瓊脂糖凝膠電泳注意事項

瓊脂糖凝膠電泳操作

及其注意事項歡迎大家一起交流！當(dāng)前第1頁\共有27頁\編于星期四\19點?什么是電泳？

帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳。

生物大分子如蛋白質(zhì),核酸,多糖等大多都有陽離子和陰離子基團,稱為兩性離子在電場中,帶電顆粒向正極或負極遷移,遷移的方向取決于它們帶電的符號。當(dāng)前第2頁\共有27頁\編于星期四\19點按分離原理的不同，電泳分為4類:

移動界面電泳區(qū)帶電泳等電聚焦電泳等速電泳?電泳有幾類？當(dāng)前第3頁\共有27頁\編于星期四\19點瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達到分離混合物的目的。?瓊脂糖凝膠電泳原理當(dāng)前第4頁\共有27頁\編于星期四\19點?瓊脂糖凝膠電泳的操作操作步驟配膠

點樣

電泳

成像拍照EB染色

膠圖分析當(dāng)前第5頁\共有27頁\編于星期四\19點1、配膠

按所要分離的DNA分子的大小，稱取適量的瓊脂糖粉末，放入錐形瓶，加適量1×TAE電泳緩沖液;

然后置微波爐內(nèi)加熱搖勻至完全溶化呈透明狀，適當(dāng)冷卻后倒入膠托;膠完全冷凝后放入電泳槽，電泳槽里的緩沖液必須沒過膠面。

當(dāng)前第6頁\共有27頁\編于星期四\19點當(dāng)前第7頁\共有27頁\編于星期四\19點2、點樣！根據(jù)樣品不同可分兩種點樣體系：A、樣品+6XloadingbufferB、樣品可直接點樣（如ssp）最后記得點marker，并擺正膠的位置當(dāng)前第8頁\共有27頁\編于星期四\19點點樣當(dāng)前第9頁\共有27頁\編于星期四\19點3、電泳！點完樣后連接電源，設(shè)置好電源的參數(shù)，開始電泳。當(dāng)溴酚蘭的帶（藍色）的移動至一定長度即可停止電泳。電壓要求：≤20V/CM膠，在樣品出孔用低壓（3V/CM，15min），然后調(diào)回標(biāo)準(zhǔn)電壓，跑出的條帶較好。當(dāng)前第10頁\共有27頁\編于星期四\19點電泳槽當(dāng)前第11頁\共有27頁\編于星期四\19點4、EB染色溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射EB-DNA復(fù)合物時，出現(xiàn)不同的效應(yīng)。注意：嚴(yán)格區(qū)分污染區(qū)和非污染區(qū)，不把污染區(qū)的物品拿到非污染區(qū)，碰過EB的手套要及時丟棄！當(dāng)前第12頁\共有27頁\編于星期四\19點EB染膠區(qū)當(dāng)前第13頁\共有27頁\編于星期四\19點5、成像拍照Tanon-2500數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)把圖像攝錄、處理、打印一體化。采用高分辨率CCD，高質(zhì)量、高清晰度，保證攝錄凝膠圖像在低照度下的靈敏度、不掉失條帶。當(dāng)前第14頁\共有27頁\編于星期四\19點Tanon-2500數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)當(dāng)前第15頁\共有27頁\編于星期四\19點6、膠圖分析

以SBT-PCR為例，主要做A、B、DR三個位點，每個位點條帶大小不同.當(dāng)前第16頁\共有27頁\編于星期四\19點

注意事項注意事項當(dāng)前第17頁\共有27頁\編于星期四\19點一、配膠1.電子稱的使用，要時刻注意保持電子稱的精確性，保持清潔，根據(jù)不同的濃度的膠稱瓊脂糖。2.加TAE的量要適當(dāng)，以免配出來的膠太薄導(dǎo)致膠孔太淺或濃度太低。3.倒膠前膠托一定要洗干凈，并擦干；倒膠時要待膠冷到一定溫度搖勻盡量不要產(chǎn)生氣泡。若膠液的溫度太高要頂在膠托防止膠托變形。當(dāng)前第18頁\共有27頁\編于星期四\19點二、點樣電泳1.96孔塑料板要干凈，loading要點均勻，控制在1~2ul的量，并做好對應(yīng)標(biāo)記。2.加樣時，槍頭要上緊，吸樣均一準(zhǔn)確，排液時吸頭不要有殘留。3.點完樣后及時蓋上膠墊，注意不要蓋反。4.點電泳前最好檢查待用膠是否合格；點電泳時要對準(zhǔn)膠孔，盡量點完所有的樣。5.點完樣勿忘點marker并擺正膠位，電泳儀正負極不要插反，電泳槽的蓋子要蓋緊。當(dāng)前第19頁\共有27頁\編于星期四\19點三、EB染色1.切膠要準(zhǔn)，取膠要穩(wěn)，泡膠要慎，避免EB濺起。2.碰到EB的手套要及時丟棄。3.EB液要適時跟換，盤子要清洗。4.抹布要嚴(yán)格區(qū)分，不可交叉使用。當(dāng)前第20頁\共有27頁\編于星期四\19點四、TanonTanon-2500數(shù)碼凝膠圖像分析儀的使用

1.使用前要注意清潔，以免影響膠圖的清晰度。2.照膠時盡量減少開紫外燈的時間。3.拍照時先關(guān)攝像頭再關(guān)紫外燈，不可顛倒，嚴(yán)格按照照膠的流程進行。4.照好的膠及時丟棄。當(dāng)前第21頁\共有27頁\編于星期四\19點瓊脂糖凝膠電泳中常見“問題”膠圖當(dāng)前第22頁\共有27頁\編于星期四\19點當(dāng)前第23頁\共有27頁\編于星期四\