分子遺傳學(xué)課件遺傳多態(tài)性

分子遺傳學(xué)課件遺傳多態(tài)性演示文稿當(dāng)前第1頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)分子遺傳學(xué)教師：劉若余當(dāng)前第2頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)基因組多態(tài)性基因組多態(tài)性：在不同群體或個體之間，基因組的某些位點(diǎn)上堿基的差異。這種差異也稱之為分子遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征在經(jīng)典遺傳學(xué)中,遺傳多態(tài)性是指等位基因的變異.在現(xiàn)代遺傳學(xué)中,遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對差異.當(dāng)前第3頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)

DNA分子標(biāo)記是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映.DNA水平的遺傳多態(tài)性表現(xiàn)為核苷酸序列的任何差異,哪怕是單個核苷酸的變異.因此,DNA標(biāo)記在數(shù)量上幾乎是無限的.當(dāng)前第4頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)DNA遺傳標(biāo)記特點(diǎn)：1.直接反映基因特征，非推測。

2.基因座位數(shù)量多，無論表達(dá)與否。

3.多態(tài)性程度高，等位基因多，鑒別能力強(qiáng)。

4.適合于陳舊的樣品，檢測能力強(qiáng)。

5.靈敏度高，有利于微量樣品的檢測。

6.易于檢測手段的自動化、標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性好。逐漸取代了蛋白質(zhì)水平的檢測方法。當(dāng)前第5頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)DNA多態(tài)性的分類

1）長度多態(tài)性：等位基因片段長度的個體差別。由一特定序列，首尾相連串聯(lián)重復(fù)次數(shù)不同產(chǎn)生的個體差別。可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat,STR)A：產(chǎn)生原因：DNA滑動與同源染色體不等交換。當(dāng)前第6頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)2）序列多態(tài)性：DNA片段堿基排列順序的個體差別。單核苷酸多態(tài)性（singleucleotidepolymorphism,SNPs）原因：堿基的置換、插入、缺失。特點(diǎn)：多位于非編碼區(qū)，選擇壓力。數(shù)量多，1/1000bp，300萬二態(tài)性，2個等位基因，多態(tài)性程度較低。孤立事件，人類遺傳學(xué)意義大。當(dāng)前第7頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)DNA標(biāo)記的分類依據(jù)多態(tài)性的檢測手段,DNA標(biāo)記可分為四大類:(1)基于DNA-DNA雜交的DNA標(biāo)記.

該標(biāo)記技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子,然后用經(jīng)標(biāo)記的DNA探針,通過放射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示DNA的多態(tài)性.其中最具代表性的是發(fā)現(xiàn)最早和應(yīng)用廣泛的RFLP標(biāo)記.當(dāng)前第8頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)(2)基于PCR的DNA標(biāo)記.

根據(jù)PCR所用的引物特點(diǎn),這類DNA標(biāo)記可分為隨機(jī)引物PCR標(biāo)記和特異引物PCR標(biāo)記.隨機(jī)引物PCR標(biāo)記包括RAPD標(biāo)記和ISSR等,隨機(jī)引物PCR所擴(kuò)增的DNA區(qū)段事先未知,具有隨意性和任意性,因此隨機(jī)引物PCR標(biāo)記技術(shù)可用于對任何未知基因組的研究.特異引物PCR標(biāo)記包括SSR標(biāo)記和STS標(biāo)記等,特異引物PCR所擴(kuò)增的DNA區(qū)段事先是已知的明確的,具有特異性.因此特異引物PCR標(biāo)記技術(shù)依賴于對各個物種基因組信息的了解.當(dāng)前第9頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)(3)基于PCR和限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNA標(biāo)記.這類DNA標(biāo)記可分為二種類型,一種是通過對限制性酶切片段的選擇性擴(kuò)增來顯示限制性片段長度的多態(tài)性,如AFLP標(biāo)記.另一種是通過對PCR擴(kuò)增的片段的限制性酶切來揭示被擴(kuò)增的區(qū)段的多態(tài)性,如CASP標(biāo)記.當(dāng)前第10頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)4)基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記,如SNP標(biāo)記.單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記被稱為第三代分子標(biāo)記。它也是以以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。當(dāng)前第11頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)基于遺傳標(biāo)記的發(fā)展歷程第一代標(biāo)記經(jīng)典的遺傳標(biāo)記（蛋白質(zhì)和免疫學(xué)的標(biāo)記）

70年代中后期，限制酶片段長度多態(tài)性（RFLP）第二代標(biāo)記

85年，“小衛(wèi)星序列"（minisatellite）89年，“微衛(wèi)星序列"（microsatellite）第三代標(biāo)記單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（singlenucleotidepolymorphism，SNP）當(dāng)前第12頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)經(jīng)典的遺傳標(biāo)記（蛋白質(zhì)和免疫學(xué)的標(biāo)記）ABO血型位點(diǎn)標(biāo)記HLA位點(diǎn)標(biāo)記（人類白細(xì)胞抗原）存在問題：已知多態(tài)的蛋白質(zhì)很少等位基因的數(shù)目有限無法獲得足夠的信息量檢測技術(shù)的繁瑣等—限制了人類基因組的遺傳分析工作—促使人們直接在DNA上尋找遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記中的第一代標(biāo)記當(dāng)前第13頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)蛋白質(zhì)和免疫學(xué)的標(biāo)記當(dāng)前第14頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)同工酶的多態(tài)性EsD分型示意圖當(dāng)前第15頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)遺傳標(biāo)記中的第一代標(biāo)記RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)標(biāo)記技術(shù)

RFLP即限制性片段長度多態(tài)性.是指用某一種限制性內(nèi)切酶來切割來自不同個體的DNA分子上，內(nèi)切酶的識別序列有差異，即是由限制性酶切位點(diǎn)上堿基的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變所引起的。這種差異反映在酶切片段的長度和數(shù)目上。

限制性內(nèi)切酶是一種能識別DNA上特定堿基組成的序列,并在這些序列位點(diǎn)上切斷DNA分子的酶.當(dāng)前第16頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)限制性片段長度多態(tài)性的DNA基礎(chǔ)（1）

識別部位的點(diǎn)突變：堿基的替換、修飾（甲基化）或插入與缺失。（2）

識別部位間的片段插入與缺失。（3）

識別部位間的重復(fù)序列數(shù)目的變化。當(dāng)前第17頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)

DNA限制性內(nèi)切酶restrictionendonuclease能夠識別特定的DNA序列，與DNA分子結(jié)合后在特定部位將DNA雙鏈切斷的核酸水解酶。（1）生物學(xué)功能：水解核酸的磷酸二酯鍵。（2）命名：根據(jù)微生物的種（第一個字母大寫）、屬（前二個字母小寫）、變種第一個字母大寫）、發(fā)現(xiàn)分離的順序（羅馬數(shù)字）。（3）分類：A：Ⅰ型：遠(yuǎn)離識別部位隨即切割，非特異。B：Ⅱ型：在識別部位內(nèi)部切割，特異。C：Ⅲ型：在識別部位后定點(diǎn)切割，特異。單位：1U：在標(biāo)準(zhǔn)條件下，1h完全水解1μgλ噬菌體的酶量。當(dāng)前第18頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)Ⅱ型DNA限制性內(nèi)切酶：

A：識別核酸序列數(shù)目4-6個。

B：識別序列為回紋序列。

C：切割后產(chǎn)生的末端分為粘行末端與平末端。例：PstⅠ5ˊ-C↓TGCAG-3ˊ3ˊ-GACGT↑C-5ˊHaeⅢ5ˊ-GG↓CC-3ˊ3ˊ-CC↑GG-5ˊ當(dāng)前第19頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)當(dāng)前第20頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)分型法：

RFLP標(biāo)記是發(fā)展最早的DNA標(biāo)記技術(shù)。RFLP技術(shù)主要包括以下基本步驟：DNA提取用限制性內(nèi)切酶酶切DNA、用凝膠電泳分開DNA片段把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上利用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）和結(jié)果分析。當(dāng)前第21頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)當(dāng)前第22頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)當(dāng)前第23頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)特點(diǎn)A無表型效應(yīng)，RFLP標(biāo)記的檢測不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。BRFLP標(biāo)記在等位基因之間是共顯性的，因此在配制雜交組合時不受雜交方式的影響。C在非等位的RFLP標(biāo)記之間不存在上位效應(yīng)，因而互不干擾DRFLP標(biāo)記起源于基因組DNA的自身變異，在數(shù)量上幾乎不受限制EDNA需要量大，檢測技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。在植物分子標(biāo)記輔助育種中需要將RFLP轉(zhuǎn)換成以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記。當(dāng)前第24頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)PCR-RFLP當(dāng)前第25頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)PCR-RFLPAnalysisTT:55+68+135+241+302bpCT:55+68+135+241+302+543bpCC:55+68+135+543bp

AA:152+187+462bpCA:83+104+152+187+462bpCC:83+104+152+462bp當(dāng)前第26頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)真核生物基因組中廣泛存在著串聯(lián)重復(fù)序列。根據(jù)重復(fù)單位大小的不同，將重復(fù)序列分為三類：衛(wèi)星序列、小衛(wèi)星序列和微衛(wèi)星序列。衛(wèi)星DNA:序列重復(fù)單位的長度最常見的是100~300bp,有時可達(dá)幾千bp,這些基元的拷貝數(shù)是1000~100000,形成很長的成串的重復(fù)結(jié)構(gòu).通常存在于異染色質(zhì)，主要分布在著絲粒區(qū)域。小衛(wèi)星DNA:是一些重復(fù)單位在10~60bp,總長度由幾百到幾千個bp串聯(lián)重復(fù)序列,它主要存在于近端粒處,在不同的個體間存在著串聯(lián)數(shù)目的差異,表現(xiàn)出高度的個體特異性,且以孟德爾方式穩(wěn)定地遺傳和分離,通常又被稱為DNA指紋.該類可通過RFLP的方法加以鑒別.當(dāng)前第27頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)簡單序列重復(fù)標(biāo)記，SSR又稱微衛(wèi)星DNA(Micro-satelliteDNA)標(biāo)記；屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元2~6bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重復(fù)，重復(fù)區(qū)大多幾十~幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了２萬余個位點(diǎn)。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG當(dāng)前第28頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)當(dāng)前第29頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)一個家系的微衛(wèi)星PCR檢測結(jié)果當(dāng)前第30頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)SSR標(biāo)記的主要特點(diǎn)（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因組；（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。當(dāng)前第31頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)微衛(wèi)星DNA多態(tài)形成的機(jī)制

微衛(wèi)星位點(diǎn)由其核心序列(coresequence)和兩側(cè)的側(cè)翼序列(flankingsequence)共同構(gòu)成,側(cè)翼序列具有位點(diǎn)特異性,而微衛(wèi)星本身的重復(fù)數(shù)變異則提供了微衛(wèi)星位點(diǎn)產(chǎn)生多態(tài)性的基礎(chǔ).重復(fù)數(shù)越大,其變異性也越大,等位基因數(shù)也越多.引起微衛(wèi)星位點(diǎn)發(fā)生突變的原因主要為“滑鏈錯配”（slipped-strandmispairing)。在DNA復(fù)制合成的過程中，新生鏈和模板鏈之間在微衛(wèi)星重復(fù)區(qū)域可能發(fā)生錯配，使得一個或者幾個重復(fù)單位形成環(huán)狀，未能參與配對。如果未配對的重復(fù)單位位于新生鏈，則最終得到的新生鏈未配對重復(fù)單位數(shù)目比模板鏈多。反之，如果未配對的重復(fù)單位位于模板鏈，則最終得到的新生鏈未配對重復(fù)單位數(shù)目比模板鏈少.當(dāng)前第32頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)微衛(wèi)星的檢測

1．基因組DNA制備2．微衛(wèi)星DNA的擴(kuò)增：反應(yīng)總體積為25μL3．SSR標(biāo)記電泳檢測：分3個主要環(huán)節(jié)。1）電泳：

采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,設(shè)恒定功率,預(yù)電泳約30min后,加擴(kuò)增樣品DNA4～6μL,電泳40～60min(視ＳＳＲ分子量大小及差異帶的可辨度調(diào)整電泳時間)。

2）染色：SSRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳之后用銀染法來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,不僅可避免使用同位素,而且分辨率很高,甚至能檢測出1ng以下的DNA。3）統(tǒng)計(jì)分析：根據(jù)不同的研究目的,應(yīng)用相關(guān)軟件進(jìn)行分析。當(dāng)前第33頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)基因型判定 由于在變性膠中PCR產(chǎn)物是單鏈，并且不受其堿基組成影響，因此，如果微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物兩條互補(bǔ)鏈分子質(zhì)量相近，在變性膠中純合子為單帶，雜合子為雙帶；如果微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物兩條互補(bǔ)鏈分子質(zhì)量相差較大，在變性膠中純合子為雙帶，雜合子為四條帶。當(dāng)前第34頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)當(dāng)前第35頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphismSNP)A.定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。不同個體間，基因組DNA某部位的單核苷酸的變異。1996年，Lander報(bào)道了用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（singlenucleotidpolymorphismSNP）制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。當(dāng)前第36頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)B.SNP在人類基因組中出現(xiàn)的頻率SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)1700萬個甚至更多。

ThereisoneSNPinevery1000basesleadstoanestimatethatanytwoindividualsdifferbyuptothreemillionSNPs.

在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(codingsNP,cSNP)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。當(dāng)前第37頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)C.SNP檢測方法目前已有多種方法可用于SNP檢測：★直接測序.★單鏈構(gòu)像多態(tài)性singlestrandconformation

polymorphism,SSCP).★寡聚核苷酸特異的連接；★

DNA芯片以及TaqMan系統(tǒng)等。但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，然后才能進(jìn)行其它檢測。當(dāng)前第38頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)D.

SNP用作遺傳標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)(1)SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計(jì)出來。(2)它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。(3)與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)相比，SNP是高度穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。(4)部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。(5)易于進(jìn)行自動化分析，縮短了研究時間。當(dāng)前第39頁\共有43頁\編于星期三\0點(diǎn)單鏈構(gòu)像多態(tài)性singlestrandconformation

polymorphism,SSCP).日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開.作者稱該方法為單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)分析.在隨后的研究中，作者又將SSCP用于檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變，從而建立了PCR-S