熒光定量原理及其應(yīng)用

熒光定量原理及其應(yīng)用第一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一實時熒光定量PCR的基本原理

實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。第二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖.第三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一熒光擴(kuò)增曲線分為三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。第四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一熒光背景信號階段：為擴(kuò)增最初的10～15個循環(huán)，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。平臺期：擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。第五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一指數(shù)期：此期PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，因此我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。第六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一熒光閾值：是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。CT值：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值。第七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，到達(dá)熒光閾值的CT值越小，反之越大。第八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，橫坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。第九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一定量方法絕對定量：是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量。第十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一相對定量：是通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計算表達(dá)基因的差異，也稱之為2-ΔΔCt。第十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一其他定量方法第十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一熒光定量PCR檢測模式熒光定量PCR的理論基礎(chǔ)：均基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)的原理，即當(dāng)一個熒光基團(tuán)與一個淬滅基團(tuán)的距離鄰近時（＜10nm)，就會發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，淬滅基團(tuán)會吸收熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下的激發(fā)熒光，從而使其發(fā)不出熒光。但如果熒光基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)分開，淬滅作用即消失。第十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一檢測模式SYBRGreenI檢測模式：SYBRGreenI是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。第十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBRGreenI工作原理第十五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一缺點(diǎn)：PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，通常本底較高，引起假陽性。優(yōu)點(diǎn)：通用性好，價格低，在科研中使用較普遍。第十六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一水解探針模式（Taqman）TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’

末端，而淬滅劑則在3’

末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’

端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’

外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。第十七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子熒光信號的產(chǎn)生，隨著循環(huán)數(shù)增加，熒光信號不斷積累。第十八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一分子信標(biāo)探針模式分子信標(biāo)是一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。第十九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)緊緊靠近而被淬滅。當(dāng)存在模板時，環(huán)序列將與模板配對，此時分子信標(biāo)成鏈狀而非莖環(huán)狀，熒光基團(tuán)與淬滅劑分開，使得熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。第二十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一其它還有雙雜交探針、蝎形探針、LUXPrimers等模式。第二十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一引物設(shè)計原則引物最適長度為15～20bp.G+C含量為40～60%。引物的Tm值應(yīng)相似，差異不超過1～2℃.產(chǎn)物長度在80～150bp.不能形成引物二聚體。第二十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一Taqman探針設(shè)計原則

長度30-45bp,Tm比引物至少高5℃。盡量靠近上游引物。5’端不要有G，G會有淬滅作用，影響定量。3’端必須封閉。第二十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一實時熒光定量PCR的應(yīng)用目前實時熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個方面：1.DNA或RNA的絕對定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。第二十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一2.基因表達(dá)差異分