氧化型低密度脂蛋白對骨髓內(nèi)皮前體細胞增殖、凋亡及NO分泌功能的影響

氧化型低密度脂蛋白對骨髓內(nèi)皮前體細胞增殖、凋亡及NO分泌功能的影響【摘要】目的：探討氧化低密度脂蛋白對骨髓內(nèi)皮前體細胞增殖、凋亡及一氧化氮(NO)分泌功能的影響.方法：密度梯度離心法獲得豬的骨髓EPCs，不同濃度oxLDL(B組5mg/L，C組10mg/L，D組20mg/L）作用于EPCs，MTT法檢測oxLDL對EPCs增殖能力的影響，流式細胞儀檢測oxLDL對細胞的凋亡率的影響，硝酸還原酶法檢測細胞培養(yǎng)液中NO含量的變化，觀察oxLDL對細胞及其功能的影響.結(jié)果：與對照組相比，oxLDL抑制EPCs增殖，損傷細胞的分泌功能，作用隨oxLDL濃度增大而增強().結(jié)論：OxLDL抑制EPCs的增殖，損傷細胞分泌功能，促進細胞凋亡，與臨床上觀察到的冠心患者EPCs數(shù)量減少可能有一定的關(guān)系.

【關(guān)鍵詞】內(nèi)皮祖細胞；脂蛋白類，LDL；一氧化氮

0引言

成體動物及人的外周血、骨髓中存在有內(nèi)皮前體細胞，它們是以CD133,flk1,CD31,Ⅷ因子［1-2］為標(biāo)志的一群細胞，可以遷移、增殖并分化為成熟的內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮的修復(fù)及出生后新生血管化的形成［3］.新生血管化的形成可以改善心肌供血,并且阻止心肌梗塞區(qū)域疤痕組織的進一步形成［4］，從而改善心臟功能.大量的研究已經(jīng)證實，骨髓來源的EPCs有誘導(dǎo)缺血組織新生血管形成的潛力.相反,高脂血癥損傷新生血管和供應(yīng)缺血區(qū)組織血運的側(cè)支血管的形成.氧化低密度脂蛋白(oxLDL)在動脈粥樣硬化的形成過程中起著重要的作用，我們研究oxLDL是否影響內(nèi)皮前體細胞的增殖、凋亡及細胞功能，從而間接了解oxLDL對新生血管化的形成有何影響.

1材料和方法

材料雄性中國小型豬2只，體質(zhì)量kg，由我校實驗動物中心提供；PBS,Ficoll淋巴細胞分離液，胎牛血清，DMEM，VEGF及bFGF，10萬U青霉素和100mg/L鏈霉素，小鼠flk1、山羊?qū)貱D133、鼠CD31,FITC羊抗小鼠、FITC羊抗兔、羅丹明兔抗羊，NO,TBA試劑盒，LDL，6孔培養(yǎng)板;EliteESP流式細胞儀(美國COULTER公司)，OlympusTokyoCK相差顯微鏡，DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀，UV2450分光光度計，MRC1024激光共聚焦顯微鏡.

方法

豬骨髓單核細胞的分離30g/L濃度苯巴比妥1mL/kg麻醉后，左側(cè)髂后棘局部常規(guī)消毒鋪巾，20g/L利多卡因5mL局麻，沿髂后棘行骨穿，有落空感后接肝素化的20mL注射器用力抽吸.抽出的細胞懸液經(jīng)等體積DMEM混合重懸后，小心疊加于等體積淋巴細胞分離液上，保持界面清晰，2000r/min,離心20min，吸取中間云霧層細胞，5倍體積DMEM重懸，1500r/min,10min，洗滌兩次.末次離心后，棄上清，加入含100mL/L胎牛血清的DMEM重懸.取微量細胞懸液與等體積2g/L臺盼藍染液混合，進行細胞活力計數(shù)，死細胞被染成藍色，活細胞不著色，活細胞數(shù)占98%以上.細胞接種于培養(yǎng)瓶中，由于成纖維細胞貼壁較快，多于24h內(nèi)貼壁，故取24h未貼壁細胞，經(jīng)含100mL/L胎牛血清、VEGF,bFGF的全培養(yǎng)液重懸后接種培養(yǎng)；部分細胞接種于鋪有蓋玻片的24孔板中，細胞爬片48h后進行鑒定.

氧化低密度脂蛋白的制備低密度脂蛋白購于Sigma公司，經(jīng)PBS溶解后，與滅菌的CuSO4溶液,37℃孵育24h.對照含200μmol/LEDTA無CuSO4同樣條件孵育.孵育中止后，氧化的LDL加EDTA至終濃度mmol/L中止氧化，在含200μmol/LEDTA的PBS溶液中透析24h.丙二醛的生成表明LDL被氧化，用TBA法檢測丙二醛的生成.OxLDL中TBA濃度為mmol/kg.

實驗分組細胞80%長滿后，g/L胰蛋白酶消化，全培養(yǎng)液重懸呈單細胞懸液后，接種于96孔板及24孔板.貼壁后，取對數(shù)生長期細胞分組：A組(對照組)加等量含200μmol/LEDTA的全培養(yǎng)液；B,C,D組分別給予含oxLDL濃度為5,10及20mg/L的全培養(yǎng)液，37℃50mL/LCO2孵箱孵育.96孔板細胞孵育24h后，每孔加MTT5g/L,37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL的DMSO后振蕩10min，酶聯(lián)免疫檢測儀，490nm波長測各孔A值.細胞培養(yǎng)24h后，各取100μL細胞培養(yǎng)液，用硝酸還原酶法測NO的分泌量，使用南京建成NO試劑盒，方法見說明書；24孔板培養(yǎng)細胞在oxLDL作用72h后，g/L胰蛋白酶消化細胞中止后，送流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率.

細胞鑒定激光共聚焦：細胞爬片48h后，40g/L多聚甲醛固定30min后，PBS沖洗3次，干燥后分別按1∶75稀釋flk1和CD133的一抗，及CD31和CD133的一抗進行雙標(biāo)，4℃冰箱，濕盒過夜后，吸除剩余的一抗，PBS沖洗后分別加入1∶100稀釋的二抗進行雙標(biāo)，置入4℃冰箱，濕盒過夜，PBS沖洗后行激光共聚焦檢測，結(jié)果見圖1，2.

圖1CD31和CD133

圖2flk1和CD133

數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析對實驗組和對照組數(shù)據(jù)求其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)用進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所用統(tǒng)計方法為方差分析，多重均數(shù)差異顯著性檢驗采用LSDt檢驗.

2結(jié)果

對細胞增殖的影響經(jīng)oxLDL作用24h后，骨髓源性的EPCs的增殖能力與對照組相比，不同濃度的oxLDL對EPCs增殖均有明顯抑制作用，B組，C組，D組，且隨濃度增加而抑制作用增強，兩兩之間比較差別均有統(tǒng)計學(xué)意義，P均(n=8).

流式細胞儀檢測oxLDL對細胞凋亡的影響有文獻報道EPCs本身就存在有自身凋亡的現(xiàn)象，在本實驗中觀察到72h后對照組EPCs凋亡率為±，與對照組相比，不同組濃度的oxLDL對EPCs均有促凋亡作用，B組，D組，C組介于B,D組之間，以D組更為顯著，不同濃度的oxLDL促凋亡作用組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且隨濃度增高而促凋亡作用增強(n=6).

分泌量NO是一種有多種生物活性的物質(zhì)，在心血管系統(tǒng)有許多重要的生理作用，其化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝很快；NO分泌量是內(nèi)皮細胞功能的標(biāo)志，內(nèi)皮功能障礙通常表現(xiàn)為NO分泌量的減少.與對照組μmol/L相比，不同濃度的oxLDL均可損傷EPCs的NO分泌量，隨oxLDL濃度的增加，NO分泌量呈不同程度的減少，B組μmol/L,C組μmol/L,D組μmol/L分別與對照組相比P值均(n=6)，表明細胞功能也受到了不同程度的損害.

3討論

在Asahara等1997年發(fā)現(xiàn)循環(huán)內(nèi)皮前體細胞之前，臨近損傷部位的內(nèi)皮細胞局部遷移和增殖被認(rèn)為是內(nèi)皮修復(fù)的主要機制.近來研究表明出生后新生血管化并不單純依賴于已存在血管的出芽生長方式，而與循環(huán)外周血及骨髓中的EPCs細胞關(guān)系密切［1-2］.有作者已從外周血和骨髓中分離出EPCs，并證實可以增加缺血組織的新生血管化［3］.而循環(huán)血中的EPCs來源于骨髓，具有分化成ECs，修復(fù)損傷內(nèi)膜、形成新生血管的特性，因此其在冠心病治療中的巨大潛力愈來愈受到關(guān)注.最近有組織證實在動物及人的研究中，EPCs在新形成的血管內(nèi)皮細胞中占25%［5］.

大量的動物試驗和臨床研究都表明外周血中EPCs數(shù)目和冠心病的眾多危險因素之間存在著密切的關(guān)系［6］.有研究表明，從1型糖尿病患者血中分離出的EPCs經(jīng)培養(yǎng)后，與年齡和性別匹配的對照相比較降低了44%［7］.急性心梗后骨髓單核細胞局部注射可以通過誘導(dǎo)VEGF的形成，而減少心肌梗死的面積［8］.對缺血心肌局部供應(yīng)成血管細胞配體及生長因子等均可提高骨髓單核細胞移植后側(cè)支灌注及局部區(qū)域的心臟功能［9］.

依據(jù)EPCs能夠促進出生后新生血管化這一理論，考慮用EPCs作為增加缺血組織新生血管化的一個新的潛在的細胞療法，因此對調(diào)節(jié)EPCs生物活性的機制進一步了解，可以對新生血管化的發(fā)生機理提供新的線索.最近，有研究表明動脈粥樣硬化的危險因素與EPCs的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)［7］，而oxLDL是動脈粥樣硬化形成的一個重要因素.OxLDL可以阻止VEGF誘導(dǎo)的EPCs分化［10］，促進其老化，導(dǎo)致細胞功能失調(diào)［11］，但這方面研究還是比較少.

在本研究中，我們用不同濃度的oxLDL作用于EPCs，觀察對細胞的增殖、凋亡及分泌NO功能的影響.OxLDL可以促進細胞凋亡，損傷EPCs的增殖能力及細胞NO分泌功能.內(nèi)皮功能障礙在各種心血管疾病中發(fā)揮重要的作用，被認(rèn)為是伴隨著并使許多心血管疾病惡化的重要臨床綜合征.對EPCs的損害必然影響其參與血管內(nèi)皮的修復(fù)及進行生成新生血管化的能力.使我們進一步認(rèn)識到高膽固醇血癥不僅可以損傷血管內(nèi)皮，而且同時可以使EPCs數(shù)量減少促進其凋亡，使血管的損傷與修復(fù)能力間失去平衡，進一步促進冠心病的進展，同時也影響EPCs參與新生血管化.因此臨床進行抗oxLDL治療可以抵抗其誘導(dǎo)EPCs的凋亡及數(shù)量的減少，改善EPCs功能，從而有利于血管內(nèi)皮的修復(fù)及新生血管的形成..

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