞部膜位,濫如胞奸漿、見線粒皆體、池內(nèi)質(zhì)捧網(wǎng)或營細(xì)胞攜核部忌位。*若敏在細(xì)恭胞內(nèi)隱表達(dá)邀特異謎識(shí)別音與腫挑瘤發(fā)呼生有鐮關(guān)的罷癌基泡因編凝碼的漿抗體長,即姥可抑惱制癌此基因促編碼偏產(chǎn)物亞的表徐達(dá),藥可用爺于腫狡瘤的士治療雁。*細(xì)宵胞內(nèi)牧免疫末用于墻病毒敲性疾楚病的靠治療*抗EG津FR胞外是區(qū)的Sc挺Fv-R桂I序R,并在Sc洪Fv-R費(fèi)I毒R的C-末端血連接KD分EL肽,提供ER滯留(五歐)基徑因工顆程抗褲體衍偶生技濟(jì)術(shù)1．器雙特肝異性便抗體莫(Bs宵Ab)或稱父雙功傍能抗蓄體(Bf姑A)。2.抗體石的抗驚原化羞技術(shù)流：借階助人墓源化側(cè)抗體肺的構(gòu)澤建方利法，名以抗宏體V區(qū)作果為分怨子載肺體來泄表達(dá)惑生物指學(xué)相略關(guān)的遭多肽閥或外甲源性脂抗原尾表位洪，即唉抗原莖化抗錦體(an店ti雅ge炸ni猶ze四dan謹(jǐn)ti類bo陽dy喜,Ab律Ag)。3．抗體坑重組雞免疫壯毒素4.催化臺(tái)抗體(ca駕ta朝ly判ti件c避an疼ti貞bo退dy咳)或抗鼻體酶(ab宇zy腔me)：將催盈化活姨性引楊入抗昆體的做結(jié)合夾部位,產(chǎn)生暗一種醬具有芹抗體霜和酶墓雙功把能的犬蛋白貴質(zhì),稱為毛抗體謠酶或澇程序唯性酶(pr鞏og像ra說mm咬ab毫le股e回nz概ym酬e)。十、角雜交嬌瘤技奶術(shù)與T細(xì)胞你克隆療技術(shù)一、雜交鄰瘤技礙術(shù)1.B細(xì)胞枕雜交基瘤技臨術(shù)與浴單抗改的制盛備2.T細(xì)胞直雜交勿瘤技腐術(shù)與愧其功毯能的門研究二、T細(xì)胞葡克隆慮技術(shù)*按渴其特緒異性頁分為婆抗原各特異唯性和秧非特罷異性T細(xì)胞密克隆施。*按擔(dān)其功憑能則今可分班為輔叛助性刪和細(xì)暮胞毒奮性T細(xì)胞濁克隆杯。(一寄)抗瘋原特致異性T細(xì)胞岸克隆(二閥)抗愛原非案特異縫性T細(xì)胞哥克隆荒的制預(yù)備(三膏)同軋種反旺應(yīng)性TH和CT湊L克隆畜的制碼備(四)腫瘤撥抗原匆特異女性CT編L克隆細(xì)胞蒸凋亡泥的檢諒測一、裙概述細(xì)胞傲凋亡純(ap赴op孩to解si宮s,Ap國o)是生黎物體朽內(nèi)無返用的睡、老競化的橋一些簡損傷掌細(xì)胞騎自動(dòng)皇死亡災(zāi)的一逮種形披式，海是指福在一爆定的初生理幣和病肅理情攤況下累,機(jī)默體為飄維護(hù)內(nèi)內(nèi)環(huán)辯境的椅穩(wěn)定竄,通繡過基懷因調(diào)茂控而寶使細(xì)國胞自船動(dòng)消鴿亡的貨過程男。二、男細(xì)胞冊(cè)凋亡紹與細(xì)典胞壞組死的蓮區(qū)別*細(xì)攏胞壞嗽死是提細(xì)胞穴膜,剖線粒釋體膜言結(jié)構(gòu)就、流仗動(dòng)性業(yè)、滲頃透性誓及受凱體等便均受奴損,石進(jìn)軋而細(xì)流胞溶昂解、候壞死避；而傻細(xì)胞樣凋亡油時(shí)上林述結(jié)侵構(gòu)和芹功能屈均保尚持不嗚變；*細(xì)漂胞壞泡死時(shí)御,AT木P和蛋諸白質(zhì)穴合成追抑制渡及終忌止;哈細(xì)胞烤凋亡伐時(shí),AT槐P、mR晃NA和蛋草白質(zhì)示合成半依舊禮,細(xì)或胞第墳二信拴號(hào)系婦統(tǒng)仍嗓活動(dòng)耳;*細(xì)枕胞壞忌死時(shí)移,細(xì)惠胞DN胳A隨機(jī)捎降解酸,電楊泳不泰呈梯玩狀圖珍譜;擺細(xì)胞券凋亡丸時(shí),DN獎(jiǎng)A多降同解成呼18疫0～完20棒0bp或其欺倍數(shù)兩的梯姻狀片金段,津電泳劇呈梯歡狀圖第譜;*細(xì)潔胞壞繭死時(shí)哄,細(xì)叉胞內(nèi)晌容物筐外溢坦,引跨起局計(jì)部炎碧癥反璃應(yīng)或黑組織邁損傷慣;細(xì)尼胞凋赤亡時(shí)虎,細(xì)首胞內(nèi)濱容物深不外欲溢,淘所掃以不層引起賽炎癥旨反應(yīng)林或局密部損膝傷;*細(xì)胞敘壞死團(tuán)時(shí),往往懲是成依團(tuán)細(xì)軋胞死扭亡;細(xì)胞錄凋亡惕時(shí),在組汗織中伶呈分亡散狀述態(tài)分爽布。三、崖研究妹細(xì)胞貸凋亡棕的意凍義1.偷細(xì)測胞凋助亡在晌腫瘤糊形成載和治崇療中嫂具有獵重要?jiǎng)┳饔幂^。*凋傍亡基襪因與同抗凋住亡基偵因突臨變→→溉易形虎成腫巡壽瘤；*免可疫效寨應(yīng)細(xì)糕胞表港達(dá)Fa其sL,腫瘤妥細(xì)胞箱表達(dá)Fa籠s→→誘導(dǎo)分腫瘤協(xié)細(xì)胞穴凋亡→→苦抗腫僻瘤*腫盛瘤細(xì)手胞高痛表達(dá)Fa洗sL→→誘導(dǎo)巴免疫疾細(xì)胞葵凋亡→→卡抑制富免疫熱功能派→→悶逃避評(píng)免疫辟監(jiān)視*腫瘤撓細(xì)胞堡低表宜達(dá)或具不表紀(jì)達(dá)Fa咬s→→逃避離免疫蝴監(jiān)視2.恐細(xì)胞貿(mào)凋亡卻與免防疫學(xué)圖的關(guān)賠系*細(xì)緣瑞胞凋崗?fù)雠cT細(xì)胞杯在胸以腺的泳發(fā)育*細(xì)惡胞凋或亡與趟成熟T細(xì)胞排：AI鋪CD*細(xì)胞廈凋亡滅與與B細(xì)胞*細(xì)述胞凋逆亡與姥胞毒醉效應(yīng)3.消細(xì)胞摸凋亡日參與汽自身媽免疫蛋病的希發(fā)生4.館細(xì)胞販凋亡呀與病捆毒感陳染*抗歲病毒簽免疫混防御*細(xì)張胞凋弊亡與AI更DS*細(xì)胞嘗凋亡皆與病為毒性魂肝炎細(xì)胞轉(zhuǎn)凋亡襪的檢荒測方寨法一、秒形態(tài)馳學(xué)方拾法1．障普通賀光學(xué)疲顯微喊鏡檢蹲測法2．道熒光鑄顯微運(yùn)鏡檢六測法材料娘：①悅石蠟將切片弦;②物冰凍友切片沸;③飽細(xì)胞寨學(xué)涂奪片。方法昏一：蜜①PI染液猜：碘跳化丙憐啶(pr啄op攜id欲iu凈mio題di充de瓣,P纏I)門；②漸DA創(chuàng)PI染液脆；③AO染液恒：*熒榆光顯境微鏡施下觀伍察。PI染色光選用叔>6冤00nm的激違發(fā)光韻,DA陳PI選用像46奇0～爹50辯0nm的激陷發(fā)光畏,AO染色匹選用劣52馳0nm的激摩發(fā)光課。*HE染色般核DN篇A呈藍(lán)秒色,床而PI染色釀呈紅腥色,DA味PI染色然呈藍(lán)疼白色竟,AO染色疲呈黃遺綠色斤。凋狡亡細(xì)劈燕胞呈億現(xiàn)核憑濃縮狼,染厚色加釣深,添或核拾染色帥質(zhì)呈京新月紗形聚尿集于寫核膜圾一邊蹤蝶;晚蹄期凋棉亡細(xì)幫胞表哭現(xiàn)為局核碎紡裂成鬼大小巡壽不等真的圓輛形小挨體被聞細(xì)胞哈膜包仔繞,逐即凋尊亡小貸體。方法哥二：Ho逐ec愛hs層t鳥33導(dǎo)34潑2/尸PI雙標(biāo)醋記法*在答熒光喘顯微睛鏡下屋觀察腥，凋腐亡細(xì)怨胞的呼藍(lán)色亮熒光普比活芒細(xì)胞勵(lì)和非須凋亡浸細(xì)胞頭都要短強(qiáng)，兔其光嘉散射洞能力蘇則降鏡低，角將二蛛者結(jié)幫合起塊來，條可以首很好止地鑒蔥定凋創(chuàng)亡細(xì)油胞。景壞死決細(xì)胞國則由腦于PI復(fù)染柳，呈只紅色霧熒光猶。是濟(jì)目前現(xiàn)細(xì)胞圣凋亡幼最滿獄意的失形態(tài)扎學(xué)分妙析方嫁法。*樣拉品來缺源雞培稍養(yǎng)細(xì)記胞或扯離體漫細(xì)胞病制成漆的單斗個(gè)細(xì)繩胞懸男液。方法罪三：昏碘化冤丙啶（PI高）和Ho怕ec超hs爐t離33溝34椒2(取HO綱)雙染過法PI和HO均可暈使用峰紫外畏光激術(shù)發(fā)，攔其熒敲光分輩別為市紅光燦和藍(lán)染光。凱對(duì)照線活細(xì)洞胞的HO藍(lán)色我熒光握最強(qiáng)四，而紹早期巷凋亡箏細(xì)胞烘由于船其DN物A降解堡和丟罩失，腹其HO藍(lán)色濫熒光外較弱斗，也拖有很書弱的PI紅色節(jié)熒光問。晚矛期凋都亡細(xì)咐胞PI紅色朋熒光率增強(qiáng)傲，壞春死細(xì)它胞PI紅色做熒光部最強(qiáng)鉗，而HO藍(lán)色購熒光描較弱覽。3．袋凋亡筒小體盡的電訪鏡觀添察有小楚體系披由細(xì)倚胞膜叛卷曲石、脫呈落形隙成的部小泡弦,其廟內(nèi)包罩含有絲式完整下的細(xì)味胞器遲及核及片段仇。二、啄生物摟化學(xué)盟方法電泳精法DN益A梯帶哈(DN桐A還la廣dd超er方)。三、說免