血液標(biāo)本采集和血涂片制備

血液標(biāo)本采集和血涂片制備第一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一第一章血液標(biāo)本采集

和血涂片制備重點(diǎn)：血標(biāo)本采集方法和血涂片制備技術(shù)難點(diǎn)：各種抗凝劑的優(yōu)缺點(diǎn)和使用選擇第二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

第一節(jié)血液標(biāo)本采集和抗凝劑選擇血標(biāo)本：全血：血細(xì)胞+血漿;臨床血液學(xué)檢查，血細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類和形態(tài)學(xué)檢查血漿：全血除去血細(xì)胞；血漿病理性和生理性化學(xué)成分的測定，內(nèi)分泌激素、凝血因子（鈣除外）、血栓和止血檢查血清：離體后血液自然凝固后析出的液體成分（除纖維蛋白原等凝血因子）；臨床化學(xué)和臨床免疫學(xué)檢查第三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

一、采血方法

靜脈采血法部位：主要是肘靜脈。還可以在：手背、內(nèi)踝、股靜脈，幼兒可采用頸外靜脈采血采血器材：一次性注射器采血步驟和注意事項(xiàng)：止血帶壓迫時(shí)間不能過長；注射器和容器必須干燥第四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一采血步驟選擇適宜靜脈，在臂扎上壓脈帶，于穿刺處皮膚做環(huán)形消毒讓病人握拳，使靜脈顯露。左手拇指固定穿刺部位下端，右手持注射器，使針筒刻度向上，先以約30o角度沿靜脈正面進(jìn)針，穿過皮膚刺人靜脈腔。見回血后，右手固定注射器，用左手緩緩抽出注射器針?biāo)ǎ了柩亢?，解除壓脈帶，放松拳頭，以消毒棉簽壓住穿刺孔，拔出針頭第五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一第六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一部位：中指或無名指尖內(nèi)側(cè)、耳垂；半歲以下拇指或足部，特殊人員視情況而定所用器材：采血針、吸管采血步驟及注意事項(xiàng)：避免交叉應(yīng)嚴(yán)格實(shí)行一人一針制；穿刺的深度的適當(dāng)，切忌用力擠壓，以免混入組織液，影響檢驗(yàn)結(jié)果。皮膚采血法（毛細(xì)血管采血法）第七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一部位：主要是肘靜脈。采血器材：真空采血裝置，頭套式、頭皮靜脈式兩種真空采血法（負(fù)壓采血法）第八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一采血步驟及注意事項(xiàng)：利用真空貯血管中的負(fù)壓原理，自動(dòng)定量的將血液引入貯血管內(nèi)；瓶塞穿刺針外具有止血護(hù)套，使用時(shí)請(qǐng)勿將其取下；采集血樣后，針對(duì)有輸液要求的病患者，醫(yī)務(wù)人員可將軟座與輸液器相接進(jìn)行輸液，減少病人的靜脈穿刺次數(shù)；一次性使用，用后銷毀。

既有利于標(biāo)本的收集運(yùn)送和保存，又便于防止血液交叉感染，已開始在國內(nèi)推廣使用。第九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一第十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一方法學(xué)評(píng)價(jià)

靜脈采血皮膚采血真空采血缺點(diǎn)不同抗凝劑的使用，限制了重復(fù)實(shí)驗(yàn)；價(jià)格高改變血液性質(zhì)，影易于溶血、凝血響有形成分的形態(tài);和可混入組織液環(huán)境污染優(yōu)點(diǎn)標(biāo)本代表性大，無價(jià)廉、快速、操作減少溶血，操組織液影響，適于簡便，標(biāo)本可直接作規(guī)范，防止臨床研究，可重復(fù)測定交叉感染，保實(shí)驗(yàn)和追加其他實(shí)護(hù)環(huán)境驗(yàn)第十一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

質(zhì)量控制患者：活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、藥物、年齡、性別標(biāo)本采集等采血：操作規(guī)范溶血：采集、轉(zhuǎn)移、保管、分離血標(biāo)本處理：立即送檢實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：藥物、飲食的影響；密切結(jié)合臨床第十二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

二、抗凝劑選擇抗凝：用物理或化學(xué)方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固

抗凝劑：能夠阻止血液凝固的物質(zhì)，稱抗凝劑第十三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

乙二胺四乙酸（EDTA）鹽抗凝原理：螯合鈣離子使用方法：15g/L濃度EDTA和血液1：10適用范圍：對(duì)血細(xì)胞形態(tài)、血小板計(jì)數(shù)影響?。挥绊懷“寰奂桶准?xì)胞吞噬功能；不適合做凝血象檢驗(yàn)及血小板功能試驗(yàn)

第十四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

草酸鹽（sodiumoxalate）

草酸鈉、草酸鉀、草酸銨原理：草酸鹽可與血中鈣離子生成草酸鈣沉淀，從而阻止血液凝固使用方法：草酸鈉0.1mol/L和血液1：9適用范圍：凝血象檢查第十五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

肝素（heparin）

原理：低濃度時(shí)抑制因子Ⅸa、Ⅷ和PF3之間的作用，加強(qiáng)抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）滅活絲氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成,還能抑制凝血酶的自我催化及抑制因子Ⅹ的作用；高濃度時(shí)阻斷凝血酶和纖維蛋白的反應(yīng)適用方法：

1g/L濃度的肝素鈉與血液1：10優(yōu)點(diǎn)：抗凝能力強(qiáng)、不影響血細(xì)胞體積、不易溶血、能耐高溫適用范圍：紅細(xì)胞檢驗(yàn)（紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白測定、紅細(xì)胞比積）和多種生化分析第十六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

枸櫞酸鹽（枸櫞酸三鈉）

原理：螯合鈣離子使用方法：配成109mmol/L的濃度和血液1：9106mmol/L的濃度和血液1：4適用范圍：止血學(xué)檢驗(yàn)、血沉、輸血保養(yǎng)液（毒性小）第十七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

物理方法抗凝脫纖維蛋白：將血液注入有玻璃珠的器皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)，纖維蛋白纏繞凝固于玻璃球，從而防止血成凝塊。適

用于免疫學(xué)檢驗(yàn)和紅斑性狼瘡細(xì)胞檢查。第十八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

血液的貯存

1.血液標(biāo)本檢驗(yàn)前的預(yù)處理分離血清或血漿預(yù)溫血漿或血清分離細(xì)胞

第十九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一冷藏保存:血漿在4℃保存24h后，某些凝血因子活性減少95%。供血細(xì)胞分析儀使用的EDTA-k2抗凝全血應(yīng)保存于室溫，但不宜超過8h，如果在4℃保存可使血小板計(jì)數(shù)結(jié)果減低。

冷凍保存:要長時(shí)間保存血液中有活性的成分如凝血因子、酶類等，可采取分離血清或血漿后快速深低溫冷凍的方式，冷凍的標(biāo)本一般應(yīng)避免反復(fù)凍融。

根據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目要求有些血液標(biāo)本要求避光、隔絕空氣等

2.血液標(biāo)本的保存第二十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一3.血液標(biāo)本檢驗(yàn)后的處理

血源性污染是醫(yī)源性污染的主要來源之一，檢驗(yàn)后的血液標(biāo)本處理不當(dāng)，其危害極大。對(duì)于檢驗(yàn)完畢的血液標(biāo)本首先要進(jìn)行高壓滅菌，然后再進(jìn)行無害化處理。帶有血液的檢驗(yàn)器材要用消毒液浸泡。采血用的注射器要進(jìn)行毀形、消毒并進(jìn)行無害化處理。第二十一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)血液涂片制備和細(xì)胞染色

血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，特別是對(duì)于各種血液病的診斷具有重要的價(jià)值，近年來血細(xì)胞分析儀的廣泛應(yīng)用，血涂片的觀察也可作為判斷儀器結(jié)果的簡易方法。

血涂片的用途：血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)、網(wǎng)織紅、異常寄生蟲檢驗(yàn)。

第二十二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

一、血液涂片制備將推玻片向1的方向稍抽回，當(dāng)血液充滿推玻片的寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動(dòng)。第二十三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一圖1-3血涂片制備示意圖（上：側(cè)面觀，下：正面觀）

第二十四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一[血涂片質(zhì)量評(píng)價(jià)]均勻、厚薄、頭體尾、邊緣、兩側(cè)注意：血滴大，速度快、角度大----血膜厚一張良好血涂片的標(biāo)準(zhǔn)是：厚薄適宜、頭體尾分明、細(xì)胞分布均勻、邊緣整齊、兩側(cè)及兩頭留有空隙。第二十五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一第二十六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一第二十七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

二、血液細(xì)胞染色

染料：生物學(xué)染色劑，將生物組織細(xì)胞和病原體染色，在顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)。發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)使生物學(xué)染色劑產(chǎn)生顏色和被染組織親合。第二十八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一堿性染料：為陽離子染料，能接受質(zhì)子，染細(xì)胞核的染料。如亞甲藍(lán)、天青。酸性染料：為陰離子染料，能釋放質(zhì)子。主要有熒烷-氧雜蒽染料和偶氮染料兩類，能結(jié)合細(xì)胞的堿性成分并染色，如血紅蛋白、嗜酸性顆粒成分等。復(fù)合染料：同時(shí)具有陰、陽離子型的染料如瑞氏染料第二十九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

細(xì)胞染色原理：

一般以它們的物理現(xiàn)象和/或化學(xué)現(xiàn)象為依據(jù)物理作用：毛細(xì)管現(xiàn)象、滲透、吸收、吸附作用等化學(xué)作用：a.染料的化學(xué)成分：助色基團(tuán)的存在，堿性染料在溶媒中為陽離子型，易與組織和細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的酸性物質(zhì)結(jié)合；而酸性染料在溶媒中為陰離子型，與帶正電荷的堿性物質(zhì)結(jié)合。第三十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一b.蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)中的氨基酸含有不同數(shù)量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同時(shí)還有其它活性基團(tuán)。在游離狀態(tài)時(shí)，-NH2獲得一個(gè)H+變成帶正電的-NH3+，而-COOH失去一個(gè)H+變成帶負(fù)電的-COO-。分別與不同染料結(jié)合。

c.周圍環(huán)境的酸堿度：如環(huán)境pH＜pI（pI為等電點(diǎn)），則蛋白質(zhì)帶正電，結(jié)合酸性染料；反之，pH＞pI，則結(jié)合堿性染料。第三十一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

細(xì)胞染色法的類型

普通染色法：經(jīng)物理和/或化學(xué)作用的吸附、結(jié)合熒光染色法：熒光染料，熒光顯微鏡細(xì)胞活體染色法：活體染料如燦爛甲酚藍(lán)等細(xì)胞化學(xué)染色法：用化學(xué)反應(yīng)顯示細(xì)胞內(nèi)某種成分細(xì)胞免疫化學(xué)染色法（應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)）

第三十二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

瑞氏染色法[瑞氏染料]

由酸性染料伊紅（eosin,E-）和堿性染料亞甲藍(lán)(methyleneblue,M+)組成有復(fù)合染料。亞甲藍(lán)為四甲基硫堇染料，有對(duì)醌型和鄰醌型兩種結(jié)構(gòu)。通常為氯鹽，即氯化美藍(lán)。美藍(lán)容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級(jí)染料。市售美藍(lán)中部分已被氧化為天青。伊紅通常為鈉鹽。將伊紅和美藍(lán)溶解在甲醇中，即瑞氏染料。第三十三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

[染色原理]

細(xì)胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細(xì)胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對(duì)各種染料的親和力也不一樣。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩，例如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。

M+CL+Na+E→ME+NaCL

美藍(lán)伊紅伊紅化美藍(lán)（瑞氏染料）

第三十四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一

圖1-4瑞氏染色原理示意圖

第三十五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一[PH對(duì)細(xì)胞染色有影響]

細(xì)胞各種成分均為蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多，易與美藍(lán)或天青結(jié)合，染色偏藍(lán)。因此細(xì)胞染色對(duì)氫離子濃度十分敏感，染色用玻片必須清潔，無酸堿污染。配制瑞氏染液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導(dǎo)致各種細(xì)胞染色反應(yīng)異常，以致識(shí)別困難，甚至造成錯(cuò)誤。第三十六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一[試劑]

Wright染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml甲醇：有強(qiáng)大的脫水力，可將細(xì)胞固定為一定形態(tài)，并使蛋白質(zhì)沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀等結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞與染料接觸表面積，提高對(duì)染料的吸附作用，增強(qiáng)染色效果。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.4-6.8）：磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g,蒸餾水加到1000ml。配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。第三十七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一[染色方法]1.用蠟筆在血膜兩頭劃線，平放于染色架上。2.加瑞氏染液覆蓋血膜，固定1min。3.滴加等量或稍多的緩沖液，混勻，染色5-10分鐘。4.用清水沖洗，待干后鏡檢。第三十八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一【質(zhì)量控制】血膜要干透后才能染色，否則染色時(shí)易脫落.染色時(shí)間與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)，一般染液淡、染色時(shí)間長些效果好。染液不能過少，以防蒸發(fā)沉淀。沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖，防止染料沉著。沖洗時(shí)間也不能長。染色過淡，可復(fù)染。染色過深可用水沖洗或浸泡，還可用甲醇脫色.第三十九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一第四十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一【染色結(jié)果評(píng)價(jià)】

正常情況：血膜外觀呈淡琥珀色。在顯微鏡下紅細(xì)胞染成粉紅色，在厚薄均勻處略有碟狀感。白細(xì)胞胞質(zhì)中的顆粒能顯示出各種細(xì)胞的特有色彩，細(xì)胞核染紫紅色，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。染色環(huán)境偏酸：則紅細(xì)胞和嗜酸性顆粒偏紅，白細(xì)胞核呈淺藍(lán)色或不著色，染色過酸pH<3.5時(shí)，則呈現(xiàn)一片紅色，白細(xì)胞中除嗜酸性顆粒外均不著色。染色環(huán)境偏堿：則所有細(xì)胞呈灰藍(lán)色，微偏堿者紅細(xì)胞暗紅、白細(xì)胞顆粒深暗。嗜酸性顆?？扇境砂岛稚踔梁谧仙蛩{(lán)色。中性顆粒也偏粗染成紫黑色，血膜過厚的地方呈綠色。第四十一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期一姬姆薩染色法[原理]

吉姆薩染液由天青，伊紅組成。染色原理和結(jié)果與瑞特染色法基本相同。但本法對(duì)細(xì)胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更不清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒則著色較差