基因工程和蛋白質(zhì)工程公開(kāi)課

基因工程和蛋白質(zhì)工程公開(kāi)課第一頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五

基因工程又叫做

或

。通俗地說(shuō)，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種

提取出來(lái)，加以

，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，

改造生物的遺傳性狀。基因拼接技術(shù)DNA重組技術(shù)基因修飾改造定向地一、基因工程的概念第二頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五操作對(duì)象：操作環(huán)境：原理：操作水平：目的：體外基因重組DNA分子水平基因定向地改造生物的遺傳特性一、基因工程的概念第三頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五為什么能把一種生物的基因“嫁接”到另一種生物上？為什么能把一種生物的基因可以在另一種生物體內(nèi)表達(dá)？不同生物的DNA都具有規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)和4種脫氧核苷酸組成不同的生物共用一套遺傳密碼思考第四頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五(1)來(lái)源：(2)特點(diǎn)：一種限切酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列并在特定位點(diǎn)準(zhǔn)確切割DNA主要來(lái)自原核生物二、基因工程的基本工具1.基因工程的——限制性?xún)?nèi)切酶

限制酶具有專(zhuān)一性第五頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五

EcoRⅠ黏性末端黏性末端限制性?xún)?nèi)切酶的作用過(guò)程第六頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五SmaⅠ平末端平末端第七頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五G1234512345A第八頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五(1)來(lái)源：(2)特點(diǎn)：一種限切酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列并在特定位點(diǎn)準(zhǔn)確切割DNA

(3)作用部位

磷酸二酯鍵主要來(lái)自原核生物二、基因工程的基本工具1.基因工程的——限制性?xún)?nèi)切酶第九頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。用同種限制酶切割來(lái)源不同的DNA獲得的黏性末端是否相同？

相同思考不同的限制酶呢？

不同第十頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來(lái)源的DNA片段混合將不同種來(lái)源的DNA片段連接起來(lái)生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切第十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）作用:催化磷酸二酯鍵形成，連接DNA片段二、基因工程的基本工具2.基因工程的——DNA連接酶第十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·coliDNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵第十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五（2）類(lèi)型：類(lèi)型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別（1）作用:催化磷酸二酯鍵形成，連接DNA片段二、基因工程的工具2.基因工程的——DNA連接酶第十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五尋根問(wèn)底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?GCTTAAGCTTAA第十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）運(yùn)載體種類(lèi)：質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等二、基因工程的工具3.基因工程的——運(yùn)載體質(zhì)粒：細(xì)菌細(xì)胞中一種很小的環(huán)狀DNA分子。裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌之外，并且有自我復(fù)制能力

（１）質(zhì)粒上會(huì)存在某些標(biāo)記基因，標(biāo)記基因有什么用途？（２）要想將某個(gè)特定基因與質(zhì)粒相連，需要用幾種限制性?xún)?nèi)切酶和幾種DNA連接酶處理？第十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五二、基因工程的工具3.基因工程的——運(yùn)載體（2）條件：①能自我復(fù)制并在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在②具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接③具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選④結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，大小適中第十七頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專(zhuān)一性(識(shí)別序列)切開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵

種類(lèi)E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶運(yùn)載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,大小適中能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個(gè)多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物

、動(dòng)植物病毒第十八頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.科學(xué)家們經(jīng)過(guò)多年的努力，創(chuàng)立了一種新興生物技術(shù)——基因工程，實(shí)施該工程的最終目的是A.定向提取生物體的DNA分子B.定向地對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切”C.在生物體外對(duì)DNA分子進(jìn)行改造D.定向地改造生物的遺傳性狀D練習(xí)第十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.下列有關(guān)基因工程中限制酶的描述，錯(cuò)誤的是A.一種限制酶只能識(shí)別一種特定的脫氧苷酸序列B.限制酶的活性受溫度的影響C.限制酶能識(shí)別和切割RNAD.限制酶可從原核生物中提取練習(xí)C第二十頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.下列有關(guān)基因工程中限制酶的描述，錯(cuò)誤的是A.一種限制酶只能識(shí)別一種特定的脫氧苷酸序列B.限制酶的活性受溫度的影響C.限制酶能識(shí)別和切割RNAD.限制酶可從原核生物中提取練習(xí)C第二十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五3.關(guān)于限制酶說(shuō)法中，正確的是（）A．限制酶是一種酶，只識(shí)別GAATTC堿基序列B．EcoRI切割的是G—A之間的氫鍵C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中練習(xí)C第二十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五4.以下說(shuō)法正確的是（）A.所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列B.質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C.運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D.DNA連接酶使黏性末段的堿基之間形成氫鍵C練習(xí)第二十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.基因工程的操作工具：限制性?xún)?nèi)切酶、DNA連接酶2.基因工程的工具酶：限制性?xún)?nèi)切酶、DNA連接酶、載體復(fù)習(xí)舊知3.限制性?xún)?nèi)切酶的化學(xué)本質(zhì)是

；DNA連接酶的化學(xué)本質(zhì)是

；載體的化學(xué)本質(zhì)是

。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)DNA4.限制性?xún)?nèi)切酶的作用部位是

；DNA連接酶的作用部位

。磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵第二十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五復(fù)習(xí)舊知5.限制性?xún)?nèi)切酶的特點(diǎn)：一種限制性?xún)?nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的

序列，并于

上準(zhǔn)確地切割雙鏈DNA分子。脫氧核糖核苷酸特定位點(diǎn)6.載體必需具備的特點(diǎn)1.結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,大小適中2.能在宿主細(xì)胞中

并穩(wěn)定存在3.具一個(gè)或多個(gè)

。4.具

基因自我復(fù)制限制酶切位點(diǎn)標(biāo)記第二十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.目的基因的獲取基因工程的一般程序2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)與鑒定第二十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五（一）目的基因的獲取三、基因工程的基本操作程序1.目的基因：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2.獲取方法：（1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（3）通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成第二十七頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因①基因文庫(kù)將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。基因文庫(kù)

基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）第二十八頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五②基因文庫(kù)的構(gòu)建方法（1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因a.直接分離—“鳥(niǎo)槍法”（原核細(xì)胞）優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：工作量大，具一定盲目性b.人工合成—反轉(zhuǎn)錄（真核細(xì)胞）取出DNA用限制酶切斷DNA第二十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五通過(guò)對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因③基因文庫(kù)的儲(chǔ)存（1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因第三十頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①PCR全稱(chēng)為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。第三十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五③條件：___________、___________、__________________、________________。②原理：__________DNA復(fù)制脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶模板DNA（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①PCR全稱(chēng)為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。④過(guò)程：第三十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五模板DNA95℃第三十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物第三十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第三十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始第三十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五④過(guò)程：a.DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b.退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第三十七頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成（3）化學(xué)方法人工合成目的基因DNA合成儀第三十八頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五從基因文庫(kù)中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成（一）目的基因的獲取三、基因工程的基本操作程序第三十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶相同的黏性末端DNA連接酶（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心步驟）三、基因工程的基本步驟第四十頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五重組載體組成：三、基因工程的基本步驟a.目的基因b.啟動(dòng)子c.終止子d.標(biāo)記基因（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心步驟）第四十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、基因工程的基本步驟1.植物細(xì)胞：2.動(dòng)物細(xì)胞：3.微生物細(xì)胞：（受精卵、卵細(xì)胞、體細(xì)胞）（受精卵或早期胚胎干細(xì)胞）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞法第四十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（雙子葉植物和裸子植物）Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌第四十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞

方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？第四十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少過(guò)程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞用Ca2＋處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性第四十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五受體生物植物動(dòng)物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞/個(gè)體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、基因工程的基本步驟第四十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.檢測(cè)（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定三、基因工程的基本步驟①導(dǎo)入檢測(cè)：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因DNA分子雜交法（或核酸探針?lè)ǎ┑谒氖唔?yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五②轉(zhuǎn)錄檢測(cè)：檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA分子雜交法（核酸探針?lè)ǎ鄯g檢測(cè)：檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)免疫法，提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交1.檢測(cè)（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定三、基因工程的基本步驟①導(dǎo)入檢測(cè)：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因DNA分子雜交法（或核酸探針?lè)ǎ┑谒氖隧?yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.檢測(cè):是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯2.鑒定:個(gè)體生物學(xué)水平鑒定（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定三、基因工程的基本步驟第四十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五第五十頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五歸納:基因工程的基本操作程序1.獲取目的基因2.構(gòu)建基因表達(dá)載體3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)與鑒定從基因文庫(kù)利用PCR化學(xué)方法人工合成目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因載體轉(zhuǎn)化法（微生物）、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（植物）、顯微注射法（動(dòng)物）第五十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二節(jié)基因工程的應(yīng)用第五十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星期五一、基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用①抗蟲(chóng)棉②金米第五十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，編輯于2023年，星