中藥制劑檢測技術(shù)第五章中藥制劑的衛(wèi)生學(xué)檢查

1.各種非規(guī)定滅菌制劑應(yīng)進(jìn)行微生物限度檢查法；2.無菌制劑應(yīng)依法進(jìn)行無菌檢查；3.靜脈滴注用注射劑應(yīng)進(jìn)行無菌、熱原及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查第五章中藥制劑的衛(wèi)生學(xué)檢查《中國藥典》規(guī)定：當(dāng)前第1頁\共有70頁\編于星期三\20點一、基本知識

（一）基本概念微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。非規(guī)定滅菌制劑主要指口服制劑、一般外用制劑。（二）檢查項目

1．染菌量（細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)）

2．控制菌檢查（包括大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌以及白色念珠菌等）第一節(jié)微生物限度檢查法當(dāng)前第2頁\共有70頁\編于星期三\20點二、微生物限度檢驗原則第一節(jié)微生物限度檢查法（一）環(huán)境

1．潔凈度1萬級以下局部100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行；

2．檢驗過程嚴(yán)格無菌操作；

3．嚴(yán)防第二次污染。中國藥品生產(chǎn)潔凈級別有哪些？其標(biāo)準(zhǔn)要求是什么？課堂互動當(dāng)前第3頁\共有70頁\編于星期三\20點

（二）供試品抽樣、保存及檢驗量按批號隨機(jī)抽樣，抽樣量為檢驗用量的3倍。每批抽樣應(yīng)至少含有2個以上最小包裝單位。

檢驗量系指每次檢驗所需的供試品量(g、ml或cm2)。

固體和半固體制劑的檢驗量為10g；液體制劑10ml；

膜劑為100cm2

(不得少于4片)。貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應(yīng)增加20g或20ml第一節(jié)微生物限度檢查法當(dāng)前第4頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法（三）供試液制備采用規(guī)定的適宜方法制備

1．液體供試品：供試品10ml+pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液定容至100ml

混勻

1:10供試液油劑可加入適量無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻；水溶性液體制劑可用混合的供試品原液作為供試液。當(dāng)前第5頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法2．固體供試品：供試品10g+pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液定容至100ml

混勻勻漿儀或其他適宜方法

1:10供試液必要時加適量無菌聚山梨酯80，并置45℃以下水浴適當(dāng)加溫，使供試品分散均勻。當(dāng)前第6頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法3．需用特殊方法制備的供試品非水溶性供試品膜劑供試品腸溶或結(jié)腸溶制劑供試品氣霧劑、噴霧劑供試品貼膏劑供試品其制備方法按藥典規(guī)定操作。當(dāng)前第7頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法4.具抑菌活性供試品：采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等消除其抑菌活性。

注意：供試液制備若需加溫時，應(yīng)均勻加熱，溫度不超過45℃，時間不得超過30分鐘。（四）檢驗條件

培養(yǎng)溫度：細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30～35℃，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23～28℃。陰性對照：以確定無菌技術(shù)的可靠性陽性對照：檢查供試品對控制菌生長有無干擾，培養(yǎng)條件是否適宜當(dāng)前第8頁\共有70頁\編于星期三\20點三、細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)第一節(jié)微生物限度檢查法（一）計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查（二）計數(shù)方法的驗證（三）檢查方法（四）注意事項

當(dāng)前第9頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法（一）計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查基本知識計數(shù)用培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅營養(yǎng)瓊脂和酵母浸出粉葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基：系指培養(yǎng)基處方特別制備、質(zhì)量優(yōu)良的培養(yǎng)基，由中國藥品生物制品鑒定所研制及分發(fā)。檢查方法：通過檢驗用培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基的比較，以陽性菌的生長狀態(tài)或特征來評價檢驗用培養(yǎng)基是否符合檢驗要求。當(dāng)前第10頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法（一）計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查1.菌種（5種）傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代）大腸埃希菌（Escherchiacoli）金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus）枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)白色念珠菌(Candidaalbicans)黑曲霉(Aspergillusniger)當(dāng)前第11頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法（一）計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌黑曲霉玫瑰紅營養(yǎng)瓊脂酵母浸出粉葡萄糖瓊脂白色念珠菌當(dāng)前第12頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法2.菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48小時。上述培養(yǎng)基用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu（“Colonyformingunits”的縮寫，菌落形成單位，代表含有的菌落數(shù)）的菌懸液。當(dāng)前第13頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法2.菌液制備接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管中，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。菌液保存制備好的菌液以當(dāng)天使用為宜。若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在2～8℃，可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。當(dāng)前第14頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法3.適用性檢查取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)；取白色念珠菌50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)。用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗。當(dāng)前第15頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法4.結(jié)果判斷同時滿足以下兩個條件可判定培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定：②菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。①當(dāng)前第16頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法（二）計數(shù)方法的驗證1.菌種與菌液的制備同培養(yǎng)基的適用性檢查。

2.驗證方法

驗證試驗至少應(yīng)進(jìn)行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率；可與供試品的細(xì)菌，霉菌及酵母菌計數(shù)同時進(jìn)行。當(dāng)前第17頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法2.驗證方法(1)試驗組：1ml最低稀釋級供試液+50～100cfu試驗菌(2)菌液組：測定所加的試驗菌數(shù)(3)供試品對照組：規(guī)定量的供試液(4)稀釋劑對照組：稀釋液+試驗菌（加入了入乳化劑、分散劑及中和劑等除稀釋液外的試劑或需薄膜過濾處理時）當(dāng)前第18頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法3.結(jié)果判斷在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率應(yīng)均不低于70%。若試驗組的菌數(shù)回收率均不低于70%，則計數(shù)方法可靠；若任一次試驗中試驗組的菌數(shù)回收率低于70%，則應(yīng)消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證當(dāng)前第19頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法（三）檢查方法：平皿法和薄膜過濾法供試液的稀釋傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)及計數(shù)菌落報告體積：15～20ml,傾注平板數(shù)：2個及以上細(xì)菌3天，霉菌、酵母菌5～7天取2～3個適宜稀釋級，加入1ml至平皿中1.平皿法適用于無明顯抑菌作用的制劑。注意：平皿法計數(shù)時還需做陰性對照，要求均不得有菌生長。當(dāng)前第20頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法菌數(shù)報告規(guī)則：宜選取細(xì)菌、酵母菌平均菌落數(shù)小于300cfu、霉菌平均菌落數(shù)在小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告1g、1ml或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以＜1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。當(dāng)前第21頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法2.薄膜過濾法一般適用于可溶性抑菌制劑供試液稀釋過濾沖洗濾膜的菌面朝上貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)和計數(shù)取出濾膜濾膜：孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑一般為50mm；每張濾膜每次沖洗量為100ml。每片濾膜的總濾過量不宜過大，不得超過1000ml，以免濾膜上的微生物受損傷。操作流程：當(dāng)前第22頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法規(guī)定：每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。菌數(shù)報告原則：以相當(dāng)于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)。若濾膜上無菌落生長，以＜1報告菌數(shù)(每張濾膜濾過1g或1ml供試品)，或以＜1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。

陰性對照：取試驗用的稀釋劑1ml同法操作，作為。陰性對照不得有菌生長。當(dāng)前第23頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法（四）注意事項1.所測菌只包括一群能在上述培養(yǎng)基上生長的嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。2.所有器具必須經(jīng)嚴(yán)格滅菌。3.在無菌條件下完成操作。4.滅菌的試管及玻璃瓶每次打開和關(guān)閉都需用火焰滅菌。5.切忌用手接觸標(biāo)本及已滅菌的器材內(nèi)部，也勿用口吸、吹。當(dāng)前第24頁\共有70頁\編于星期三\20點四、控制菌檢查第一節(jié)微生物限度檢查法

本法包括大腸埃希菌、大腸菌群、銅綠假單胞菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、梭菌以及白色念珠菌的檢查。其中，大腸埃希菌、大腸菌群是口服藥品的控制菌之一；銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌是外用藥品和滴眼劑的控制菌。當(dāng)前第25頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法（一）控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查1.菌種（6種）

大腸埃希菌〔CMCC(B)44102〕金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕乙型副傷寒沙門菌〔CMCC(B)50094〕銅綠假單胞菌〔CMCC(B)10104〕生孢梭菌〔CMCC(B)64941〕白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。當(dāng)前第26頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法2.菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中；接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48小時。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至馬丁肉湯培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成1ml含含菌數(shù)為500～1000cfu的菌懸液。3.適用性檢查項目：促生長能力抑制能力指示能力具體方法參照中國藥典2010年版附錄。當(dāng)前第27頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法（二）控制菌檢查方法的驗證成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。驗證方法：取規(guī)定量供試液及10～100cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，濾過后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。結(jié)果判斷：若上述試驗中檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；當(dāng)前第28頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法（三）檢查方法1.大腸埃希菌(Escherichiacoli)1:10供試液10ml100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基18～24h0.2ml5mlMUG5小時、24小時366nm紫外光燈下有無熒光靛基質(zhì)試液是否玫瑰紅色供試品檢查1:10供試液10ml100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基陽性對照1ml10～100cfu大腸埃希菌此后同法操作10ml稀釋液100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基陰性對照此后同法操作當(dāng)前第29頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法結(jié)果判斷驗證試驗劃線接種：取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物接種至曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，觀察革蘭氏染色鏡檢：革蘭陰性無芽胞桿菌適宜的鑒定試驗：發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸；IMViC實驗反應(yīng)為++??或?+??。MUG反應(yīng)靛基質(zhì)反應(yīng)判斷結(jié)果++檢出大腸埃希菌??未檢出大腸埃希菌+?需進(jìn)一步驗證?+需進(jìn)一步驗證當(dāng)前第30頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法管1：1∶10供試液1ml管2：1∶100供試液1ml管3：1∶1000供試液1ml管4：稀釋劑1ml4個裝有>10ml乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管1、2、3、4+18～24h無菌生長，或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣18～24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣判定該管未檢出大腸菌群曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基確證實驗：乳糖發(fā)酵管疑似不產(chǎn)酸產(chǎn)氣18～24h2.大腸菌群(Coliform)當(dāng)前第31頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法各供試品量的檢出結(jié)果可能的大腸菌群數(shù)N(個/g或ml)或0.1ml或0.01ml或0.001ml＋＋＋＞103＋＋－102＜N＜103＋－－10＜N＜102－－－＜10結(jié)果判斷與報告：根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按下表報告1g或1ml供試品中的大腸菌群數(shù)。＋代表檢出大腸菌群；－代表未檢出大腸菌群。當(dāng)前第32頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法3.沙門菌(Salmonella)供試品10g或10ml不少于200ml的營養(yǎng)肉湯18～24h1ml10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基18～24h膽鹽硫乳瓊脂(或沙門、志賀菌屬瓊脂)培養(yǎng)基18～24h麥康凱瓊脂(或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂)培養(yǎng)基18～24h18～24h三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基當(dāng)前第33頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基判定未檢出該菌1:10供試液10ml100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基18～24h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面18～24h18～24h氧化酶試驗+革蘭染色鏡檢綠膿菌素(Pyocyanin)試驗陽性或G?陽性判定檢出該菌陰性或非G?適宜的鑒定試驗陰性4.銅綠假單胞桿菌((Pseudomonasaeruginosa)當(dāng)前第34頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法5.金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)革蘭氏染色+血漿凝固酶試驗供試液10ml18～24h24～72h24～72h非G+球菌和血漿凝固酶試驗陰性判供試品未檢出該菌判供試品未檢出該菌100ml的亞碲酸鈉(鉀)肉湯(或營養(yǎng)肉湯)卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基無菌落生長有菌落生長當(dāng)前第35頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法6.梭菌(Clostridium)含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板革蘭氏染色+過氧化氫酶試驗2份供試液10ml，其中一份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻48h各0.2ml厭氧條件分別接種于100ml梭菌增菌培養(yǎng)基厭氧條件48～72h非G+梭菌和過氧化氫酶試驗陰性判供試品未檢出梭菌無菌落生長判供試品未檢出梭菌若有菌落生長當(dāng)前第36頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法7.白色念珠菌（Candidaalbicans）念珠菌顯色培養(yǎng)基供試液10ml48～72h24～48h鏡檢，染色+芽管試驗判供試品未檢出該菌100ml的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基無菌落生長有菌落生長判供試品未檢出該菌聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基綠色或翠綠色無綠色或翠綠色當(dāng)前第37頁\共有70頁\編于星期三\20點控制菌檢驗試劑陽性判斷驗證用試劑或試驗大腸埃希菌MUG試液靛基質(zhì)試液熒光玫瑰紅色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂、乳糖發(fā)酵管大腸菌群乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣沙門菌膽鹽硫乳瓊脂麥康凱瓊脂菌落中心黑色三糖鐵瓊脂銅綠假單胞菌乳糖膽鹽培養(yǎng)基溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基氧化酶試驗灰白色，周圍時有藍(lán)綠色素擴(kuò)散PDP瓊脂培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌亞碲酸鈉(鉀)卵黃氯化鈉瓊脂金黃色血漿凝固酶試驗梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基混濁、產(chǎn)氣過氧化氫酶試驗白色念珠菌沙氏葡萄糖沙氏葡萄糖瓊脂念珠菌顯色培養(yǎng)基乳白色，表面光滑有濃酵母氣味綠色或翠綠色芽管試驗第一節(jié)微生物限度檢查法總結(jié)當(dāng)前第38頁\共有70頁\編于星期三\20點第一節(jié)微生物限度檢查法（四）結(jié)果判斷供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，單獨復(fù)試兩次，以3次結(jié)果的平均值報告均數(shù)。供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、控制菌三項檢驗結(jié)果均符合該品種項下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定。若其中一項不符合該品種項下的歸定，判供試品不符合規(guī)定。當(dāng)前第39頁\共有70頁\編于星期三\20點五、微生物限度標(biāo)準(zhǔn)第一節(jié)微生物限度檢查法口服給藥制劑不得檢出大腸埃希菌。局部給藥制劑不得檢出控制菌金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。鼻及呼吸道吸入給藥制劑還不得檢出大腸埃希菌，陰道、尿道給藥制劑還不得檢出梭菌和白色念珠菌。含動物組織(包括臟器提取物)及動物類原藥材粉(蜂蜜、王漿、動物角、阿膠除外)的口服給藥制劑

每10g或10ml不得檢出沙門菌。霉變、長螨者

以不合格論。當(dāng)前第40頁\共有70頁\編于星期三\20點一、基本知識

（一）基本概念無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。（二）檢查對象

各類注射劑、吸入粉霧劑、眼用制劑、可吸收的止血劑、用于手術(shù)、燒傷及嚴(yán)重創(chuàng)傷的局部給藥制劑等第二節(jié)無菌檢查法當(dāng)前第41頁\共有70頁\編于星期三\20點二、無菌檢查的人員與環(huán)境第二節(jié)無菌檢查法無菌檢查的人員：具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)無菌技術(shù)培訓(xùn)。無菌檢查環(huán)境：環(huán)境潔凈度為10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)無菌檢查要求：全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。當(dāng)前第42頁\共有70頁\編于星期三\20點三、培養(yǎng)基的制備與檢查第二節(jié)無菌檢查法1．培養(yǎng)基的種類及制備

無菌檢查用培養(yǎng)基主要有硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)好氧菌、厭氧菌）、改良馬丁培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)真菌）、選擇性培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基和改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。其制備的處方、方法按藥典規(guī)定執(zhí)行。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2～25℃、避光的環(huán)境。培養(yǎng)基若保存于非密閉容器中，一般在三周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。2．培養(yǎng)基的適用性檢查無論是市售的脫水培養(yǎng)基或配制的培養(yǎng)基，其無菌性檢查及靈敏度檢查應(yīng)符合藥典規(guī)定。當(dāng)前第43頁\共有70頁\編于星期三\20點四、稀釋液、沖洗液及其制備第二節(jié)無菌檢查法

常用的稀釋液、沖洗液：0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液，其制備方法按藥典規(guī)定執(zhí)行。稀釋液、沖洗液配制后應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。根據(jù)供試品的特性，可選用其他經(jīng)驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中合劑等。五、方法驗證（略）當(dāng)前第44頁\共有70頁\編于星期三\20點六、供試品的無菌檢查第二節(jié)無菌檢查法1．檢驗數(shù)量檢驗數(shù)量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按表5－11規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗按表5－12、表5－13規(guī)定。表中最少檢驗數(shù)量不包括陽性對照試驗的供試品用量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應(yīng)增加1/2的最小檢驗數(shù)量作為陽性對照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品無菌檢查時每個培養(yǎng)基容器接種的樣品量作陽性對照用。當(dāng)前第45頁\共有70頁\編于星期三\20點第二節(jié)無菌檢查法2．檢驗量是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按表5－12、表5－13規(guī)定。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗量應(yīng)不少于直接接種法的供試品總接種量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。當(dāng)前第46頁\共有70頁\編于星期三\20點第二節(jié)無菌檢查法3．陽性對照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌，選擇方法可以見下表。陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量小于100cfu，供試品用量同無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)48～72小時應(yīng)生長良好。不同特性的供試品陽性對照菌無抑菌作用及抗革蘭氏陽性菌為主金黃色葡萄球菌抗革蘭氏陰性菌為主大腸埃希菌抗厭氧菌的供試品生孢梭菌抗真菌的供試品白色念珠菌當(dāng)前第47頁\共有70頁\編于星期三\20點第二節(jié)無菌檢查法4．陰性對照供試品無菌檢查時，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑，沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對微生物無毒性。中國藥典的“無菌檢查法”有直接接種法和薄膜濾過法兩種。只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。進(jìn)行供試品無菌檢查時，所采用的檢查方法和檢驗條件應(yīng)與驗證的方法相同。當(dāng)前第48頁\共有70頁\編于星期三\20點第二節(jié)無菌檢查法5．供試品處理及接種培養(yǎng)基：薄膜過濾法和直接接種法反復(fù)使用全封閉式薄膜過濾器薄膜過濾器（三聯(lián)不帶泵）當(dāng)前第49頁\共有70頁\編于星期三\20點第二節(jié)無菌檢查法開放式薄膜過濾法操作當(dāng)前第50頁\共有70頁\編于星期三\20點第二節(jié)無菌檢查法當(dāng)前第51頁\共有70頁\編于星期三\20點第二節(jié)無菌檢查法直接接種法圖示當(dāng)前第52頁\共有70頁\編于星期三\20點第二節(jié)無菌檢查法6．培養(yǎng)及觀察培養(yǎng)基按規(guī)定的溫度，培養(yǎng)14日逐日觀察并記錄新鮮培養(yǎng)物或劃線接種培養(yǎng)培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢判斷是否有菌渾濁當(dāng)前第53頁\共有70頁\編于星期三\20點七、無菌結(jié)果判斷第二節(jié)無菌檢查法供試品符合規(guī)定供試品不符合規(guī)定供試品均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長當(dāng)前第54頁\共有70頁\編于星期三\20點第二節(jié)無菌檢查法當(dāng)符合下列至少一個條件時，方可判試驗結(jié)果無效：（1）無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求；（2）回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。（3）陰性對照管有菌生長；（4）供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。試驗若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。當(dāng)前第55頁\共有70頁\編于星期三\20點

（一）基本概念熱原(pyrogen)系指藥品中含有的能引起體溫升高的雜質(zhì)，主要為細(xì)菌性熱原。方法：家兔檢查法，即將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限量是否符合規(guī)定。（二）檢查對象供靜脈滴注用的注射劑以及容易感染熱原的品種。

第三節(jié)熱原檢查法一、基本知識

當(dāng)前第56頁\共有70頁\編于星期三\20點第三節(jié)熱原檢查法3只兔：0.5小時測1次，共6次，最高-最低＝升高的溫度結(jié)果：均升高在0.6℃以下且升高的總數(shù)在1.3℃以下認(rèn)為符合規(guī)定家兔檢查法當(dāng)前第57頁\共有70頁\編于星期三\20點

（一）基本概念細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系指利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。（二）檢查方法即凝膠法和光度測定法。凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的方法。是中國藥典的“仲裁”方法。第四節(jié)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法一、基本知識

當(dāng)前第58頁\共有70頁\編于星期三\20點第四節(jié)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法二、儀器和試劑（一）儀器和試劑

37±1℃恒溫水浴或適宜的恒溫器具、超凈工作臺、漩渦混合器、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、加樣器、鱟試劑、鱟試驗用水、pH調(diào)節(jié)劑等。鱟試劑漩渦混合器加樣器當(dāng)前第59頁\共有70頁\編于星期三\20點第四節(jié)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法器具要求：凡與供試品或試劑直接接觸的器具必須經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃、30分鐘以上)去除，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。（二）儀器和試劑的相關(guān)要求鱟試驗用水：藥典規(guī)定凝膠法：內(nèi)毒素含量小于0.015EU／ml

光度側(cè)定法：內(nèi)毒素含量小于0.005EU/ml，且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水。當(dāng)前第60頁\共有70頁\編于星期三\20點第四節(jié)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品：系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價。內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價，用于試驗中的鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗及各種陽性對照。當(dāng)前第61頁\共有70頁\編于星期三\20點第四節(jié)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法三、測定方法供試品限值確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）確定供試品干擾實驗正式實驗結(jié)果判斷實驗流程當(dāng)前第62頁\共有70頁\編于星期三\20點第四節(jié)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法供試品內(nèi)毒素檢查：凝膠限度試驗編號內(nèi)毒素濃度／被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無／供試品溶液2B2λ／供試品溶液2C2λ／檢查用水2D無／檢查用水2A為供試品溶液；B為供試品陽性對照；C為陽性對照；D為陰性對照。λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml)。當(dāng)前第63頁\共有70頁\編于星期三\20點第四節(jié)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法1．溶液制備（1）供試品溶液制備：用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將供試品配成對應(yīng)的MVD的濃度A。（2）供試品陽性對照液的制備：

用被測供試品溶液A將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ濃度的內(nèi)毒素溶液B。（3）陽性對照液的制備：用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ濃度的內(nèi)毒素溶液C。（4）陰性對