同源重組的應(yīng)用專題講義

同源重組的應(yīng)用09生工夏章傳同源重組概述同源重組（homologousrecombination）◆即一般重組，是染色體之間進行遺傳信息的方式之一，幾乎所有生物都發(fā)生同源重組?！羧缯婧松餃p數(shù)分裂中染色體的交換，細菌結(jié)合、轉(zhuǎn)化、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的遺傳重組都屬于同源重組。◆同源重組要求兩個DNA分子的序列同源，同源區(qū)越長越有利于重組；同源區(qū)太短，則難于發(fā)生重組。因為它依賴于大范圍DNA同源順序的聯(lián)會，負責(zé)DNA配對和重組的蛋白質(zhì)因子無堿基序列特異性，只要兩條DNA序列相同或相近，重組便可以在聯(lián)會部分的任何位置發(fā)生。當(dāng)然，也存在重組熱點，即某些序列發(fā)生重組的概率高于其它序列?！敉粗亟M也是對損傷DNA修復(fù)的一種重要途徑，即重組修復(fù)。同源重組的應(yīng)用◆同源重組的應(yīng)用價值主要是用于基因敲除（knock-out）和基因敲進(knock-in)①研究基因功能②轉(zhuǎn)基因動物的制備③用于藥物篩選的動物模型④轉(zhuǎn)基因動物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物基因敲進和敲進◆基因敲除（knockoutofgene）:是基因打靶技術(shù)的一種，指外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細胞基因組中的相同或相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中?！艋蚯眠M（knockinofgene）：利用基因同源重組，將外源有功能的基因轉(zhuǎn)入基因組中不存在或已失活的細胞中與其基因組中同源序列進行同源重組，在細胞內(nèi)獲得表達，這一技術(shù)稱為基因敲進?！艋蚯贸颓眠M的原理都是同源重組，即同源雙交換，用克隆的外源基因取代基因組中野生型等位基因?！魞烧卟煌c在于，基因敲除導(dǎo)入的外源基因是失活的、無功能的基因，基因敲進導(dǎo)入的是有活性和功能的基因。因而兩者的具體用途有所不同?！艋蚯贸颓眠M都可用于基因功能的研究，基因敲進則也可用于突變基因的修復(fù)?！艋蚯贸亲?0年代末以來發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用，比較成功的有基因的插入突變和iRNA，它們同樣可以達到基因敲除的目的。小鼠基因敲除實驗◆基因敲出實際操作簡要步驟：1、克隆目的基因及其兩側(cè)的DNA序列。2、通過插入抗性基因或者DNA缺失，對克隆的目的基因進行體外遺傳改造，使克隆的目的基因失活。3、將經(jīng)體外改造失活的目的基因引入受體細胞，使之與野生型基因進行同源重組?！暨@兩種基因取代，都是是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點，用同源序列的目的基因整個置換內(nèi)源基因。目前用于基因敲除的技術(shù)有Cre/LoxP系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等?！舸朔僧a(chǎn)生精確的基因突變，也可正確糾正機體的基因突變。①研究基因功能◆細菌和一些低等真核生物在進行基因取代時，克隆的基因能精確地插入到染色體的同源部位，所以他們是研究基因取代的理想材料?！艋蛉〈ǔ晒τ糜诩毦徒湍妇幕蚍治鐾?，還成功地應(yīng)用到老鼠和雞的基因功能分析中。②轉(zhuǎn)基因動物的制備

◆轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用領(lǐng)域1、生物反應(yīng)器：藥用或食品蛋白的大量生產(chǎn)，即轉(zhuǎn)基因動物制藥；2、疾病的動物模型：用于研究、藥物篩選、藥物治療、毒物測試；3、通過增加或刪除基因來研究基因的功能、調(diào)控和發(fā)育，如癌基因、免疫系統(tǒng)等；4、異種器官的移植；5、家畜品種的改良?！艮D(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用領(lǐng)域③用于藥物篩選的動物模型

◆誘發(fā)性或?qū)嶒炐詣游锬Ｐ停‥xperimentalAnimalModels）用同源重組的方法，將致病因素作用于動物，造成動物組織、器官或全身一定的損害，出現(xiàn)某些類似人類疾病時的功能、代謝或毒使動物患相應(yīng)的傳染病，又如用化學(xué)致癌劑、放射線、致癌病毒誘發(fā)動物的腫瘤等。誘發(fā)性疾病動物模型具有能在短時間內(nèi)復(fù)制出大量疾病模型，并能嚴(yán)格控制各種條件使復(fù)制出的疾病模型適合研究目的需要等特點，因而為近代醫(yī)學(xué)研究所常用，特別是藥物篩選研究工作所首選。但誘發(fā)模型和自然產(chǎn)生的疾病模型在某些方面畢竟存在一定差異。因此在設(shè)計誘發(fā)性動物模型要盡量克服其不足，發(fā)揮其特點。③用于藥物篩選的動物模型◆用于藥物篩選的動物模型例如：帕金森病動物模型，用于藥物篩選。建立抗丙型肝炎病毒藥物篩選的動物模型。精神分裂癥動物模型及其藥物篩選。高尿酸血癥動物模型的建立及抗痛風(fēng)中藥的篩選?！粢螅海ㄒ唬┫嗨菩裕ǘ┲貜?fù)性（三）可靠性（四）適用性和可控性（五）易行性和經(jīng)濟性。③用于藥物篩選的動物模型◆動物模型的意義和優(yōu)越性：（一）避免了在人身上進行實驗所帶來的風(fēng)險。（二）臨床上平時不易見到的疾病可用動物隨時復(fù)制出來。（三）可以克服人類某些疾病潛伏期長，病程長和發(fā)病率低的缺點。（四）可以嚴(yán)格控制實驗條件，增強實驗材料的可比性。（五）可以簡化實驗操作和樣品收集。（六）有助于更全面地認識疾病的本質(zhì)。④轉(zhuǎn)基因動物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物。◆轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物不僅開辟了制藥業(yè)的新紀(jì)元，而且它也是轉(zhuǎn)基因動物研究最活躍的領(lǐng)域?！艋蚬こ趟幬?個階段:1、細菌基因工程，即把目的基因通過適當(dāng)?shù)母慕▽?dǎo)入大腸桿菌中，再通過細菌等原核微生物表達的目的蛋白作為藥物;2、是細胞基因工程藥物，這是把人或哺乳動物的基因直接導(dǎo)入哺乳動物的細胞中，生產(chǎn)有生物活性的產(chǎn)品;3、其三是利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)低成本、高活性的藥物。一、轉(zhuǎn)基因動物◆轉(zhuǎn)基因動物是把外源基因?qū)雱游锏纳臣毎?，并整合該細胞后發(fā)育成為個體整合的外源基因，整合的外源基因又能影響其后代遺傳的動物。藥用蛋白基因→表達細胞株→細胞核轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥用蛋白的基本過程受體動物供體動物→受精卵→無核受精卵→組裝的核細胞→多細胞胚胎→假孕動物→動物幼崽→雌性轉(zhuǎn)基因動物→乳汁→藥用蛋白◆轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物的優(yōu)點：1、品種多、產(chǎn)量高、質(zhì)量好。2、設(shè)備簡單、不耗能、無環(huán)鏡污染。3、生產(chǎn)周期短。4、生產(chǎn)成本低?！?006年報道：我國目前已有乳鐵蛋白、白蛋白、凝血因子等進入臨床試驗階段，首個轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的藥物有望在5年內(nèi)上市?！熬烤故悄姆N轉(zhuǎn)基因藥物率先上市，還得由臨床療效說了算?！薄艮D(zhuǎn)基因動物就是指通過實驗方法，人工地把外源基因?qū)雱游锏氖芫?，使外源基因與動物本身的基因組整合在一起，因而外源基因能隨細胞的分裂而增殖，并能穩(wěn)定地遺傳給下一代。在此基礎(chǔ)上，人們只要將事先提取到的藥用蛋白注射到牛、羊等身上，當(dāng)它們的下一代出生，人們便可以從其體內(nèi)提取更多的藥用蛋白。簡單地說，就像在動物的體內(nèi)批量生產(chǎn)藥物一樣?！舸饲埃覈茖W(xué)家曾在上海成功研制出5頭有目的基因整合的轉(zhuǎn)基因羊，其中一頭羊產(chǎn)下小羊進入泌乳期后，其乳汁中有活性的人凝血因子IX顯示，這種凝血因子恰是治療血友病乙的珍貴藥物。上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所成功培育出含有人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因試管牛。目前，科學(xué)家們正在進一步研究如何提高成功率。Theend,thanks!《化妝品術(shù)語》起草情況匯報中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所一、標(biāo)準(zhǔn)的立項和下達時間2006年衛(wèi)生部政法司要求各標(biāo)委會都要建立自己的術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)。1ONE二、標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)費標(biāo)準(zhǔn)研制經(jīng)費：3.8萬三、標(biāo)準(zhǔn)的立項意義術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)有利于行業(yè)間技術(shù)交流、提高標(biāo)準(zhǔn)一致性、消除貿(mào)易誤差，作為標(biāo)準(zhǔn)體系中的基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)在各個領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)體系中均起著重要的作用。隨著我國化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)逐步加快，所涉及的術(shù)語和定義的數(shù)量也在迅速增長，在此情形下，化妝品術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)的制定就顯得尤為重要。四、標(biāo)準(zhǔn)的制訂原則1.合法性遵守《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例》、《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例實施細則》中關(guān)于化妝品的定義。2.協(xié)調(diào)性直接引用或修改采用的方式，與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的術(shù)語和定義相協(xié)調(diào)。3.科學(xué)性對于沒有國標(biāo)或定義不統(tǒng)一的術(shù)語，在定義時體現(xiàn)科學(xué)性的原則。4.實用性在標(biāo)準(zhǔn)體系中出現(xiàn)頻率較高，與行業(yè)聯(lián)系較緊密的術(shù)語優(yōu)先選用。五、標(biāo)準(zhǔn)的起草經(jīng)過

第一階段：資料搜集

搜集國內(nèi)外相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、文獻并對國外文獻如美國21CFR進行翻譯。第二階段：2007年末形成初稿

初稿內(nèi)容包括一般術(shù)語、衛(wèi)生化學(xué)術(shù)語、毒理學(xué)術(shù)語、微生物術(shù)語、產(chǎn)品術(shù)語、人體安全和功效評價術(shù)語，常用英文成份術(shù)語等７部分。第三階段：專家統(tǒng)稿1.2007年12月第一次專家統(tǒng)稿會（修訂情況：1.在結(jié)構(gòu)上增加原料功能術(shù)語、相關(guān)國際組織和科研機構(gòu)等內(nèi)容；2.在內(nèi)容上增加一般術(shù)語、產(chǎn)品術(shù)語的種類，將化妝品行業(yè)的新產(chǎn)品類別納入本標(biāo)準(zhǔn)；3.對于毒理學(xué)、衛(wèi)生化學(xué)、微生物學(xué)術(shù)語進行修改；4.刪除與化妝品聯(lián)系不緊密、無存在必要的常用英文成分術(shù)語。2.2009年1月第二次專家統(tǒng)稿會會議意見：1.修改能引用國家標(biāo)準(zhǔn)的盡量引用國家標(biāo)準(zhǔn)；對存在歧義的個別用詞進行修改。2.刪除由于本標(biāo)準(zhǔn)中的“產(chǎn)品術(shù)語”一章和香化協(xié)會所制定的某個標(biāo)準(zhǔn)存在重復(fù)，因此刪除“產(chǎn)品術(shù)語”一章的內(nèi)容；對“原料功能術(shù)語”的內(nèi)容進行梳理，刪除了20余條內(nèi)容。3.增加專家建議增加“化妝品限用物質(zhì)”等若干項術(shù)語。第四階段：征求意見2009年2月面向全國公開征求意見。第五階段：征求意見的處理與形成送審稿。在征求意見的處理階段再次征求了相關(guān)專家的意見。六、標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容依據(jù)1.《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例》、《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例實施細則》;2.《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》;3.美國21CFR；4.相關(guān)領(lǐng)域國家標(biāo)準(zhǔn)如：GB5296.3-2008消費品使用說明化妝品通用標(biāo)簽，GB/T14666-2003分析化學(xué)術(shù)語等；5.國內(nèi)外化妝品的相關(guān)文獻，如《化妝品監(jiān)督管理及安全性評價》等。七、標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和主要內(nèi)容（一）結(jié)構(gòu)：1.范圍2.一般術(shù)語3.毒理學(xué)試驗方法術(shù)語4.衛(wèi)生化學(xué)檢驗方法術(shù)語5.微生物檢驗方法術(shù)語6.人體安全性和功效性評價術(shù)語7.常用原料術(shù)語8.縮寫9.中英文索引（二）主要內(nèi)容：1).一般術(shù)語39條涉及化妝品的基本定義、化妝品生產(chǎn)和監(jiān)督管理中出現(xiàn)頻率較高的術(shù)語。2).毒理學(xué)試驗方法術(shù)語40條收錄了《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中涉及的術(shù)語，以及在毒理學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)頻率較高、與化妝品毒理學(xué)試驗方法聯(lián)系較密切的術(shù)語。3).衛(wèi)生化學(xué)檢驗方法術(shù)語22條收錄了化妝品的衛(wèi)生化學(xué)檢驗方法中較常用的術(shù)語。

4).微生物檢驗方法術(shù)語6條收錄了《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中所涉及的術(shù)語。5).人體安全性和功效性評價術(shù)語38條收錄了人體安全性和功效性評價的常用術(shù)語。6).常用原料術(shù)語55條收錄了常用原料術(shù)語，與《化妝品管理及安全性和功效性評價》保持一致，并根據(jù)企業(yè)、專家的意見進行了適當(dāng)修改。7).縮寫涉及國際機構(gòu)縮寫以及化妝品毒理學(xué)、化學(xué)、人體安全性和功效評價等領(lǐng)域?qū)I(yè)術(shù)語的縮寫34條。七、征求意見處理情況2009年2月20日，《化妝品術(shù)語》在全國公開范圍內(nèi)公開征求意見，截止到2009年3月末共收到來自企業(yè)、和社會各界的意見和建議共146條，分布情況如下：征求意見來源統(tǒng)計圖二一般術(shù)語三毒理學(xué)四化學(xué)五微生物六人體七原料八縮寫