基因控制生物的性狀(完整資料)

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人教版八年級(下）基因控制生物的性狀(完整資料）(可以直接使用，可編輯優(yōu)秀版資料，歡迎下載）第七單元生物圈中生命的延續(xù)和發(fā)展第二章生物的遺傳和變異第一節(jié)基因控制生物的性狀教學(xué)目標(biāo):知識目標(biāo)：理解遺傳和變異的概念。舉例說出生物的性狀,以及親子代間在性狀上的延續(xù)現(xiàn)象。舉例說出不同種性狀和相對性狀之間的區(qū)別。舉例說出生物的性狀是由基因控制的.能力目標(biāo):能夠正確判斷出所給的兩個或多個性狀是否互為相對性狀.情感態(tài)度價值觀：關(guān)注轉(zhuǎn)基因技術(shù)給人類帶來的影響。教學(xué)重點:性狀及相對性狀的判斷。明確基因與性狀間的關(guān)系。教學(xué)難點：相對性狀的判斷.教學(xué)過程：教學(xué)內(nèi)容教師的教學(xué)行為學(xué)生行為新課導(dǎo)入遺傳與變異的概念展示小貓一家的圖片,提出問題：1、貓媽媽和小貓們像嗎？２、它們完全一樣嗎？3、你和自己的父母相比有哪些相同點和不同點呢？思考后回答問題，明確:遺傳是親子間的相似性。變異指親子間和子代個體間的差異。性狀同學(xué)們，我們已經(jīng)知道了人類對遺傳和變異的認(rèn)識,是從性狀開始的，那什么是生物的性狀呢？接下來就讓我們一起來看一看什么是性狀。植物中,豌豆的形狀、番茄的顏色，以及豌豆莖的高度，這些都是性狀。當(dāng)然，性狀同樣存在于動物個體中.比如兔子的毛色、公雞雞冠的形狀等。那么,請大家想一想：1、人的身上有哪些性狀?2、你能總結(jié)出生物性狀的概念嗎?同學(xué)們回答的非常好。除了書上已經(jīng)列出的四種人類的性狀外，人的AＢＯ血型以及酒窩也屬于性狀。想一想,是不是所有的性狀都能直接用眼睛看到呢？我們可以總結(jié)出性狀的概念：性狀是對生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化和行為方式等特征的總稱。我們剛剛看到的那些例子中：血型屬于生理生化；能否把舌由兩側(cè)向中央卷曲及大拇指能否向背側(cè)彎曲屬于行為方式；其他均屬于形態(tài)結(jié)構(gòu)。展示一張圖片,請學(xué)生同桌間相互說一說自己能找到或是能聯(lián)想到哪些性狀.學(xué)生分小組討論，結(jié)束后選兩個小組的代表回答：人的性狀有:有耳垂、無耳垂；單眼皮、雙眼皮；能否把舌由兩側(cè)向中央卷曲;能否使大拇指向背側(cè)彎曲。性狀就是生物的外觀/樣子／特征。不能明確性狀的概念。相對性狀的概念及判斷接下來請大家想一想：在剛才我們見到的那些性狀中，每一對中的性狀有什么相同點和不同點呢?提示：第一組的性狀都是豌豆粒的形狀，不過它們有的是圓粒，有的是皺粒;同樣是兔子的毛色,有白也有黑。很好，我們能夠很容易的看出，每一組都是同一物種的同一性狀,但是表現(xiàn)形式不同。我們把同一性狀的不同表現(xiàn)形式稱為相對性狀。這里需要注意:相對，就表示至少要有兩個或兩個以上才能是相對。如果沒有對比是不能稱其為“相對”性狀的。回答問題：每一組都是同一個性狀，但是表現(xiàn)不一樣。明確相對性狀的概念，并能夠判斷任意兩個性狀是否為相對性狀。下面我們來做一個小練習(xí)，請大家判斷以下幾組性狀是相對性狀嗎？講解,對于易錯點進行講解.提出問題：那么，是什么原因產(chǎn)生了不同的性狀呢？完成PＰT上的練習(xí)題。基因控制性狀講述轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生過程，請學(xué)生分組討論:1、在這項研究中,被研究的性狀是什么？2、轉(zhuǎn)基因超級鼠的獲得,說明性狀和基因之間是什么關(guān)系？３、由此推論，在生物傳種接代的過程中，傳下去的是性狀還是控制性狀的基因？小組討論回答問題。明確生物的性狀是由基因控制的。環(huán)境與性狀的關(guān)系在學(xué)生已經(jīng)知道了基因控制性狀后，提出問題:是不是只有基因能影響生物的性狀呢？教師展示事例.觀察同種植物的同一性狀在不同環(huán)境下不同的表現(xiàn)。明白環(huán)境能夠影響生物的性狀。生物的性狀是由基因和環(huán)境共同作用的。正確看待轉(zhuǎn)基因除了轉(zhuǎn)基因小鼠外,你還知道那些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物？目前對于轉(zhuǎn)基因的說法有很多，那么你認(rèn)為轉(zhuǎn)基因安全嗎？展示社會各方對轉(zhuǎn)基因食品安全的看法，引導(dǎo)學(xué)生正確看待轉(zhuǎn)基因.學(xué)生通過提前查閱資料回答.學(xué)生分成兩組，對轉(zhuǎn)基因的安全性進行辯論。鞏固練習(xí)完成練習(xí)、布置作業(yè)。完成習(xí)題板書設(shè)計：基因控制生物的性狀基因控制生物的性狀形態(tài)性狀生理行為{同一性狀相對性狀表現(xiàn)不同2個/多個{環(huán)境+基因=性狀課后反思:《基因工程及其應(yīng)用》教案【教學(xué)目標(biāo)】知識目標(biāo)掌握基因工程的概念、原理;基因操作的工具及其操作過程.能力目標(biāo)培養(yǎng)學(xué)生分析、推理、歸納、總結(jié)的能力。德育目標(biāo)培養(yǎng)學(xué)生實事求是的科學(xué)態(tài)度從現(xiàn)象到本質(zhì)的科學(xué)的研究方法?！窘虒W(xué)重點】基因工程的基本原理，基因操作的工具，基本步驟及其應(yīng)用.【教學(xué)難點】基因工程的基本原理,基因工程的應(yīng)用及其安全性?！菊n時安排】1課時【教學(xué)過程】一、情境創(chuàng)設(shè)提問:各種生物間的性狀千差萬別這是為什么呢?引導(dǎo):生物體的不同性狀是通過基因特異性表達而形成的.列舉：幾種生物的不同性狀：夠吐出絲;豆科植物的根瘤菌能夠固定空氣中的氮氣；青霉菌能產(chǎn)生對人類有用的抗生素——青霉素.提問:人類能不能改造性狀?能不能使本身沒有某個性狀的生物具有某個特定性狀呢？引導(dǎo)：讓禾本科植物能夠固定空氣中的氮氣;能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲；讓微生物生產(chǎn)出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物。(這種設(shè)想能實現(xiàn)嗎？)定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。二、師生互動（1）基因工程的原理指導(dǎo)學(xué)生閱讀教材P102頁第二段,通過提問的方式指導(dǎo)學(xué)生找出概念中的關(guān)鍵詞語，并讓學(xué)生理解基因工程概念,引導(dǎo)學(xué)生獨立完成。最后歸納列表，便于學(xué)生的記憶.概念：在生物體外,通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合,然后導(dǎo)入受體細(xì)胞進行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出所需要的基因產(chǎn)物.（2）基因操作的工具利用多媒體課件演示抗蟲棉培育過程示意圖,同時提出討論問題,進行分組討論,最后交流討論結(jié)果,教師進行歸納總結(jié)。思考：在以上的基因工程培育的過程中,關(guān)鍵步驟或難點是什么?引導(dǎo)：關(guān)鍵步驟的完成過程中都要用到基因操作工具,并使學(xué)生形象地記憶“工具”的作用。A基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶（簡稱限制酶）。通過演示多媒體動畫,將限制酶的作用過程進行動態(tài)演示，使學(xué)生理解抽象的知識內(nèi)容。

①存在：主要是存在于微生物細(xì)胞中。②特性:一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列,并在特定的切點切割DNA分子。③作用結(jié)果：得到具有黏性末端或平末端的DNＡ片段,如大腸桿菌中的EcoＲI，能夠?qū)Ｒ蛔R別GＡATTＣ的序列,并在G和Ａ之間將這段序列切開.Ｂ基因的針線——DNA連接酶從DNＡ的結(jié)構(gòu)入手,利用多媒體動畫演示連接酶的連接部位，利用形象的比喻使學(xué)生更容易接受和理解.DNA連接酶的作用是在DNA分子的連接過程中，黏合脫氧核糖和磷酸之間的缺口，即將由同一種限制酶切割后的黏性末端（堿基互補）的脫氧核糖和磷酸連接起來。C基困的運輸工具——運載體對于運載體的教學(xué)，應(yīng)使學(xué)生形象地理解運載體的作用、種類及其所具備的條件。目前常用的運載體有質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒等。其中,質(zhì)粒存在于細(xì)菌及酵母菌等生物中,是擬核或細(xì)胞核外能夠自我復(fù)制的很小的環(huán)狀DＮA分子。學(xué)習(xí)完這些操作工具后,再來看看現(xiàn)有的基因工程的成果,大家一起思考下這些工具到底怎樣操作才能完成基因工程的過程呢？歸納:請學(xué)生寫出基因工程操作的基本步驟和操作過程?？偨Y(jié)：基本步驟：剪切→拼接→導(dǎo)入→表達操作過程：提取目的基因→目的基因與運載體結(jié)合→目的基因?qū)胧荏w→目的基因檢測與鑒定(3）基因工程的應(yīng)用。①基因工程與作物育種作物育種：人們利用基因工程的方法獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，耐貯存的番茄，耐鹽堿的棉花,抗除草劑的玉米、油菜、大豆等.抗蟲基因作物的使用，不僅減少了農(nóng)藥的用量，大大降低了生產(chǎn)成本，而且還減少了農(nóng)藥對環(huán)境的污染。②基因工程與藥物研制利用基因工程生產(chǎn)的藥物有胰島素、干擾素、白細(xì)胞介素、溶血栓劑、凝血因子,以及預(yù)防乙肝、霍亂、傷寒、瘧疾的疫苗等.基因工程生產(chǎn)藥品的優(yōu)點是效率高、成本低、品質(zhì)好。③轉(zhuǎn)基因生物和轉(zhuǎn)基因食品的安全性轉(zhuǎn)基因生物和轉(zhuǎn)基因食品的優(yōu)點:解決糧食短缺問題;減少農(nóng)藥使用,從而減少環(huán)境污染；節(jié)省生產(chǎn)成本，降低糧食售價；增加糧食營養(yǎng)，提高附加價值;增加食物種類,提升食物品質(zhì)；促進生產(chǎn)效率,帶動相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。轉(zhuǎn)基因生物和轉(zhuǎn)基因食品的缺點：可能產(chǎn)生新毒素和新過敏原，可能產(chǎn)生抗除草劑的雜草，可能使疾病的散播跨越物種障礙，可能威脅其他生物的生存，可能干擾生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。三、板書設(shè)計一、基因工程的原理基因工程的別名操作對象操作水平原理操作環(huán)境結(jié)果（目的）基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)基因DNＡ分子水平基因重組生物體外定向地改造生物的遺傳性狀二、基因操作的工具1基因的剪刀—-限制性內(nèi)切酶(簡稱限制酶）。２基因的針線—-ＤNA連接酶3基困的運輸工具——運載體三、基因工程的應(yīng)用四、課堂總結(jié)及布置作業(yè)復(fù)習(xí)基因工程操作的基本步驟和重要工具，完成課后習(xí)題第2節(jié)基因在染色體上課程目標(biāo)１、說出基因位于染色體上的理論假說和實驗證據(jù).２、運用有關(guān)基因和染色體的知識闡明孟德爾遺傳規(guī)律的實質(zhì)。3、嘗試運用類比推理的方法,解釋基因位于染色體上.4、認(rèn)同科學(xué)研究需要豐富的想像力,大膽質(zhì)疑和勤奮實踐的精神，以及對科學(xué)的熱愛.基礎(chǔ)知識1、薩頓的假說(１)內(nèi)容：基因是由染色體攜帶著從親代傳遞給下一代的,即基因就在染色體上.（2）原因：基因和染色體行為存在著明顯的平行關(guān)系(3）研究方法：類比推理法。由兩個或兩類對象在某些屬性上相同的現(xiàn)象，推斷出它們在另外的屬性上也相同的一種推理方法。(4）推理:①獨立性：基因在雜交過程中保持完整性和獨立性，染色體在配子形成和受精過程中，也有相對穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)②存在方式：體細(xì)胞中染色體和基因成對存在,在配子中只有成對中的一個。③來源:體細(xì)胞中成對的基因一個來自父方,一個來自母方，同源染色體也是如此。④非等位基因在形成配子時自由組合,非同源染色體在減數(shù)第一次分裂后期也是自由組合.思考：薩頓認(rèn)為基因和染色體存在什么關(guān)系？提示:平行關(guān)系.2.基因位于染色體上的實驗證據(jù)(１)實驗者:摩爾根。（2)實驗材料：果蠅。（相對性狀多且明顯、培養(yǎng)周期短、成本低易飼養(yǎng)、染色體數(shù)目少便于觀察、繁殖率高)(3)實驗過程及現(xiàn)象：P紅眼（雌）×白眼（雄）↓F1紅眼(雌、雄）↓Ｆ2紅眼（雌、雄）白眼(雄)３/41/4(4）提出問題:白眼性狀與性別相聯(lián)系.(5)作出假設(shè):控制白眼的基因在X染色體上,Y染色體上不含有它的等位基因。（6）理論解釋:（7）設(shè)計測交實驗:Ｆ1紅眼雄果蠅與白眼雌果蠅測交。（8）結(jié)論:白眼基因在Ｘ染色體上.摩爾根通過實驗,將一個特定的基因(控制白眼的基因w)和一條特定的染色體（X染色體)聯(lián)系起來，從而用實驗證明了：基因在染色體上。思考:果蠅的紅眼基因在哪里?若雄果蠅是紅眼，與白眼雌果蠅雜交子代果蠅中紅眼的是什么性別?提示:紅眼基因在X染色體上。紅眼的都是雌性。３。基因和染色體的關(guān)系基因在染色體上呈線性排列,一條染色體上有許多個基因。4．孟德爾遺傳規(guī)律的現(xiàn)代解釋(１）基因的分離定律的實質(zhì)：①在雜合子的細(xì)胞中，位于一對同源染色體上的等位基因，具有一定的獨立性;②在減數(shù)分裂形成配子的過程中，等位基因會隨同源染色體的分開而分離，分別進入兩個配子中,獨立地隨配子遺傳給后代。(2)基因的自由組合定律的實質(zhì):①位于非同源染色體上的非等位基因的分離或組合是互不干擾的;②在減數(shù)分裂過程中，同源染色體上的等位基因彼此分離的同時，非同源染色體上的非等位基因自由組合。思考：基因型為AａBb的個體能夠產(chǎn)生四種配子的根本原因是什么？提示：減數(shù)分裂第一次分裂時，等位基因分離的同時，非等位基因自由組合。重點難點1.薩頓假說的證明摩爾根利用果蠅的雜交實驗證明了薩頓假說是正確的，證明方法是假說-演繹法，與孟德爾的假說—演繹法相同。（1)發(fā)現(xiàn)問題：果蠅的白眼性狀總是與性別相關(guān).（2）提出假說:控制白眼的基因在X染色體上,Y染色體上不含它的等位基因.(3)證明假說:利用測交實驗，讓白眼雌果蠅與F1中的紅眼雄果蠅交配,證明了控制白眼性狀的基因位于X染色體上。(4）得出結(jié)論:基因在染色體上。特別提醒：摩爾根成功的原因：把特定的基因與特定的Ｘ染色體聯(lián)系在一起,從而證實了基因在染色體上。2．分離定律的實質(zhì)規(guī)律總結(jié)（1）分離定律的實質(zhì)是等位基因在減數(shù)分裂產(chǎn)生配子時隨著同源染色體分開而分離。(２）基因分離定律的驗證方法是測交法（子代表現(xiàn)型比是1∶1)或自交法(子代表現(xiàn)型比是3∶1)。3.自由組合定律的實質(zhì)４.核遺傳兩大遺傳基本規(guī)律的比較規(guī)律事實

分離定律自由組合定律研究性狀一對兩對以上控制性狀的等位基因一對兩對以上等位基因與染色體的關(guān)系位于一對同源染色體上分別位于兩對或兩對以上同源染色體上細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)（染色體的活動)減Ⅰ后期同源染色體分離減Ⅰ后期非同源染色體自由組合遺傳實質(zhì)等位基因分離非同源染色體上的非等位基因自由組合F１基因?qū)?shù)12或ｎ配子類型及其比例21∶１2２或２n數(shù)量相等配子組合數(shù)442或4nF２基因型種類332或3ｎ表現(xiàn)型種類２２2或2ｎ表現(xiàn)型比3∶1（3∶1）2或（3∶1）ｎＦ1測交子代基因型種類22２或2n表現(xiàn)型種類222或2n表現(xiàn)型比1∶1（１∶１)n規(guī)律總結(jié)①兩定律均發(fā)生于減數(shù)第一次分裂后期，同時發(fā)生，同時發(fā)揮作用。②非同源染色體上的非等位基因的自由組合是在同源染色體分離的基礎(chǔ)上進行的,基因的分離定律是自由組合定律的基礎(chǔ)。③兩定律均發(fā)生在真核生物有性生殖過程，是核基因的遺傳規(guī)律.基因工程原理內(nèi)容提要基因工程又稱基因操作、重組DNＡ技術(shù)，是P.Ｂerg等于１9７2年創(chuàng)建的。基因工程技術(shù)涉及的基本過程包括“切、連、轉(zhuǎn)、選”.該技術(shù)有兩個基本的特點∶分子水平上的操作和細(xì)胞水平上的表達.基因工程中使用多種工具酶,包括限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和其他一些參與DNA合成與修飾的酶類。限制性內(nèi)切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶,屬于水解酶類。根據(jù)限制性內(nèi)切核酸酶的作用特點，被分為三大類.Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶是基因工程中最常用的酶，該類酶的分子量小,專一性強,切割的方式有平切和交錯切，作用時需要Mg＋＋作輔助因子,但不需要ATP和SAM。第一個被分離的Ⅱ類酶是HｉndⅡ。連接酶是一類用于核酸分子連接形成磷酸二酯鍵的核酸酶,有DNA連接酶和RＮA連接酶之分?；蚬こ讨惺褂玫倪B接酶來自于原核生物,有兩種類型的ＤNA連接酶∶E．coｌiDNＡ連接酶和Ｔ4－ＤNA連接酶?；蚬こ讨惺褂玫闹饕荰4DNA連接酶，它是從T4噬菌體感染的E．cｏli中分離的一種單鏈多肽酶，既能進行粘性末端連接又能進行平末端連接。載體是能將分離或合成的基因?qū)爰?xì)胞的DNA分子，有三種主要類型∶質(zhì)粒ＤNA、病毒DNA、科斯質(zhì)粒，在這三種類型的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的目的，出現(xiàn)了各種類型的改造載體。DＮA重組連接的方法大致分為四種：粘性末端連接、平末端連接、同聚物接尾連接、接頭連接法.粘性末端連接法是最常用的DNA連接方法，是指具有相同粘性末端的兩個雙鏈ＤNA分子在DNＡ連接酶的作用下,連接成為一個雜合雙鏈DNA。平末端連接是指在T４DNA連接酶的作用下,將兩個具有平末端的雙鏈ＤNA分子連接成雜種DNA分子。同聚物加尾連接就是利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工粘性末端，外源DＮA和載體DＮA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸，如dＡ（dG）和dT(ｄC）,然后在ＤNA連接酶的作用下，連接成為重組的DＮA。這種方法可適用于任何來源的DNA片段，但方法較繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用。將人工合成的或來源于現(xiàn)有質(zhì)粒的一小段DNA分子(在這一小段DNA分子上有某種限制性內(nèi)切酶的識別序列)，加到載體或外源ＤNA的分子上，然后通過酶切制造黏性末端的方法稱為接頭連接法?；蛭膸旆譃榛蚪M文庫、cDNA文庫等,是指在一種載體群體中,隨機地收集著某一生物DNA的各種克隆片段，理想地包含著該物種的全部遺傳信息。DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后,必須導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀,這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組ＤＮA分子的轉(zhuǎn)化。目前常用的誘導(dǎo)感受態(tài)轉(zhuǎn)化的方法是ＣａCl２法(圖３－20），此外也可以用基因槍等方法轉(zhuǎn)化外源ＤＮA。重組體篩選有遺傳學(xué)方法、核酸雜交篩選法等.基因工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，目前在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療中已經(jīng)顯示了巨大的應(yīng)用前景,并形成了一大批生物技術(shù)產(chǎn)業(yè).基因工程是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因（DNA分子)，按預(yù)先設(shè)計的藍圖,在體外構(gòu)建雜種ＤＮA分子,然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品;或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能，揭示生命活動規(guī)律。基因工程技術(shù)誕生于２0世紀(jì)７０年代初，它是一門嶄新的生物技術(shù)科學(xué)，它的創(chuàng)立和發(fā)展使生命科學(xué)產(chǎn)生了一次重大飛躍,證明并實現(xiàn)了基因的可操作性，使人類從簡單地利用天然生物資源走向定向改造和創(chuàng)造具有新品質(zhì)的生物資源的時代.基因工程技術(shù)誕生至今已經(jīng)取得了輝煌的成就，成為當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最有生命力和最引人注目的前沿學(xué)科之一,基因工程也是當(dāng)今新的產(chǎn)業(yè)革命的一個重要組成部分。第一節(jié)基因工程技術(shù)的誕生基因工程又稱基因操作（geｎemａniｐｕlatｉｏn），重組DＮA（rｅcomｂinａntDNＡ）技術(shù)，是70年代發(fā)展起來的遺傳學(xué)的一個分支學(xué)科。一、基因工程技術(shù)的誕生1972年，P.。Berg等在PＮAS上發(fā)表了題為∶“將新的遺傳信息插入SV40病毒DNA的生物化學(xué)方法:含有λ噬菌體基因和E.cｏli半乳糖操縱子的環(huán)狀SV４0DＮＡ”，標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。ＳV40病毒是猿猴病毒,是一種直徑為４50的球形病毒,分子量為２8×１06道爾頓。ＳV40的DNA是環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，全長５24３個堿基對，編碼三個衣殼蛋白VＰ1、VP2、VP3和一個T抗原。SＶ40DNA上有一個限制性內(nèi)切酶Ｅ.cｏRⅠ的切點.Berｇ等首先用化學(xué)方法構(gòu)建了一個二聚體的環(huán)狀SV40DNA（圖３—１）。圖３—1重組的SV４0二聚體的構(gòu)建（引自Berget.aｌ，1972）當(dāng)時所用的連接方法是同聚物譜尾法，重組體的鑒定主要是通過電子顯微鏡比較分子量大小.當(dāng)獲得二聚體SV40DNA后,Ｂerｇ等就證明了環(huán)狀DNＡ被內(nèi)切酶切成線性DNA后能夠重新環(huán)化，并且能夠同另外的分子重組。于是他們進行第二步的實驗就是從λｄvgalDＮＡ中制備含有E．coli的半乳糖操縱子DNＡ，用上述同樣的方法進行重組連接，并獲得成功.Bｅｒg等的工作是人類第一次在體外給遺傳物質(zhì)動手術(shù)，標(biāo)志著一個新時代的到來,為此他獲得了１98０年諾貝爾化學(xué)獎.二、基因操作的基本過程和特點基因工程的操作可用圖3-2表示∶圖３-２基因工程的基本過程（引自O(shè)ｌd＆Primrｏse,1９80）它所涉及的過程可用“分（合成)、切、連、轉(zhuǎn)、選、鑒”六個字表示。分(合成)∶指DNA的制備，包括從生物體中分離或人工合成。分離制備或合成制備DNA的方法都有很多種。切∶即在體外將DＮA進行切割,使之片段化或線性化。連∶即在體外將不同來源的ＤNA分子重新連接起來,構(gòu)建重組ＤNA分子.轉(zhuǎn)∶即將重組連接的DＮA分子通過一定的方法重新送入或細(xì)胞中進行擴增和表達.選∶從轉(zhuǎn)化的全群體中將所需要的目的克隆挑選出來；鑒∶就是進行對篩選出來的重組體進行鑒定,因為有些重組體并非是所需要的,必需通過分析鑒定.基因工程有兩個基本的特點∶分子水平上的操作和細(xì)胞水平上的表達。遺傳重組是生物進化的推動力，自然界中發(fā)生的遺傳重組主要是靠有性生殖。基因工程技術(shù)的誕生使人們能夠在試管里進行分子水平上的操作,構(gòu)建在生物體內(nèi)難以進行的重組,然后將重組的遺傳物質(zhì)引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞,讓其在宿主細(xì)胞中進行工作。這實際上是進行無性繁殖,即克隆，所以基因工程通常有稱為基因克隆。第二節(jié)限制性內(nèi)切核酸酶外科醫(yī)生給患者動手術(shù)需要手術(shù)刀，基因工程師們給ＤＮA分子(基因)動手術(shù)需要分子手術(shù)刀，這就是工具酶?；蚬こ讨惺褂玫墓ぞ呙负芏?包括限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和其他一些參與DＮA合成與修飾的酶類，最重要的是限制性內(nèi)切核酸酶?；蚬こ躺习涯切┚哂凶R別雙鏈DＮA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割ＤNＡ雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切核酸酶。一、限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)1９5２年Luria、Human在T偶數(shù)噬菌體、１９５3年ｗｅigle、Bertanｉ在λ噬菌體對大腸桿菌的感染實驗中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的限制和修飾現(xiàn)象。正是對限制和修飾現(xiàn)象的深入研究,導(dǎo)致限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)。噬菌體在某一特定細(xì)菌宿主中生長的能力,取決于它最終在其中繁殖的細(xì)菌是什么菌株。例如,將A噬菌體從一株大腸桿菌轉(zhuǎn)移到另外一株，其生長效率往往會削弱，對這兩個菌株的滴定度可差好幾個數(shù)量級。第二個菌株釋放的噬菌體能百分之百再感染同類菌株，但是若先將它們感染原來的宿主菌,再將釋放的子代噬菌體重新感染第二個菌株時,感染率要大大下降。此種現(xiàn)象即為宿主控制的限制作用（host-Contrｏllｅdｒestrictioｎ）。用放射性同位素標(biāo)記的噬菌體進行的實驗結(jié)果表明，在受感染的宿主細(xì)胞中,噬菌體生長的限制伴有噬菌體DNA的迅速降解，然而，用作繁殖噬菌體的感染宿主菌株并不導(dǎo)致類似的噬菌體DNＡ的降解.如果某一細(xì)菌細(xì)胞具有一種能選擇性降解來自侵染病毒（或其他來源)的核酸酶，那么，它必須能將這種外來DNA同它自己的DNA區(qū)分開來,之所以能夠如此，乃是通過稍為宿主控制的修飾作用（ｈoｓｔ—cｏnｔrolｌedmoｄificatiｏｎ）。因此，限制（resｔrictiｏn)作用是指細(xì)菌的限制性核酸酶對DNＡ的分解作用，限制一般是指對外源DNA侵入的限制.修飾(modiｆiｃatｉon）作用是指細(xì)菌的修飾酶對于DNA堿基結(jié)構(gòu)改變的作用（如甲基化),經(jīng)修飾酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。到20世紀(jì)60年代中期，科學(xué)家推測細(xì)菌中有限制－修飾系統(tǒng)(restｒictioｎ—ｍｏdifｉｃatioｎsystｅm。Ｒ—Msyｓｔem)。該系統(tǒng)中有作用于同一DＮA的兩種酶，即分解DNA的限制酶和改變DＮA堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的修飾酶，而且，這兩種酶作用于同一DNA的相同部位。一般說來，不同種的細(xì)菌或不同種的細(xì)菌菌株具有不同的限制酶和修飾酶組成的限制—修飾系統(tǒng)。1968年，Meseｌｓon從E．colｉＫ株中分離出了第一個限制酶EcoK，同年Ｌｉnn和Aeber從E。cｏliB株中分離到限制酶ＥcｏB.遺憾的是，由于EcoK和ＥcoB這兩種酶的識別和切割位點不夠?qū)Ｒ?在基因工程中意義不大。１970年,Sｍitｈ和Wiｌcｏｘ從流感嗜血桿菌中分離到一種限制性酶，能夠特異性地切割DNＡ，這個酶后來命名為HｉnｄⅡ，這是第一個分離到的Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶.由于這類酶的識別序列和切割位點特異性很強，對于分離特定的DＮＡ片段就具有特別的意義.二、限制性內(nèi)切核酸酶的命名和分類（一)限制性內(nèi)切核酸酶的命名按照國際命名法,限制性內(nèi)切核酸酶屬于水解酶類。由于限制性酶的數(shù)量眾多,而且越來越多,并且在同一種菌中發(fā)現(xiàn)幾種酶。為了避免混淆，1973年Ｓmｉtｈ和Nａt(yī)haｎs對內(nèi)切酶的命名提出建議,1９８0年，Ｒobｅｒｔs對限制性酶的命名進行分類和系統(tǒng)化。限制性酶采用三字母的命名原則，即屬名+種名+株名的個一個首字母，再加上序號,將限制性內(nèi)切核酸酶的命名要點列于表3-１。表3—1限制性內(nèi)切核酸酶的命名要點條目要點基本原則３—4個字母組成,方式是：屬名+種名+株名+序號首字母取屬名的第一個字母，且大寫第二字母取種名的第一個字母，小寫第三字母①取種名的第二個字母,小寫;②若種名有詞頭,且已命名過內(nèi)切酶，則取詞頭后的第一字母代替第四字母若有株名,株名則作為第四字母,是否大小寫,根據(jù)原來的情況而定順序號若在同一菌株中分離了幾個限制性內(nèi)切核酸酶，則按先后順序冠以Ｉ、ＩＩ、IＩI,....。等如：EcｏＫ：Ｅsｃherichiacoli

Ｋ（大腸桿菌K株）（二)限制性內(nèi)切核酸酶的分類限制性內(nèi)切核酸酶的作用特點，將它們分為三大類。１.I類限制性內(nèi)切核酸酶I類限制性內(nèi)切核酸酶的分子量較大，一般在３0萬道爾頓以上，通常由三個不同的亞基所組成。例如限制性酶EcoB是由R（135kD),M(6２ｋD）和S（55ｋD)三種亞基組成的復(fù)合酶,這三個亞基分別由不同的基因編碼。全酶的總分子量為4４9ｋＤ,共5個亞基，其中Ｒ亞基和M亞基各兩分子。Ⅰ類酶不僅是一種核酸內(nèi)切酶,同時在酶分子上還具有甲基化酶和ATPａse的活性，所以是具有多種酶活性的復(fù)合酶類.作用時除了需要Mg++作輔助因子外，還要求ATP和Ｓ腺苷甲硫氨酸（ＳAＭ）的存在。Ⅰ類酶具有特異的識別序列，大約１5個堿基對。Ⅰ類酶雖然能夠在一定序列上識別ＤＮA分子，并能同DＮA分子作用，因其識別DＮA后,要朝一個方向或兩個方向移動一段距離(通常為10０0個堿基左右），并且要形成一個環(huán)才能切割DNA(圖３—3)，所以識別位點和切割位點不一致,產(chǎn)生的片段較大.圖3－３I類酶的作用方式（引自Lｅwin，1９97)２．Ⅲ類限制性內(nèi)切核酸酶Ⅲ類限制性內(nèi)切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亞基組成類似于Ⅰ類酶,作用方式基本同Ⅱ類酶。如EcoＰ1是由兩個亞基組成，一個亞基（Ｍ亞基）負(fù)責(zé)位點識別和修飾。另一個亞基(Ｒ亞基)具有核酸酶的活性(圖３—5)。切割DＮA時需要ATＰ,Mg2+,也能被ＳAM激活,但并非必需。圖3-４Ⅲ類限制性內(nèi)切核酸酶（引自Ｌewin,1997)3。Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶這類酶的分子量較小.一般在2—４萬道爾頓，通常由2—４個相同的亞基所組成。它們的作用底物為雙鏈DNA,極少數(shù)Ⅱ類酶也可作用于單鏈DNＡ,或DNA/RNA雜種雙鏈。這類酶的專一性強,它不僅對酶切點鄰近的兩個堿基有嚴(yán)格要求，而且對更遠的堿基也有要求，因此,Ⅱ類酶既具有切割位點的專一性，也具有識別位點的專一性，一般在識別序列內(nèi)切割.切割的方式有平切和交錯切，產(chǎn)生平末端的ＤＮＡ片段或具有突出粘性末端的DNＡ片段（５'或３’粘性末端).作用時需要Mg+＋作輔助因子，但不需要AＴＰ和SAM.Ⅱ類酶與對應(yīng)的甲基化酶在蛋白亞基上尚未發(fā)現(xiàn)有什么關(guān)系，第一個被分離的Ⅱ類酶是HiｎdⅡ。三。Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶的性質(zhì)1。識別序列的特異性在３類限制性內(nèi)切核酸酶中，Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶的特異性最強。大多數(shù)Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶識別的序列是回文序列。如ＢamHＩ和BglI都是識別六個堿基的ＤNA序列(圖3—5）,都是完全的回文序列。這段序列有兩個基本的特征,第一是能夠中在間劃一個對稱軸,兩側(cè)的序列兩兩對稱互補配對，第二個特點是兩條互補鏈的5'到3'的序列組成相同，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180０，則兩條鏈重疊。圖３—5Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶識別的回文序列(引自D．Ｖoet＆VoｔｅJ．G.1995)2．限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率與速度切割頻率是指限制性內(nèi)切核酸酶在某DNA分子中預(yù)測的切點數(shù)。由于ＤNA是由四種類型的單核苷酸組成，假定DＮA的堿基組成是均以的，而限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點是隨機分布的,那么對于任何一種限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率,理論上應(yīng)為１/４ｎ，n表示該限制性內(nèi)切核酸酶識別的堿基數(shù)。如識別4個堿基的限制性內(nèi)切核酸酶，其切割頻率應(yīng)為每256個堿基有一個識別序列和切點（１/44=1/2５６)，識別5個堿基的限制性內(nèi)切核酸酶，其切割頻率應(yīng)為每1０24個堿基有一個識別序列和切點，余下類推。實際上因DＮA的分布是不均一的,且有大量的重復(fù)序列,加上內(nèi)切酶的切點具有GC傾向，所以實際的頻率偏低.如同是識別6個堿基的限制性內(nèi)切核酸酶，切割的頻率相差很大∶EcoRI4０00；BaｍＨI：6０00；SalI:8０00;HpａＩI:200.根據(jù)限制性內(nèi)切酶切割DNA所產(chǎn)生的產(chǎn)物末端,發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶對DNA的切割有兩種方式,即平切和交錯切。所謂平切，就是限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈的相同位置切割DNＡ分子,這樣產(chǎn)生的末端就是平末端.交錯切就是限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈的不同位置切割DNＡ，產(chǎn)生的ＤNA片段的末端不是平齊的(圖３—６）。圖3-６平末端與黏性末端（Ｈarｔl,1991）Ⅱ類限制性內(nèi)切酶的切割產(chǎn)物有平末端和粘性末端(ｃohesiveend)。粘性末端是指DＮＡ分子的兩端具有彼此互補的一段突出的單鏈部分,這一小段單鏈部分和同一分子的另一端或其它分子末端的單鏈部分如果互補的話，則能通過互補堿基之間的配對，形成雙鏈.并在DNA連接酶的作用下,使同一DNA分子的兩端連接成環(huán)狀,或使兩個分子連成一大的線狀分子.不同限制性內(nèi)切酶切割DNＡ產(chǎn)生的三種不同類型的末端（表3－３）.表3-3某些限制性內(nèi)切酶及產(chǎn)生的末端５'-粘性末端3’粘性末端平末端酶識別序列酶識別序列酶識別序列TaqＩT/CＧAＰｓtICTGCA／GＡluIＡG/CTＣlａIAT/CGATSacIGＡGCT/CFnuDⅡCG/CＧMboI／ＧATＣSpｈIGＣATG/CＤpnIＧＡ／TＣBglⅡA/GＡTCＴBｄeIＧＧCGC/CＨaeⅢGG/CCBaｍHＩG/GAＴCＣApaＩＧGGCC/CPvuⅡCAG/CＴGBclIT/GATCAKpnIGＧTＡC/CＳmaＩCCC/GＧＣＨindⅢＡ／AGCＴT

NaｅIＧCＣ/GGCNcｏIＣ/ＣATGG

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ＥcoRⅤＧAT/ＡＴC基因的分子手術(shù)是相當(dāng)復(fù)雜的過程，除了需要限制性內(nèi)切酶外,還需要其他一些工具酶包括連接酶、ＤＮＡ聚合酶、ＲNA聚合酶、核酸酶、末端修飾酶等，對DＮA或RＮA進行各種各樣的修飾。其中最重要的是連接酶。第三節(jié)基因工程載體載體（vectｏr,ｖehiｃｌe)的本意就是媒介體,基因工程上的載體是能將分離或合成的基因?qū)爰?xì)胞的DＮA分子,稱為克隆載體?；蚬こ讨杏腥N主要類型的載體∶質(zhì)粒DNA、病毒DＮＡ、科斯質(zhì)粒，其中質(zhì)粒DNＡ是最常用的載體,但運載能力低，柯斯質(zhì)粒是質(zhì)粒和λ噬菌體ＤNA的結(jié)合體，運載能力最高（圖３—7）.在這三種類型的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的目的,出現(xiàn)了各種類型的改造載體.圖３-７三種類型的載體（引自Ｇｒeenｅ，１9９８）一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasｍiｄ）是染色體以外的遺傳物質(zhì)，它是雙鏈閉合環(huán)狀ＤＮA分子，其大小可從１kb到200kb左右，能夠在宿主內(nèi)利用宿主的酶系統(tǒng)進行復(fù)制。質(zhì)粒是基因工程的主要載體。（一）質(zhì)粒概念１９46—194７年間，Lederｂerｇ和Ｔatuｍ發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的接合現(xiàn)象,這是細(xì)菌的有性繁殖方式。此后不久，便弄清了這種接合是兩種不同的交配型(接合型）,遺傳信息總是從供體（雄性）轉(zhuǎn)移到受體(雌性）。當(dāng)兩種不同的交配型的細(xì)菌相互識別和接合以后，雄性細(xì)胞的致育因子，通過細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)傳遞到雌性細(xì)胞,這種致育因子后來稱為Ｆ因子。1952年，Lｅderberｇ指出，細(xì)菌的F因子與高等生物細(xì)胞質(zhì)中染色體外的遺傳單元極為相似，并正式提出了“質(zhì)?！边@一名稱，以區(qū)別于染色體的遺傳單元.一般來講，質(zhì)粒是細(xì)胞中能夠獨立復(fù)制的復(fù)制子，并在細(xì)胞分裂時能穩(wěn)定傳遞給子代細(xì)胞。雖然質(zhì)粒對細(xì)胞的生存沒有影響，但質(zhì)粒ＤNA上也有一些編碼基因，賦予宿主細(xì)胞一些特性.自發(fā)現(xiàn)能賦予細(xì)菌性別特征的F因子以后,又在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種能夠編碼抗菌物質(zhì)-—大腸桿菌素的Col質(zhì)粒，包括CｏｌB，ＣolV,ColE等。由這些因子產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)稱細(xì)菌素（bacｌeｒiocｉn）,是細(xì)菌所合成的一種蛋白質(zhì),對于同種或近緣種具有毒性。合成細(xì)菌素的能力和對于細(xì)菌素的抗性，都由染色體外的遺傳因子所控制。在1９５9一1960年間,日本科學(xué)家在研究用強效抗生素治療菌痢患者時,發(fā)現(xiàn)病原菌志賀氏菌含有使其同時能抗幾種抗生素的基因，而且,這種抗藥性基因能以和Ｆ因子非常相似的方式轉(zhuǎn)移給其他腸道細(xì)菌,這就是抗藥因子（Ｒ因子）.抗藥因子（ｒesｉｓtanｃefactoｒ)實際上是控制細(xì)菌抗藥性的一種質(zhì)粒，能在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，由抗藥性轉(zhuǎn)移因子和抗藥性基因兩部分組成。每個抗藥因子上常具有幾個抗藥性基因。（二）質(zhì)粒DNA的基本性質(zhì)大多數(shù)質(zhì)粒ＤNＡ是是環(huán)狀雙鏈的DNA分子。如果兩條鏈都是完整的環(huán)，這種質(zhì)粒ＤNA分子稱為共價閉合環(huán)狀DNA(ｃｏvalentlｙclosｅｄcircuｌar,CＣCDNA）。CCCDNA有兩種構(gòu)型,超螺旋DNＡ(sｕpｅrcoｌｉedＤNA，SCDNＡ)和松弛的DNA(RelａxedDNA），分別是由ＤNA促旋酶(DNAｇyｒasｅ)和拓樸異構(gòu)酶（topoisoｍerase）作用的結(jié)果。如果質(zhì)粒DNA中有一條鏈?zhǔn)遣煌暾?，那么這種DNA分子就稱為開環(huán)的（opeｎｃircleｓ，OCＤNA），開環(huán)的ＤＮＡ通常是由內(nèi)切酶或機械剪切造成的圖3—8).從細(xì)胞中分離質(zhì)粒DＮA時，質(zhì)粒DNＡ常常會轉(zhuǎn)變成超螺旋的構(gòu)型。圖３—8質(zhì)粒ＤNA的三種構(gòu)型(引自O(shè)ld＆Ｐrimrose,1９８0)溴化乙啶（etｈｉdiumｂromide,EtBｒ）是一種扁平的分子，能夠插入到DNＡ分子的堿基對之間，引起雙螺旋的部分解旋，從而改變了DNA的體積和密度。圖3—９相對分子質(zhì)量相同構(gòu)型不同的質(zhì)粒DNＡ的瓊脂糖凝膠電泳（引自O(shè)ld&Primrosｅ，1980)由于不同構(gòu)型的ＤNA插入EB的量不同，它們在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率也不同,CCＣDNA的泳動速度最快，ＯＣDNA泳動速度最慢，LDNA居中(圖3-9）,所以很容易通過凝膠電泳和EB染色的方法將不同構(gòu)型的DNＡ分別開來。（三）質(zhì)粒分類根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為松弛型質(zhì)粒和嚴(yán)緊型質(zhì)粒。質(zhì)粒拷貝數(shù)(ｐｌasmidcopｙｎumbｅｒs)是指細(xì)胞中單一質(zhì)粒的份數(shù)同染色體數(shù)之比值,常用質(zhì)粒數(shù)/每染色體來表示。不同的質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)不同,?松弛型質(zhì)粒（ｒｅlaxｅｄplasmid）的復(fù)制只受本身的遺傳結(jié)構(gòu)的控制，而不受染色體復(fù)制機制的制約,因而有較多的拷貝數(shù).通常可達10—15個/每染色體。并且可以在氯霉素作用下進行擴增，有的質(zhì)粒擴增后,可達到3００0/每染色體(ColE１，可由24個達到1000至3０00個）。這類質(zhì)粒多半是分子量較小，不具傳遞能力的質(zhì)粒?；蚬こ讨惺褂玫亩嗍撬沙谛唾|(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒(strinｇeｎｔplａｓｍiｄ)在寄主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制除了受本身的復(fù)制機構(gòu)的控制外,還受染色體的嚴(yán)緊控制，因此拷貝數(shù)較少,一般只有1-２個/每染色體。這種質(zhì)粒一般不能用氯霉素進行擴增。嚴(yán)緊型質(zhì)粒多數(shù)是具有自我傳遞能力的大質(zhì)粒.質(zhì)粒的復(fù)制特性是受復(fù)制子控制的.基因工程中使用的質(zhì)粒多數(shù)是松弛性質(zhì)粒載體。(四)載體的條件就克隆一個基因（DＮA片段)來說,最簡單的質(zhì)粒載體也必需包括三個部分（圖３-10)∶復(fù)制區(qū)，含有復(fù)制起點;選擇標(biāo)記,主要是抗性基因;克隆位點，便于外源ＤNA的插入.就復(fù)制特性來講，要求載體必需有獨立的復(fù)制起點,最好是松弛型復(fù)制，這樣便于得到大量的拷貝.有時需要有多個復(fù)制起點，能夠在不同的宿主細(xì)胞中復(fù)制,擴大宿主范圍。具有合適的克隆位點,便于外源DNA的插入?？寺∥稽c實際上限制性酶切位點,最好是具有多種限制性內(nèi)切酶的單切點，這樣適應(yīng)性強，克隆方便,如果一種酶在載體上有多個切點，就會限制該切點的使用.具有可檢測的選擇標(biāo)記,也是一個重要的基本條件，這種選擇標(biāo)記最好是能夠賦予宿主易于檢測的表型.選擇標(biāo)記就是常說的報告基因(reporｔgenes），包括抗生素抗性標(biāo)記,以及一些生化表型的標(biāo)記.另外，一個理想的質(zhì)粒載體必需具有低分子量，因為小分子的質(zhì)粒DNＡ易于操作,不容易被損傷，也容易被分離純化。一般說小分子量的質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)比較高，酶切位點也少。圖3-1０質(zhì)粒載體的基本結(jié)構(gòu)二、雜合載體除了質(zhì)粒載體外,噬菌體的ＤNA也可作為載體,不過都是改造過的，自然病毒的ＤNA不能作為載體。目前在基因工程中使用的載體大多是質(zhì)粒和噬菌體的雜合載體。（一)柯斯質(zhì)粒(coｓmid)載體ｃｏsmid是英文cosｓite-ｃａrrｙiｎgplasｍｉd的縮寫，本意是帶有粘性末端位點的質(zhì)粒,因此，柯斯質(zhì)粒是人工建造的的含有λDＮA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體.柯斯質(zhì)粒的構(gòu)建一般都是利用質(zhì)粒的復(fù)制子、選擇標(biāo)記，加上λ的coｓ位點序列及與包裝有關(guān)的序列，構(gòu)建的科斯質(zhì)?？梢院芎玫赜糜诨蚩寺。▓D3—1１）。圖3—11柯斯質(zhì)粒載體克?。ㄒ訪ｏdｉshetal，1９86）早期構(gòu)建的科斯質(zhì)粒載體有一些不足，如克隆位點較少,抗性標(biāo)記單一，容栽能力不大,后來進行了一些改進,克服了這些不足.柯斯質(zhì)粒具有如下特點:具有質(zhì)粒復(fù)制子。目前構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒大多具有pMＢ1復(fù)制子或ColＥ1復(fù)制子，所以進入寄主細(xì)胞后能夠象質(zhì)粒一樣進行復(fù)制,并且能夠被氯霉素擴增。具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記.如果在這些標(biāo)記中有克隆位點的話可用插入失活法進行篩選。例如上面構(gòu)建的MuA—３就具有四環(huán)素抗性基因。具有λ噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。由于柯斯質(zhì)粒具有λDNA的cos位點和相應(yīng)的包裝序列，因此在克隆了適當(dāng)大小的外源ＤＮA以后可以被包裝進入噬菌體蛋白顆粒,并能進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力比純的質(zhì)粒大3個數(shù)量級。進入寄主細(xì)胞后，又可以自我環(huán)化。但它不能同寄主的染色體DNA整合，也不會產(chǎn)生子代噬菌體裂解寄主.溶載能力大。這是柯斯質(zhì)粒的最大優(yōu)點.被克隆的DNＡ大小具有上限和下限，這是因為柯斯質(zhì)粒最后是被包裝到噬菌體顆粒，它的最后大小應(yīng)在噬菌體基因組的75％-105％之間.由于載體分子一般在5kb左右，所以克隆的最大片段在45kb；如果載體的分子量為15kb的話,克隆的最小片段為１9kb。因此柯斯質(zhì)粒適合構(gòu)建真核生物的基因庫，而不適合克隆原核生物的基因。（二）ｐＵC載體系列的構(gòu)建美國加州大學(xué)的Vｉｅｉra和Mｅsｓinｇ利用pＢＲ322和M１３載體的優(yōu)點，構(gòu)建了一個更小的載體,稱為pUC7(圖3-12），并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了pUC載體系列。圖3-12pＵC載體的構(gòu)建(引自Wiｎnａcker，1987)pUC載體具有很多優(yōu)點∶①多克隆位點;②松弛復(fù)制；③有氨芐青酶素抗性;④可通過化學(xué)顯色篩選?，F(xiàn)在最常用的pUC載體是ｐＵＣ1８(圖3-13），它的分子量小，具有多克隆位點和易于選擇的分子標(biāo)記，并且是松弛型復(fù)制,在正常情況下，它的拷貝數(shù)可達上千個,所以不需要用氯霉素進行擴增.圖3—13ｐUC18質(zhì)粒載體圖譜二、基因文庫技術(shù)基因文庫（GeneLｉｂrary)是指在一種載體群體中，隨機地收集著某一生物DNA的各種克隆片段，理想地包含著該物種的全部遺傳信息（圖3—18）.因此，基因文庫是人工構(gòu)建的某一生物基因的“活期儲蓄所”，根據(jù)構(gòu)建方法的不同,分為基因組文庫、ｃDNA文庫等.根據(jù)基因庫的含量,又分為全庫和特異性的庫，全庫含有某一生物的全部遺傳信息，而特異性的庫是不完整的,如差示庫.早期將通過構(gòu)建基因文庫來篩選所需克隆的方法稱為鳥槍法.圖３-18基因文庫技術(shù)（J。J．Greenｅ&RａoV.B．，19９8)第三節(jié)體外重組一、體外重組的方法DNＡ重組連接的方法大致分為四種:粘性末端連接、平末端連接、同聚物接尾連接、接頭連接法。1.粘性末端連接法粘性末端連接（Cohesiｖeenｄｌiｇａt(yī)ion）是指具有相同粘性末端的兩個雙鏈DＮA分子在DNＡ連接酶的作用下，連接成為一個雜合雙鏈DNA（圖3－14）.粘性末端可由識別回文序列的內(nèi)切酶所產(chǎn)生，或是用末端轉(zhuǎn)移酶來制備。凡是識別回文序列的內(nèi)切酶切割ＤNＡ產(chǎn)生的末端都是粘性末端，只有用同一種酶切割產(chǎn)生的相同粘性末端才能通過末端單鏈的堿基配對并在DNA連接酶的作用下進行連接.圖3—14黏性末端連接法(引自Ｓnyｄer＆Ｃhａmｐneｓs，1９７7）粘性末端連接法是最常用的DNA連接方法，酶切片段基本不需作什么處理就可以用于連接,既經(jīng)濟又省時.由于大多數(shù)限制性內(nèi)切酶都可以產(chǎn)生粘性末端，操作方便。另外,通過粘性末端連接的重組體，其外源片段很容易回收，只要用原來的酶切割重組體就可以了.另外，也可以通過雙酶切來獲得黏性末端，并可進行定向重組連接（圖3—1５).圖3-15雙酶切進行定向重組連接（引自Ｓnyｄeｒ＆Chamｐnｅss,１97７)平末端連接(ｂlｕnteｎｄliｇａt(yī)ion)是指在T４DNA連接酶的作用下(可加入適量的ＲＮA連接酶）,將兩個具有平末端的雙鏈DＮA分子連接成雜種DNA分子。平末端連接的效率比粘性末端連接的效率低得多，所以通常在連接反應(yīng)體系中要適量添加促進大分子凝聚的凝聚劑,以提高平末端DNＡ連接的效率.常用的是PEＧ8000，加入后,可以起到兩個作用：一是可將平末端連接的效率提高1－3個數(shù)量級;二是改變連接產(chǎn)物的分布,抑制分子內(nèi)的連接，促進分子間的連接,得到的連接產(chǎn)物主要是重組體。平末端連接的不利之處是連接效率低,需要大量的連接酶，有時為了提高連接效率，通常要補加ＲＮA連接酶。連接后,緣由的限制性內(nèi)切酶內(nèi)切酶的切點要消失,所以不易回收插入的外源ＤNA片段。3.同聚物加尾法所謂同聚物加尾（ｈomopolymertａilsjoｉninｇ)連接就是利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的３＇端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端,外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸,如dＡ(ｄG）和dT（dＣ）,然后在ＤNA連接酶的作用下，連接成為重組的DＮA。這種方法可適用于任何來源的DNA片段，但方法較繁,需要λ核酸外切酶、Ｓ1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用（圖3-16)。同聚物接尾法實際上是一種人工粘性末端連接法,具有很多優(yōu)點：①首先不易自身環(huán)化，這是因為同一種DNA的兩端的尾巴是相同的,所以不存在自身環(huán)化。②因為載體和外源片段的末端是互補的粘性末端，所以連接效率較高。③用任何一種方法制備的ＤNＡ都可以用這種方法進行連接，所以是一種通用的體外重組的方法。圖3－16同聚物尾連接法（引自O(shè)ｌd&Pｒimｒosｅ，1９８0）１．基因組DNＡ文庫所謂基因組文庫(genomｉcDＮAＬibrａry）,就是用基因工程的方法,人工構(gòu)建的含有某一生物基因組ＤNＡ的各種片段的克隆群。一般以改造的噬菌體ＤNA或柯斯質(zhì)粒作為載體，包括下列過程（圖3－19）：①高分子量染色體DNＡ的制備，②體外重組連接,③包裝蛋白的制備，④重組體的體外包裝,⑤將重組DNＡ導(dǎo)入寄主細(xì)胞，⑥篩選。建造基因組文庫不僅可以大量擴增含量極少的單拷貝的結(jié)構(gòu)基因，也可以克隆調(diào)控基因,有利于研究基因的結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控機理?；蚪M文庫同遺傳學(xué)上所講的基因庫是完全不同的概念?；驇欤ǎ纾錸epooｌ)是指在行有性生殖的某一群體中，能進行生殖的個體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構(gòu)建中,由于使用的載體不同,分為噬菌體載體和柯斯質(zhì)粒載體構(gòu)建的基因組文庫、YAC文庫、BAＣ文庫。圖3－1９基因組文庫技術(shù)（引自Grifｆithsetal．１996）2.cＤＮA文庫同mＲNA互補的ＤNA稱為cDNA。mRNＡ為模板合成的cDNA可以用于基因的克隆化,也可用這種方法制備特異性的雜交探針。cＤNA文庫是以某一生物的總mRNA為模板,在無細(xì)胞系統(tǒng)中，在反向轉(zhuǎn)錄酶的作用下，首先合成一互補的ＤNA,即第一鏈,破壞RＭＡ模板后,再以第一鏈為模板合成第二鏈,得到的雙鏈DＮA稱為ｃDNA基因.選用適合的載體,將合成的ｃDNA基因重組導(dǎo)入寄主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到的ｃＤNA基因的克隆群稱為ｃDNA文庫(cｏｍpletｅmｅntDNALiｂｒaｒy)(圖3－20).由于cDNA技術(shù)合成的是不含內(nèi)含子的功能基因,因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。圖3-２0cDNA文庫構(gòu)建(引自O(shè)lｄ＆Priｍrose,1９80)由于細(xì)胞內(nèi)的基因在表達的時間上并非是統(tǒng)一的,具有發(fā)育的階段性和時間性，有些則需要特殊的環(huán)境條件。所以，cDNＡ文庫是不可能構(gòu)建得十分全,也就是說任何一個cＤNA文庫都不可能包含某一生物全部編碼基因。所以在構(gòu)建cＤNA文庫時應(yīng)根據(jù)研究目的的不同而選用不同的生物材料作為RNA分離的出發(fā)材料，有些甚至要經(jīng)過特殊的誘導(dǎo)處理以提高所需DNA的豐度.第五節(jié)重組DNA的轉(zhuǎn)移、篩選與鑒定轉(zhuǎn)化是基因工程操作中一項十分重要的工作。DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后,必須導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀,這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DＮＡ分子的轉(zhuǎn)化（tranｓformaｔioｎ)。重組體的篩選有兩層涵義,一是將攜帶有外源插入DNA片段的克隆挑選出來,二是將將攜帶有特定外源插入片段的重組體挑選出來。鑒定則是對篩選的重組體進行最后的鑒別.一、重組DＮＡ的轉(zhuǎn)化能夠接受轉(zhuǎn)化作用的細(xì)菌的生理狀態(tài)叫感受態(tài).細(xì)菌的感受態(tài)是在適當(dāng)?shù)纳L條件下獲得的一種生理特征。要強調(diào)的是：感受態(tài)是有關(guān)轉(zhuǎn)化因子被吸收的生理狀態(tài)，而不是有關(guān)轉(zhuǎn)化因子進入細(xì)胞后能否被接受的生理狀態(tài).處于感受態(tài)的受體細(xì)菌，其吸收轉(zhuǎn)化因子的能力為一般細(xì)菌生理狀態(tài)的千倍以上，而且不同細(xì)菌間的感受態(tài)差異往往受自身的遺傳特性、菌齡、生理培養(yǎng)條件等諸多因素的影響。在自然條件下，大多數(shù)類型的細(xì)菌不出現(xiàn)感受態(tài)，也不發(fā)生轉(zhuǎn)化。然而可以通過某些化學(xué)誘導(dǎo)的方法來制備感受態(tài),用這種方法得到的感受態(tài)就稱為人工誘導(dǎo)的感受態(tài)細(xì)胞。目前常用的誘導(dǎo)感受態(tài)轉(zhuǎn)化的方法是CａCl2法(圖3-２1)，此外也可以用基因槍等方法轉(zhuǎn)化外源DＮＡ.圖3－２1鈣誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化二、重組體的遺傳學(xué)篩選法所謂遺傳學(xué)方法(genｅticseｌｅcｔion)主要是根據(jù)受體細(xì)胞接受了重組DNA分子后所發(fā)生的遺傳表型的變化直接選擇重組體的方法。遺傳表型的變化包括抗藥性、缺陷基因的功能互補表型及噬菌斑的變化等.這些表型的變化,有些是載體提供的表型特征，有些則是插入序列提供的表型特征。選擇的方法主要是根據(jù)平板上可見的表型變化,用于選擇的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表達抗生素平板、顯色平板等,由于這些方法都是直接從平板上篩選，所以又稱為平板篩選法。(一）插入失活篩選法從原理上講，當(dāng)外源基因（或DNA片段）插入到某一基因內(nèi)的位點后，使這個基因喪失了原有的功能叫插入失活(insｅrtiｏnaｌｉnactivａt(yī)iｏn)。圖3－２2插入失活的原理圖3－23聚合酶鏈反應(yīng)（引自Watsonetal,1９9２)1.抗性基因插入失活篩選法根據(jù)抗生素抗性基因插入失活原理而設(shè)計的插入失活法是重組體常用的篩選方法。如非重組的ｐB(yǎng)R322質(zhì)粒DNA上的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因都是正常的，表型為AprTcr。帶有這種質(zhì)粒的受體菌可以在加有四環(huán)素和氨芐青霉素的雙抗性平板上生長。但是,如果在該質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因內(nèi)插入外援片段，就會造成四環(huán)素抗性基因失活,變成AprTcs,攜帶這種質(zhì)粒的宿主菌可以在氨芐青霉素的平板上生長，而不能在四環(huán)素抗性平板上生長(圖３－２２)。2。藍白斑篩選法根據(jù)抗生素抗性基因插入失活原理而設(shè)計的插入失活法需要進行菌落平板的影印復(fù)制,才能夠?qū)⑺璧闹亟M體挑選出來，大大增加了篩選的工作量.后來，人們設(shè)計了以β—半乳糖苷酶的產(chǎn)生作為顏色篩選標(biāo)記的載體,簡化了篩選程序，提高了靈敏度。這類載體系統(tǒng)包括M13噬菌體、ｐUC質(zhì)粒系統(tǒng)、pEGＭ質(zhì)粒系統(tǒng).它們的共同特點是載體上攜帶一段細(xì)菌的ｌaｃＺ基因，它編碼β-半乳糖苷酶的一段1４６個氨基酸的α—肽,載體轉(zhuǎn)化的受體菌為lａｃZΔM15基因型。這樣,載體同宿主通過互補,具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在載體的lacZ基因中插入外源DＮＡ，造成laｃZ基因失活,不能合成α-肽,失去同宿主的互補，不能形成有功能的β－半乳糖苷酶,失去分解Ｘ—ｇaｌ的能力。在X—gal平板上，含陽性重組體的細(xì)菌為物色菌落（質(zhì)粒載體）或無色噬菌斑(M１3噬菌體載體）;非重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌為藍色菌落或藍色噬菌斑。顯色反應(yīng)篩選方法比較簡單,但是β－半乳糖苷酶的合成需要誘導(dǎo)。實驗中起誘導(dǎo)作用的是安慰誘導(dǎo)物－-IPTG（異丙基硫代—β－D-半乳糖苷),作用底物是Ｘ－gaｌ（5-溴—4－氯－3－吲哚-β-D-半乳糖苷)。通常是將Ｘ－gａl和IPTG混合后,涂布在固體平板的表面。(二）PCＲ法聚合酶鏈反應(yīng)（poｌymerasｅchainｒeactｉon,PCR）是一種體外擴增特定DＮA序列的新技術(shù)，這種ＤNA的體外擴增是通過同DNＡ雙鏈互補的兩個引物在DNA聚合酶的作用下，進行引物延伸來完成的。在反應(yīng)系統(tǒng)中，需要有：①模板（含有特定序列的DNA分子)。②兩個寡聚核苷酸引物，這兩個引物可同雙鏈DNA分子的互補鏈雜交，并且位于靶DＮA欲擴增區(qū)的兩側(cè)。③耐熱DNA聚合酶。④4種脫氧核糖單核苷酸.然后經(jīng)過不同溫度的循環(huán)進行ＤNA擴增（圖3—23）.這一技術(shù)是KaryMulｌis在1985年發(fā)明的，并于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。ＰCR應(yīng)用十分廣泛，并且可通過菌液PｃR進行重組克隆的快速篩選?；痉椒ㄊ菑目剐云桨迳咸羧尉浣臃N至25０μL的ＬB培養(yǎng)基中,20０ｒ／miｎ振蕩培養(yǎng)8h以后，取1μL菌液進行裂解制備模板進行PCR篩選。（三）核酸雜交篩選法核酸雜交又叫分子雜交（moleculａｒｈybridｉｚａt(yī)ion)，是鑒定和篩選重組體的一種方法。原理是：兩條具有堿基互補序列的ＤNＡ分子變性后，在溶液中一起進行復(fù)性時,可以形成雜種雙鏈ＤNA分子。同樣,一條DNＡ鏈與之具有互補堿基序列的RＮA鏈在一起復(fù)性時，也能形成雙鏈結(jié)構(gòu)（DＮA－RNA雜交體）。雜交包括下列過程:①DNA的“熔解”,即變性,目的是使雙螺旋解開成為單鏈,這可將DNA溶液的溫度升高超過Tm值(解鏈溫度）即可；②退火，即DNA的復(fù)性，將加熱過的ＤNA溶液緩慢冷卻即可發(fā)生。雜交的雙方是待測的核苷酸序列及探針.待測核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未經(jīng)克隆的基因組DNA或是細(xì)胞總ＲNA。核酸雜交方法的兩個特點是高度特異性及高度靈敏性.1．菌落雜交在大量篩選重組的細(xì)菌細(xì)胞時,需要從中尋找出為數(shù)極少的含有目的序列的細(xì)胞。另外。在利用插入失活、顯色反應(yīng)等手段得到含重組質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞后，還需要證明這些重組質(zhì)粒是否含所需要的目的序列。若將所得菌落逐個擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒ＤＮA，然后用Ｓｏuthern雜交法固然可以鑒定重組質(zhì)粒，不僅工作量大，又耗費財力,用菌落雜交（colonyhybridizatioｎ)（圖3—24)，就方便得多。首先要將轉(zhuǎn)化的受體菌在合適的瓊脂平板上制成單菌落，然后將菌落復(fù)制到硝酸纖維素濾膜上,保留主平板，將硝酸纖維素濾膜上的菌落進行原位溶菌、原位釋放ＤＮA、原位進行ＤNA變性、中和洗滌后進行原位固定。然后同特異的探針進行雜交，通過放射自顯影后,有雜交信號的即為重組體，對照主平板則可將重組體選擇出來.圖３—24菌落雜交的基本過程（引自O(shè)lｄ＆Primrose，１9８0)2.Sｏuｔｈern雜交Sｏuｔｈerｎ雜交（Soｕtherｎｈybrｉｄizaｔion）是1975年Southｅrn建立起來的一種雜交方法，屬固相-液相雜交。該法的主要特點是利用可毛細(xì)現(xiàn)象將ＤNＡ轉(zhuǎn)移到固體支持物上,稱為Soｕtheｒn轉(zhuǎn)移或Souｔhern印跡（Ｓｏｕtｈernｂlottinｇ）。它首先用合適的限制性內(nèi)切酶將DNA切割后，進行電泳分離后，利用干燥的吸水紙產(chǎn)生毛細(xì)作用，使液體經(jīng)過凝膠,從而使DNA片段由液流攜帶而從凝膠轉(zhuǎn)移并結(jié)合在固體支持物表面,然后進行雜交（圖３—25）。圖3-２５Sｏｕｔheｒn雜交中的DＮA轉(zhuǎn)移（引自Aｌｂertsetal.2002)3．Nｏｒtｈern雜交Northｅrn雜交（NｏrｔheｒnＨｙbｒidizａt(yī)ion）是分析ＲNA的一種方法,它的基本原理是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進行分離,再轉(zhuǎn)移到尼龍膜等固相膜載體上,用放射性同位素標(biāo)記的DNA或RNA特異探針對固定于膜上的mRNA進行雜交,洗膜去除非特異性雜交信號,經(jīng)放射自顯影，對雜交信號進行分析.將雜交的mRNＡ分子在電泳中的遷移位置與標(biāo)準(zhǔn)分子量分子進行比較，即可知道細(xì)胞中特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小，對雜交信號的強弱比較,可以知道該基因表達mＲNA的強弱。這一技術(shù)應(yīng)用十分廣泛,常用于基因表達調(diào)控、基因結(jié)構(gòu)與功能、遺傳變異及病理研究。主要用來檢測外源基因在受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)錄成RNA。

Ｎｏrｔｈern印跡的原理同Ｓoｕthern印跡.但有兩點不同:其一是轉(zhuǎn)移的對象不同，Norｔherｎ印跡是將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。其二,雖然RNＡ電泳前不需向DNA那樣進行酶切,但也需要變性。不過變性方法是不同的，它不能用堿變性，因為堿變性會導(dǎo)致RＮA的水解.?Noｒthern雜交與Soｕｔｈeｒn雜交的主要區(qū)別是在變性劑存在下，用瓊脂糖進行電泳分離ＲNA。變性劑的作用是防止RNA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)夾環(huán)的形成,保持其單鏈線性狀態(tài).第六節(jié)生物技術(shù)及應(yīng)用基因工程技術(shù)的發(fā)展推動了生物技術(shù)(bｉoteｃ}lnokogy）的發(fā)展，現(xiàn)代生物技術(shù)作為一門綜合性的學(xué)科，與現(xiàn)代微生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和化學(xué)工程等多學(xué)科密切相關(guān)。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)從２0世紀(jì)８0年代開始起步，經(jīng)過20年的發(fā)展，目前在農(nóng)牧業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用.生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)市場逐漸形成，其前景廣闊,將成為21世紀(jì)經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)。(一)細(xì)胞工程細(xì)胞工程(ｃｅllenginｅｅrｉng）是利用細(xì)胞的全能性，在細(xì)胞或細(xì)胞器水平上改變細(xì)胞的某些遺傳特性,以改良其性狀、獲得有用基因產(chǎn)物或加速細(xì)胞及生物體繁殖的綜合技術(shù),可分為微生物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程和動物細(xì)胞工程，是以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ),通過細(xì)胞融合、細(xì)胞核移植、動物克隆、染色體工程和生物反應(yīng)器來實現(xiàn)。1．細(xì)胞融合細(xì)胞融合(cｅllfｕｓiｏn)又稱體細(xì)胞雜交(sｏmaｔicｈｙbｒidizatioｎ），是指兩個不同來源的細(xì)胞，彼此融合成雜交細(xì)胞,使來自兩個親本細(xì)胞的基因有可能都被表達，打破遠緣生物不能雜交的屏障，形成新物種或新品種的技術(shù)。1９75年，英國劍橋大學(xué)的科學(xué)家科萊爾(G．Kohｌｅr）和米爾斯坦(C。Milｓtｅｉn)用細(xì)胞融合技術(shù)將能分泌抗體的B淋巴細(xì)胞(綿羊紅細(xì)胞、免疫小鼠脾細(xì)胞）與具有無限生長能力的腫瘤細(xì)胞（小鼠骨髓瘤細(xì)胞）融合，得到了既能持續(xù)產(chǎn)生單一抗體又能在體外無限繁殖的雜合細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞，hyｂridomaｃell)(圖３—2６)，通過細(xì)胞培養(yǎng)將雜合細(xì)胞克隆為單純的細(xì)胞系（單克隆系),由此類細(xì)胞系可獲得結(jié)構(gòu)和特性完全相同的高純度抗體，即單克隆抗體（moｎoｃlonalanｔibody，ＭcＡb)。這一技術(shù)的創(chuàng)立在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得重大突破，兩位科學(xué)家因而榮獲１9８４年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。圖3—26利用細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體(引自Kuby，1９9４)如今這種細(xì)胞融合技術(shù)已在動物間實現(xiàn)了小鼠和田鼠,小鼠和小雞，甚至于小鼠和人等許多遠緣和超遠緣的體細(xì)胞雜交。雖然目前動物的雜交細(xì)胞還只停留在分裂傳代的水平，不能分化發(fā)育成完整的個體，但在理論研究和基因定位上都有重大意義。而植物間的細(xì)胞融合所得到的雜交細(xì)胞,獲得了新的雜交植物，如西紅柿與馬鈴薯細(xì)胞融合獲得“西紅柿馬鈴薯”，羽衣甘藍與白菜型油菜細(xì)胞融合得到“甘藍型油菜"等.２．細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植是將一種動物的細(xì)胞核移入同種或異種動物的去核成熟卵細(xì)胞內(nèi)的顯微操作技術(shù).由于主要遺傳物質(zhì)存在于細(xì)胞核內(nèi)，因而此技術(shù)可獲得遺傳上具同質(zhì)性狀的動物,對動物優(yōu)良雜交種的無性繁殖和瀕臨絕跡的珍貴動物的傳種具有重大意義。1952年,美國科學(xué)家布里格斯（R．Ｂrigｇs）首次利用豹紋蛙卵細(xì)胞建立了細(xì)胞核移植技術(shù).1981年，瑞士科學(xué)家Ｋ．111menses率先對哺乳動物小鼠卵細(xì)胞進行核移植獲得成功。他將灰鼠的細(xì)胞核注入到除去了精核和卵核的黑鼠的受精卵內(nèi),然后再將這一f'Ｆh黑鼠細(xì)胞質(zhì)和灰鼠細(xì)胞核組成的卵細(xì)胞體外培養(yǎng),得到的仔鼠是灰色的，說明仔鼠的性狀取決于細(xì)胞核的來源。在細(xì)胞核移植技術(shù)上發(fā)展起來的動物體細(xì)胞克隆技術(shù)在1997年因克隆羊“多莉”（Doｌlｙ)的誕生而取得了重大突破.英國科學(xué)家維爾穆特（I．ｗilmｕt)等1９9７年２月27日在《自然》描述了“多莉”的克隆過程(圖3—27）.他們?nèi)〕隽g的芬蘭多塞特白綿羊母羊的乳腺細(xì)胞核,將此核導(dǎo)入蘇格蘭黑綿羊去核的卵細(xì)胞內(nèi)，待手術(shù)完成之后，以相同頻率的電脈沖刺激換核卵，讓蘇格蘭黑綿羊的卵細(xì)胞質(zhì)與芬蘭多塞特白綿羊母羊乳腺細(xì)胞的核相互協(xié)調(diào),使這個“組裝”細(xì)胞在體外發(fā)育成早期胚胎，然后將胚胎植入另一只母羊的子宮內(nèi)，產(chǎn)下了小綿羊“多莉”?！岸嗬颉辈皇怯赡秆虻穆鸭?xì)胞和公羊的精細(xì)胞受精的產(chǎn)物,而是體細(xì)胞核加去核的卵細(xì)胞質(zhì),不經(jīng)兩性結(jié)合誘導(dǎo)出來的胚胎產(chǎn)生的?！翱寺⊙?的誕生表明：動物體中執(zhí)行特殊功能、具有特定形態(tài)的所謂高度分化的細(xì)胞與受精卵一樣具有發(fā)育成完整個體的潛在能力。圖３—27克隆羊“多莉”誕生的過程（引自Gｌiｃｋ&Pasternak,1998）19９8年,日本科學(xué)家利用成年動物體細(xì)胞克隆的兩頭牛犢誕生;同年,美國科學(xué)家用成年鼠的體細(xì)胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠；1９99年,夏威夷大學(xué)的科學(xué)家利用成年鼠體細(xì)胞克隆出第一只雄性老鼠;2000年１月，美國科學(xué)家宣布克隆猴成功，這只恒河猴被命名為“泰特拉"；同年3月，曾參與克隆小羊“多莉”的英國PPL公司宣布,他們成功培育出５頭克隆豬。200２年,我國科學(xué)家成功克隆出牛和山羊，使我國成為少數(shù)掌握體細(xì)胞克隆哺乳動物關(guān)鍵技術(shù)的國家之一.2０03年，美國、意大利等國科學(xué)家分別培育出世界上第一匹克隆騾子和克隆馬。中國和法國科學(xué)家合作首次克隆出大鼠。（二）蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程是根據(jù)分子設(shè)計的方案,通過對天然蛋白質(zhì)的基因進行改造，來實現(xiàn)對其所編碼的蛋白質(zhì)的改造，它的產(chǎn)品已不再是天然的蛋白質(zhì),而是經(jīng)過改造的,具有了人類所需要特性的特殊蛋白質(zhì).天然蛋白質(zhì)都是通過漫長的進化過程自然選擇而來的,而蛋白質(zhì)工程對天然蛋白質(zhì)的改造，能更快、更有效地為人類服務(wù)。重組人ｐ干擾素（IFNp）的人工改造是蛋白質(zhì)工程的一個成功范例。干擾素（ｉntｅrｆｅroｎ)是人體細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分.重組人IＦNβ是采用重組DNA技術(shù)，克隆人β干擾素基因，構(gòu)建合成干擾素的基因工程菌,經(jīng)發(fā)酵、提純、純化制備而成。其基因工程產(chǎn)物活性為10萬U／mg,僅是天然IFＮ口產(chǎn)物活性的１０%.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，人IFNβ由154個氨基酸組成，在１7、41、141位有3個半胱氨酸(Ｃys）,人體天然產(chǎn)物在4１、14１間形成二硫鍵，基因工程產(chǎn)物二硫鍵位置有偏差，17位Cyｓ的巰基參與二硫鍵,形成無活性的二聚體或寡聚體.由于絲氨酸（Ser）與半胱氨酸在結(jié)構(gòu)上除羥基（-OH)與巰基(-ＳH）外完全一樣，因此將１７位Cys點突變?yōu)镾ｅr，結(jié)果證明人工改造的IFN口產(chǎn)物活性提高１00倍,穩(wěn)定性好于天然產(chǎn)物。(三）酶工程酶工程（eｎzymeengineerinｇ)就是通過對酶的修飾改造,提高酶的催化效率并在某一生物反應(yīng)器中大規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)過程，主要包括酶的發(fā)酵生產(chǎn)、酶的分離純化、酶分子修飾、酶和細(xì)胞固定化、酶反應(yīng)動力學(xué)與反應(yīng)器、酶的應(yīng)用等。酶工程的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中(表3—4).例如,固定化青霉素?；赣糜谶B續(xù)裂解青霉素生產(chǎn);α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖異構(gòu)酶連續(xù)作用于淀粉,就可以生產(chǎn)出各類糖漿;利用葡萄糖苷酶可生產(chǎn)出低糖啤酒;蛋白酶用于除去毛皮中的特定蛋白，軟化皮革等。加酶洗衣粉、用蛋白酶生產(chǎn)的嫩肉粉等,都是酶工程的產(chǎn)物。此外，酶工程還用于農(nóng)副產(chǎn)品的加工利用。美國利用大豆生產(chǎn)出2０0余種產(chǎn)品,包括營養(yǎng)食品、藥品、食品添加劑等，例如高純度大豆卵磷脂、大豆蛋白等。目前工業(yè)生產(chǎn)的酶有６０余種,其中規(guī)?；a(chǎn)僅２０余種.表３—4酶工程的主要應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用領(lǐng)域酶類主要用途食品工業(yè)淀粉酶類葡萄糖、麥芽糖生產(chǎn),啤酒釀造，面包、餅干等,烘烤食品制作等蛋白酶類嫩肉粉、餅干、蛋白胨、乳酪生產(chǎn),啤酒澄清，肉類加工（如香腸熟化等）糖化酶淀粉液化，糊精降解葡萄糖異構(gòu)酶高果糖漿生產(chǎn)葡萄糖苷酶低糖啤酒生產(chǎn)凝乳酶乳酪生產(chǎn)果膠酶果酒、果汁去濁紡織工業(yè)淀粉酶類紡織品褪漿纖維素酶處理纖維制品，提高棉毛紡織品質(zhì)量蛋白酶類絲制品脫膠處理日化工業(yè)蛋白酶類加酶洗滌劑、加酶護膚品與化妝品生產(chǎn)淀粉酶類加酶洗滌劑生產(chǎn)超氧化物歧化酶化妝品生產(chǎn)糖酐酶牙膏添加劑制革工業(yè)蛋白酶類皮革去毛、軟化醫(yī)藥工業(yè)青霉素?；盖嗝顾?、頭孢霉素生產(chǎn)羥化酶氫化可的松生產(chǎn)酪氨酸酶多巴(主治帕金森?。┥a(chǎn)蛋白酶類氨基酸、蛋白水解液生產(chǎn)，治療消化不良，消腫,降壓等葡萄糖腦苷酯酶治療高雪病(葡萄糖腦苷酯酶缺乏癥)天冬酰胺酶治療白血病溶菌酶消炎,鎮(zhèn)痛，止血等尿激酶治療心肌梗死、結(jié)膜出血等超氧化物歧化酶治療紅斑狼瘡、皮肌炎、輻射損傷等鏈激酶治療血栓性靜脈炎、血腫等其他多種酶多種疾病診斷(如葡萄糖氧化酶診斷糖尿病，膽堿酯酶診斷肝炎等）環(huán)保工業(yè)淀粉酶類處理造紙工業(yè)廢水溶菌酶處理高有機物含量廢水丁酸梭菌酶系處理釀酒工業(yè)廢水其他多種酶環(huán)境監(jiān)測試劑（如膽堿酯酶監(jiān)測有機磷農(nóng)藥,硫氰酸酶監(jiān)測氰

化物等)(四）發(fā)酵工程發(fā)酵工程(fｅrmｅntａt(yī)ioｎenｇineeｒinｇ）是利用微生物的特性，通過現(xiàn)代化工程技術(shù)，在反應(yīng)器中生產(chǎn)目的產(chǎn)物或提供所需服務(wù)的技術(shù)過程.“發(fā)酵”一詞來源于拉丁語動詞ferｖerｅ（發(fā)泡），意指利用酵母以果汁或麥芽汁為原料生產(chǎn)酒精飲料時出現(xiàn)的現(xiàn)象。傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)有悠久的歷史，早在幾千年前人類就利用有益的微生物生產(chǎn)食品和藥物，如酒、醋、醬、奶酪等?，F(xiàn)代發(fā)酵工程是在傳統(tǒng)發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上結(jié)合基因工程、細(xì)胞工程、酶工程等現(xiàn)代高新技術(shù)發(fā)展而成，由于其主要以微生物培養(yǎng)為主，因而也稱微生物工程.發(fā)酵工程由3部分組成(圖3-2８）：上游工程、發(fā)酵過程和下游工程。其中上游工程包括優(yōu)良菌株的選育、最適發(fā)酵條件(pH、溫度、溶氧和營養(yǎng)組成)的確定、營養(yǎng)物的準(zhǔn)備等.發(fā)酵過程主要指在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù)。這里要有嚴(yán)格的無菌生長環(huán)境,包括發(fā)酵開始前采用高溫高壓對發(fā)酵原料和發(fā)酵罐以及各種連接管道進行滅菌的技術(shù)，在發(fā)酵過程中不斷向發(fā)酵罐中通入干燥無菌空氣的空氣過濾技術(shù),在發(fā)酵過程中根據(jù)細(xì)胞生長要求控制加料速度的計算機控制技術(shù),還有種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)的不同的工藝技術(shù)。圖3-28發(fā)酵工程的基本流程微生物發(fā)酵產(chǎn)品可分為以下幾大類:微生物細(xì)胞(生物量）作為產(chǎn)品,如單細(xì)胞（酵母）蛋白作為食品或飼料。微生物代謝物產(chǎn)品，目前醫(yī)用抗生素、農(nóng)用抗生素等已有近20０個品種,絕大部分都是發(fā)酵產(chǎn)品.此外，發(fā)酵產(chǎn)品還包括酒精、氨基酸、檸檬酸和工業(yè)用酶等。味精、多種維生素等也是發(fā)酵工程的產(chǎn)品?；蚬こ坍a(chǎn)品.微生物(如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌和酵母等)是最常用的重組基因的表達系統(tǒng)。主要產(chǎn)品包括干擾素、胰島素、牛凝乳酶、G—ＣSF(粒細(xì)胞集落刺激因子）、ＥPO（紅細(xì)胞生成素）和tＰA（重組組織型纖溶酶原激活劑）等。（五）生物醫(yī)學(xué)工程生物醫(yī)學(xué)工程（ｂiomediｃalenｇiｎeerinｇ)是綜合生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和工程學(xué)的理論和方法而發(fā)居起來的新興綜合學(xué)科.生物醫(yī)學(xué)工程開始以仿生學(xué)原理制造人工器官,如心臟起搏器、人造心臟、假肢等,以及用于診療手段的醫(yī)學(xué)儀器。后來人體器官移植成為醫(yī)療中可以選擇的手段，但常常要克服異體器官的排斥反應(yīng)，在用藥物能夠解決排斥反應(yīng)之前，人體器官移植成功的例子很少.由于生物技術(shù)迅猛發(fā)展,在ＤNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)5０年后,人類基因組計劃已經(jīng)完成，對人類基因全面了解后，人們已經(jīng)將眼光投到干細(xì)胞克隆和治療性克隆(非生殖性克隆),一些國家如美國建立了胚胎的干細(xì)胞系，用于包括治療性克隆等方面的研究.國外已經(jīng)成功地從自體鼻窿腔內(nèi)取出干細(xì)胞，導(dǎo)人心臟,去除心臟因炎癥等留下的疤痕,恢復(fù)了心臟的正常功能，以及用血液中的干細(xì)胞修復(fù)因車禍等造成四肢癱瘓患者的脊髓神經(jīng)，使他們重新站立